CN115074399A

CN115074399A - 枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用

Info

Publication number: CN115074399A
Application number: CN202110271624.7A
Authority: CN
Inventors: 苏文炳; 林顺权; 张玲
Original assignee: South China Agricultural University; Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: South China Agricultural University; Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2022-09-20

Abstract

本发明公开了枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用。本发明首先揭示了一个新的氧化鲨烯环化酶基因EjOSC2在三萜酸合成过程中合成α/β‑香树精的功能；阐明了基因EjCYP716A1/2在α/β‑香树精C‑28位上催化氧化反应，使其转化为熊果酸和齐墩果酸的功能；并阐明了EjCYP716C1/2在熊果酸/齐墩果酸C‑2位上催化羟化反应，使其转化为科罗索酸/山楂酸的功能。这5个基因可以为调节药用植物枇杷叶片等组织中乌苏烷型和齐墩果烷型三萜酸积累水平提供基因资源，也为通过基因编辑或发酵工程等环境友好型生产工艺批量生产枇杷熊果酸、科罗索酸等天然活性三萜酸组分奠定基础。

Description

枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用。

背景技术

枇杷是重要的药食两用的常绿果树，除果实鲜美备受消费者喜爱外，干叶是部分重要天然产物的主要供体之一，不但在传统中药中被广泛利用，在现代生物医药开发中也同样颇受关注。三萜酸是枇杷叶中含量最为丰富的一类天然活性化合物，随着检测技术的不断发展，近二十年来科研人员已从枇杷叶中鉴定到了几十种三萜酸组分。生物活性评价及药理研究表明，熊果酸、科罗索酸等主要三萜酸在癌细胞抑制、杀菌消炎、降血糖等疾病治疗中发挥重要活性，在医药、食品等领域得到广泛重视与利用。对枇杷而言，其常用药源叶片采自果品生产树，各种组分的生产需要通过繁琐的工艺流程从大量叶片中分离单独三萜酸组分。传统制备工艺的使用影响枇杷鲜果生产，同时提取环节消耗大量人力物力，且容易带来工业污染。利用工程菌或植物等生物底盘表达代谢产物合成相关基因，既可以减少叶片采摘对果品生产的影响，又可以批量定向生产靶标组分，是一种环境友好型化合物合成途径。

鉴定三萜酸生物合成结构基因并建立表达系统是保障生物合成及定向生产靶标组分的关键。虽然已有研究人员报道了几个枇杷三萜酸合成相关基因的片段，但这些研究都未在空白对照下鉴定相关合成基因的功能。专利CN110938640A公开了一个合成α-香树精的氧化鲨烯环化酶基因EjAAS1，但未鉴定其他具有相似功能的同源基因；对于叶片中高含量的熊果酸和科罗索酸以及齐墩果酸和山楂酸等三萜酸的合成酶基因也还没有鉴定和挖掘。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用。

本发明的第一个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进枇杷生成三萜酸中的应用。

本发明的第二个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进α-香树精生成熊果酸、α-香树精生成科罗索酸、β-香树精生成齐墩果酸、和/或β-香树精生成山楂酸方面的应用。

本发明的第三个目的是提供一种提高乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸产量的方法。

本发明的第四个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进枇杷生成乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸中的应用。

本发明的第五个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进熊果酸生成科罗索酸，和/或促进齐墩果酸生成山楂酸中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种提高科罗索酸和/或山楂酸产量的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明从‘解放钟’枇杷中克隆到一个枇杷氧化鲨烯环化酶基因EjOSC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，包含2283bp的开放阅读框，编码760个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，在烟草叶片瞬时表达该基因可催化合成α-香树精和β-香树精。

同时克隆到2个枇杷α/β-香树精C-28位氧化酶基因EjCYP716A1和EjCYP716A2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，都包含1455bp的开放阅读框，编码484个氨基酸，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，这两个基因在烟草叶片中与基因EjOSC2瞬时共表达，都可催化形成熊果酸和齐墩果酸。

本发明还克隆到2个枇杷熊果酸/齐墩果酸C-2位羟化酶基因EjCYP716C1和EjCYP716C2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，它们都包含1443bp的开放阅读框，编码480个氨基酸，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，两个基因在烟草叶片中与基因EjOSC2-EjCYP716A1和/或EjOSC2-EjCYP716A2瞬时共表达，都可催化形成科罗索酸和山楂酸。

因此本发明要求保护以下内容：

核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进枇杷生成三萜酸中的应用。

所述三萜酸为乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸。

所述乌苏烷型三萜酸为熊果酸和/或科罗索酸，所述齐墩果烷型三萜酸为齐墩果酸和/或山楂酸。

核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进α-香树精生成熊果酸、α-香树精生成科罗索酸、β-香树精生成齐墩果酸、和/或β-香树精生成山楂酸方面的应用。

一种提高乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸产量的方法，过表达核苷酸序列如SEQID NO.1～2所示的一种或两种基因，和/或提高氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的一种或两种蛋白的表达量。

优选地，所述方法包括：制备含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的基因的重组工程菌，导入到能产生α-香树精和/或β-香树精的生物体中，得到重组生物体；培养所述重组生物体，过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的蛋白。

核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进枇杷生成乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸中的应用。

优选地，所述乌苏烷型三萜酸为科罗索酸，所述齐墩果烷型三萜酸为山楂酸。

核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进熊果酸生成科罗索酸，和/或促进齐墩果酸生成山楂酸中的应用。

一种提高科罗索酸和/或山楂酸产量的方法，过表达核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的一种或两种基因，和/或提高氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的一种或两种蛋白的表达量。

优选地，所述方法包括：制备含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示的基因的重组工程菌，导入到能产生熊果酸和/或齐墩果酸的生物体中，得到重组生物体；培养所述重组生物体，过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8所示的蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明建立了枇杷中主要三萜酸的积累模型，首次克隆了一个新的α-香树精合成酶基因EjOSC2，其在烟草叶片瞬时表达可合成α-香树精和少量β-香树精；同时克隆到2个枇杷α/β-香树精C-28位氧化酶基因EjCYP716A1和EjCYP716A2，烟草瞬时表达都可催化形成熊果酸和齐墩果酸；还克隆到2个枇杷熊果酸/齐墩果酸C-2位羟化酶基因EjCYP716C1和EjCYP716C2，烟草瞬时表达都可催化形成科罗索酸和山楂酸。这些基因的表达能够促进枇杷α-香树精、β-香树精、熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸和山楂酸的合成和体外生物合成α-香树精、β-香树精、熊果酸、齐墩果酸、科罗索酸和山楂酸及它们衍生而来的其他乌苏烷型和齐墩果烷型三萜酸。本发明为结构基因调控、代谢合成通路关键基因共表达等环境友好型技术批量获取枇杷重要天然活性化合物奠定基础，为三萜酸特异功能组分的修饰及产品开发提供理论支撑。

附图说明

图1为5个不同发育阶段的枇杷叶片中三萜酸组分的GC-MS色谱检测结果；A为GC-MS色谱色谱图，B为枇杷成熟叶片中三萜酸组分的比例。

图2为EjOSC2与其他植物的OSC蛋白聚类进化树。

图3为EjCYP716A1/2、EjCYP716C1/2与其他植物的CYP716蛋白聚类进化树。

图4为EjOSC2烟草瞬时表达产物GC-MS的检测色谱图和质谱图；A图中以pSAK277空载体做空白对照，以EjAAS1作为阳性对照，三萜酸标准品作外标，粪甾醇作内标；B图为α-香树精和β-香树精标准品和EjOSC2表达产物的质谱离子碎片比对图。

图5为EjCYP716A1和EjCYP716A2烟草瞬时表达产物的GC-MS检测色谱图和质谱图；A图中以pSAK277空载体做空白对照，EjOSC2表达为EjCYP716A1/2提供α-香树精和β-香树精底物，三萜酸标准品作为外标，粪甾醇作为内标；B图为熊果酸/齐墩果酸标准品和EjCYP716A1或EjCYP716A2表达产物的质谱离子碎片比对。

图6为EjCYP716C1和EjCYP716C2烟草瞬时表达产物的GC-MS检测色谱图和质谱图；A图中以pSAK277空载体做空白对照，EjOSC2表达可为EjCYP716A提供α-香树精和β-香树精底物，EjOSC2-EjCYP716A1或EjOSC2-EjCYP716A2表达为EjCYP716C提供熊果酸和齐墩果酸底物。三萜酸标准品作外标，粪甾醇作内标；B图为科罗索酸/山楂酸标准品和EjCYP716C1或EjCYP716C2表达产物的质谱离子碎片比对。

图7为以EjOSC2为支点合成枇杷主要三萜酸的代谢通路。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1枇杷叶片三萜酸组分的检测

一、实验方法

1、样本采集

采集‘解放钟’枇杷刚萌发的幼叶(时期1)到完全成熟的叶片(时期5)5个发育时期的叶片样品(每个样品3个生物学重复)，样品采自华南农业大学枇杷属植物种质资源圃。新鲜样品用液氮速冻后，在-80℃冰箱中保存备用。

2、三萜酸组分的提取和检测

以上枇杷叶片样品在Frerzone 12L冻干机(Labconco,美国)中于-80℃、0.1兆帕条件下过夜冻干。冻干后的材料剪碎后用植物研磨仪研磨成细粉。称取5.0mg样品干粉到加1.5mL离心管并加入500μL乙醇混合液(体积比为乙醇：水：KOH＝9：1：1)中；剧烈震荡，70℃水浴1个小时；在微量浓缩仪(Eppendorf，德国)中40℃旋转蒸发2小时蒸干乙醇；加入500μL乙酸乙酯，剧烈震荡1min；加入500μL水，继续剧烈震荡1min；16000g离心5min；取上层乙酸乙酯层；取50μL乙酸乙酯提取层在氮吹仪中用氮气干燥；加入30μL甲氧胺盐酸盐吡啶溶液溶解干燥物并在37℃水浴2小时；加入20μL N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺并于37℃孵育0.5小时对三萜酸提取物进行硅烷化衍生。

将衍生物转入进样瓶，用Agilent 7890A/5975C GC-MS联用仪(CA,美国)检测提取物中的三萜酸组分，测定的色谱条件为：HP-5M(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱，程序升温至40℃保持1min，以20℃/min升温至320℃，保持15min；不分流进样，进样量为1μL，氦气流速1mL/min；质谱条件为：接口温度250℃，离子源温度200℃，四级杆温度150℃，溶剂延迟15min，电压1500V，质量扫描范围60～800m/s。用β-香树精(CAS号：559-70-6)、α-香树精(CAS号：508-04-3)、齐墩果酸(CAS号：508-02-1)、熊果酸(CAS号：77-52-1)、科罗索酸(4547-24-4)、和山楂酸(CAS号：4373-41-5)等作为标准品(Sigma-Aldrich)，粪甾醇(CAS号：360-68-9)做内标，并都在相同条件下进行检测。

二、实验结果

结果如图1所示，GC-MS分析发现，5个时期的叶片中都能检测到三萜酸；第1时期(刚萌发的幼叶)的样品只能检测到少量α-香树精和β-香树精，随后熊果酸和齐墩果酸含量逐渐增加，并开始出现科罗索酸和山楂酸；临近成熟的叶片中科罗索酸与熊果酸等主要三萜酸的含量都达到最高峰(图1A)。进一步比较成熟叶片中三萜酸的比例发现，枇杷叶中积累的是乌苏烷型和齐墩果烷型2种类型的三萜酸；乌苏烷型占总三萜酸的76％左右，其中55％为科罗索酸，20％为熊果酸；在24％的齐墩果烷型三萜酸中，将近18％为山楂酸，约3.4％为齐墩果酸(图1B)。组分比例分析预示，占主要比重的科罗索酸、熊果酸、山楂酸可能是枇杷作为传统中药使用过程中发挥关键作用的核心组分，这些组分生物合成基因的挖掘有利于相关化合物的开发利用。

实施例2枇杷EjOSC2、EjCYP716A1/2、EjCYP716C1/2基因克隆与载体构建

一、实验方法

1、样本采集

按实施例1的方法采集、保存叶片样品。

2、RNA的提取

取-80℃保存的成熟叶片，液氮下研磨成粉末，取100mg粉末转到1.5mL离心管中，加入1.0mL RLT裂解液，按EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，中国)说明书提取RNA，具体如下：将加有样品的各管裂解液在振荡器上分别剧烈震荡20s，之后在55℃水浴裂解20min；将裂解物在13000rpm离心10min；取上清，转入新的离心管，并加入上清体积一半的无水乙醇，轻轻吸打混匀；将混合物加入到RA吸附柱中，静置30s后13000rpm离心2min；弃废液，重复前一步操作，将所有混合物经RA吸附柱过滤；弃废液，往吸附柱中加入700μl去蛋白液RW1，静置1min，13000rpm离心30s；弃废液，往吸附柱中加入500μl漂洗液RW，静置1min，13000rpm离心30s；弃废液，加入漂洗液RW重复一遍；弃废液，将吸附柱放回空管中13000rpm离心2min；取出吸附柱，放入一个新的RNase free离心管中，在吸附膜中间加入50μl RNase free water，室温静置2min，12000rpm离心1min；将洗脱的RNA吸回原来的吸附膜中间，室温再静置2min，12000rpm离心1min，获得总RNA。

3、反转录合成cDNA

用NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)检测RNA浓度，取RNase-free水将RNA稀释到100ng·μL^-1，按PrimeScript^TM RT reagent Kit withgDNA Eraser反转录系统(TaKaRa，日本)的说明书合成cDNA第一链，去DNA的反应体系包括2μL gDNA Eraser buffer、1μL gDNA Eraser和7μL RNA,混匀后在42℃去除gDNA；反应后往各体系中加入以下组分：1μLPrimeScript RT Enzyme Mix I+1μL RT Primer Mix+4μL 5×PrimeScript Buffer 2+4μL RNase Free dH₂O，混匀，在PCR仪上进行以下温度孵育反应：37℃，15min→85℃，10s→4℃；完成反转录反应。

4、三萜酸合成相关基因的扩增

调取枇杷基因组注释的OSC2、CYP716A1/2和CYP716C1/2基因编码区序列全长，用Primer Premier 5.0设计出引物，并在上下游引物两侧分别加上表达载体pSAK277上酶切位点(EcoRI和XhoI)两侧的同源序列接头，最终引物委托上海生物工程有限公司合成序列全长扩增引物对，扩增引物对分别如表1所示。

表1.扩增引物序列

用

HS DNA Polymerase(TaKaRa，日本)扩增目标基因。扩增体系为20μl，包括：10μl高保真DNA Polymerase Mix、1μl正向引物、1μl反向引物、1μl叶片cDNA、7μlddH₂O；扩增程序为95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，1min 30s～2min 30s；跑34个循环；72℃后延伸，10min；12℃，保存。

pSAK277载体线性化：5μl CutSmart Buffer(NEB，美国)，1μl EcoRI，1μlXhoI,1μg质粒，用水补至10μl。用枪头小心吸打、混匀，金属浴37℃酶切3h后，65℃水浴20min使内切酶失活。琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

用Hieff

Plus One Step Cloning Kit(上海翊圣生物，中国)将回收好的PCR产物连接到线性化pSAK277表达载体上，具体为：150ng纯化回收的PCR扩增产物，200ng线性化pSAK277载体，5μl Hieff

Enzyme Premix，用ddH₂O补至10μl。枪头轻轻吸打、混匀，反应体系于50℃反应半小时后先于冰上孵育5min，之后取5μl连接产物转入50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞；卡那霉素筛选阳性大肠杆菌克隆，挑均PCR检测阳性克隆后交由上海生物工程有限公司进行Sanger测序，测序正确后返还的质粒即为对应的表达载体。

二、实验结果

1、用所设计的特异引物对可以从叶片中分离到单一的EjOSC2序列，其编码区长度为2283bp(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，该序列编码760个氨基酸残基(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)；分离到特异的EjCYP716A1和EjCYP716A2序列，其编码区长度都是1455bp(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，都编码484个氨基酸残基(氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)；分离到特异的EjCYP716C1和EjCYP716C2序列，它们的编码区长度都是1443bp(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示)，都编码480个氨基酸残基(氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)。

2、用MEGA6软件分别构建OSC和CYP716同源基因进化树，结果如图2和图3所示，发现枇杷EjOSC2与苹果MdOSC1-MdOSC3及拟南芥AtBAS等聚在一起。EjOSC2及之前鉴定的EjAAS1与苹果MdOSC1/3聚在一个小枝，它与苹果MdOSC3亲缘关系最近，编码氨基酸的一致性为98.95％；与EjAAS1和苹果MdOSC1编码氨基酸的一致性分别为96.32％和96.84％，与拟南芥AtBAS的序列一致性则为63％(图2)。EjCYP716A1/2与EjCYP716C1/2都处于植物CYP716亚家族大分枝中，但各自分布在不同小枝。EjCYP716A1/2与MdCYP716A175离得最近，其中EjCYP716A1与MdCYP716A175编码氨基酸的一致性达到98.97％，EjCYP716A2与MdCYP716A175编码氨基酸的一致性为97.73％。EjCYP716C1/2与两个已知功能的CYP716C聚在一起形成另一个小分枝，但它们二者之间最为相似，氨基酸序列一致性达到93.33％；它们与紫薇LsCYP716C55编码氨基酸的序列一致性分别为75.67％和76.08％(图3)。

实施例3EjOSC2基因烟草瞬时表达及三萜酸产物检测

一、实验方法

载体的构建参考实施例2，将扩增到的EjOSC2全长插入到pSAK277表达载体，构建pSAK277-EjOSC2重组质粒。构建好的表达载体转入GV3101(pSoup)农杆菌中，同时转化未插入任何基因的pSAK277载体做空白对照，阳性克隆菌液加入甘油后保存在-80℃冰箱中备用。在温室中培养本氏烟草，待烟草5～6片真叶完全展开后，取甘油菌在含有卡那霉素和利福平抗生素的平板上划线活化。挑取菌落到600μL液体培养基中，在30℃下200rpm振荡6个小时，进行菌液PCR检测。取400μL阳性克隆新活化的菌液，接种到10mL含50μL Kan(50μM)和100mL Rif(50μM)的YEP液体培养基中，振荡过夜，至菌液A₆₀₀值达到0.8～1.0。用30mL MES(100mM)，30mL MgCl₂(100mM)，150μL乙酰丁香酮(Acetosyringone浓度为100mM)，加无菌水定容到150mL，混均制成MMA工作液。取5mL菌液，5000rpm离心10min；弃上清，加入2mL MMA工作液，悬浮菌体；5000rpm，离心10min；弃上清，重复悬浮-离心1次；加入2mL MMA工作液，悬浮菌体并转入15mL试管中；加MMA工作液将菌液稀释至A₆₀₀＝0.2左右；稀释好的菌液在避光、室温条件下孵育3小时左右。用去针头的1mL注射器将稀释后菌液注射入叶片背面，用pSAK277空载体菌液注射的叶片作对照。注射后将烟草移到弱光条件下培养1天，之后转入正常光照培养。

3天后采集少量叶片样品，采用实施例2的方法提取RNA反转录成cDNA，检测基因的表达情况。1周后，收集烟草叶片，用液氮速冻并转移到冷冻干燥机中，于-80℃、0.1兆帕条件下干燥至叶片衡重，参考实施例1的方法提取烟草叶片中的三萜酸组分，并在相同色谱条件下用GC-MS检测EjOSC2瞬时表达的三萜酸产物。

二、实验结果

结果如图5所示，EjOSC2瞬时表达后，本氏烟草叶片提取物中可检测到大量α-香树精和少量β-香树精，而空载体处理的对照叶片中未检测到相应产物(图4A)。用粪甾醇均一化后，比较α-香树精和β-香树精色谱峰面积发现，EjOSC2表达产物中α-香树精：β-香树精＝89：11。之后，比对EjOSC2表达产物和标准品(α-香树精/β-香树精)的总离子碎片(TIC)，发现EjOSC2表达后检测到的2种产物的离子碎片结构分别与标准品β-香树精、α-香树精一样(图4B)。GC-MS三萜酸产物保留时间和产物总离子碎片比对双重检测结果表明，EjOSC2是三萜酸前体的合成基因，其编码的蛋白可以催化生成α-香树精和β-香树精。

实施例4EjCYP716A1和EjCYP716A2基因烟草瞬时表达及三萜酸产物检测

一、实验方法

载体的构建参考实施例2，将扩增到的EjCYP716A1和EjCYP716A2全长分别插入到pSAK277表达载体，构建pSAK277-EjCYP716A1和pSAK277-EjCYP716A2重组质粒。构建好的表达载体转入GV3101(pSoup)农杆菌中，同时取实施例3的pSAK277-EjOSC2甘油菌进行活化，以便为目标基因编码氧化酶提供α/β-香树精催化底物。参考实施例3进行目的基因烟草瞬时表达。1周后，参考实施例3收集烟草叶片并检测三萜酸产物。

二、实验结果

EjOSC2瞬时表达可持续提供α-香树精和β-香树精底物，在EjOSC2基础上同时注射EjCYP716A1或EjCYP716A2则在19.6和20.0min左右检测到新产物齐墩果酸和熊果酸，结果如图5所示，EjOSC2-EjCYP716A1和EjOSC2-EjCYP716A2两个组合共表达产物中熊果酸：齐墩果酸的比例分别为81：19和88：12(图5A)。比对EjOSC2-EjCYP716A1和EjOSC2-EjCYP716A2表达产物和标准品(熊果酸和齐墩果酸)的总离子碎片(TIC)发现，EjOSC2-EjCYP716A1、EjOSC2-EjCYP716A2表达后检测到的2个产物的离子碎片结构与标准品熊果酸/齐墩果酸一样(图5B)。GC-MS三萜酸产物保留时间和总离子碎片比对双重检测结果表明，EjCYP716A1和EjCYP716A 2是三萜酸合成相关基因，其编码的蛋白可以催化生成熊果酸和齐墩果酸。

实施例5EjCYP716C1和EjCYP716C2基因烟草瞬时表达及三萜酸产物检测

一、实验方法

参考实施例2构建载体，将扩增到的EjCYP716C1和EjCYP716C2编码区序列全长分别连接到pSAK277表达载体上，构建pSAK277-EjCYP716C1和pSAK277-EjCYP716C2重组质粒。构建好的表达载体转入GV3101(pSoup)农杆菌中，同时取实施例3的pSAK277-EjOSC2和实施例4的pSAK277-EjCYP716A1/2甘油菌进行活化，以便为目标基因编码催化酶提供α/β香树精和熊果酸/齐墩果酸底物。参考实施例3进行目的基因瞬时表达。1周后，参考实施例3收集烟草叶片并检测三萜酸产物。

二、实验结果

EjOSC2瞬时表达可持续提供α-香树精和β-香树精底物，EjOSC2-EjCYP716A1或EjOSC2-EjCYP716A2表达可持续提供熊果酸和齐墩果酸底物。在EjOSC2-EjCYP716A1或EjOSC2-EjCYP716A2基础上注射EjCYP716C1或EjCYP716C2，则在21.2和21.5min检测到山楂酸与科罗索酸，结果如图6所示，EjOSC2-EjCYP716A1-EjCYP716C1、EjOSC2-EjCYP716A1-EjCYP716C2和EjOSC2-EjCYP716A2-EjCYP716C1、EjOSC2-EjCYP716A2-EjCYP716C2四个组合的表达产物中科罗索酸与山楂酸的比值在85：15～86：14之间(图6A)。比对EjOSC2-EjCYP716A1-EjCYP716C1/2、EjOSC2-EjCYP716A2-EjCYP716C1/2表达产物和标准品(科罗索酸和山楂酸)的总离子碎片(TIC)发现，EjOSC2-EjCYP716A1-EjCYP716C1/2、EjOSC2-EjCYP716A2-EjCYP716C1/2表达后检测到的2个产物的离子碎片结构与标准品酸一样(图6B)。GC-MS三萜酸产物保留时间和产物总离子碎片比对双重检测结果表明，EjCYP716C1/2是三萜酸合成相关基因，其编码的蛋白可催化生成科罗索酸和山楂酸。

通过实施例3、4、5的研究，本发明系统报道了枇杷主要三萜酸的合成通路：EjOSC2为氧化鲨烯环化酶基因，可催化合成α-香树精和β-香树精；EjCYP716A1和EjCYP716A2为α/β-香树精C-28位氧化酶基因，都可催化α-香树精形成熊果酸、催化β-香树精形成齐墩果酸；EjCYP716C1和EjCYP716C2为熊果酸/齐墩果酸C-2位羟化酶基因，都可催化熊果酸生成科罗索酸、催化齐墩果酸形成山楂酸，具体如图7所示。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<120> 枇杷三萜酸合成关键酶基因EjCYP716A1/2和EjCYP716C1/2及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl

<400> 1

atggagcact tctatctgac cctcctcttg gggtttgtct ccttcatcac tctttctctc 60

tccgtgctct tttaccggca cagatcgcag ttcgtcggca ccaacctgcc gcctggcaaa 120

gttggctacc cagtgatcgg cgagacctac cagttcctag ccacaggatg gaaaggtcac 180

ccggagaagt tcatcttcga ccgcatgacc aagtactcct ccgaagtgtt caagacctca 240

ctcatgggcg agaaggccgc catcttctgc ggtgcagcct gcaacaagtt cttgttctcc 300

aacgagaaca agctcgtcac tgcatggtgg cccagctccg tcaacaaggt cttcccttct 360

tctatggaga cttccgccaa ggaggaggcc aagaagatga gaaagatgct tcccaacttc 420

atgaagcccg aagctctcca gcgatacatc ggcatcatgg acaccgtcgc ccgacgccac 480

ttcgctgagg gctgggaaaa caagaaggaa gtggaagtct ttcccctcgc caagaactac 540

accttttggc ttgctgcacg gttgtttgtg agcctggagg actcggttga gatcgccaag 600

ctaggcgatc cgttcgcagt tttggcctcg ggaatcatat cgatgcctct ggatttcccg 660

gggactccgt tttacaaagc gatcaaggcg tccaacttca tcagggagga gctgacgaag 720

atcatcaagc agaggaagat agacttggcg gagggcaagg cgtcgccgac gcaagacata 780

ttgtcacaca tgttgttgct gtgcgacgag cacggaagtc acatgaagga acacgatatc 840

gcggataaga ttttggggct gctgatcggt ggccatgaca ccgctagcgc tacctgcact 900

tttattgtca agtatcttgc tgagcttcct cacatttatg acgaagtcta caaggagcaa 960

atggaggtcc taagcgcaaa agcaccaggg gagttgttga actgggatga cctacagaag 1020

atgaaatact catggaacgt agctcaggaa gttctcagat tggctccacc tcttcaagga 1080

gcattcaggg aagccttgtc cgactttgtc ttcaatggtt tcaccattcc aaaaggctgg 1140

aagttgtatt ggagtgcaaa ttcaacacat aagaacgcag cttacttccc ggaaccattc 1200

aaattcgacc ctacaagatt cgaaggaaat ggtccagcac catacacgtt tgtgcccttt 1260

ggaggaggtc ctaggatgtg ccccggaaaa gagtacgccc gattggaaat cctagtgttc 1320

atgcacaact tggtgaagag gttcaaatgg gaaaaagttc ttcccgacga gcagatcgta 1380

gttgacccac tgcccatgcc cgccaaggga ctccccgtcc gccttttctc tcaccctaag 1440

acagccacag cttaa 1455

<210> 2

<211> 1455

<212> DNA

<213> Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl

<400> 2

atggagcact tctatctgac cctcctctta gggtttgtct ccttcatcac tctttctctc 60

tccgtgctct tttaccggca cagatcgcag ttcgtcggca ccaacctgcc gcctggcaaa 120

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ccagagaagt tcatcttcga ccgcatgagc aagtactctt ccgaagtgtt caagacctcc 240

cttatgggcg agaaggccgc catcttctgc ggcgcagcct gcaacaagtt cttgttctcc 300

aacgagaaca agctcgtcac tgcatggtgg cccagctccg tcaacaaggt cttcccttct 360

tctatggaga cttccgccaa ggaggaggcc aagaagatga gaaagatgct tcccaacttc 420

atgaagcccg aagctctcca gcgatacatc ggcatcatgg acaccgtcgc ccgacgccac 480

ttcgccgacg gctgggaaaa caagaaggaa gttgaagttt tccccctcgc caagaactac 540

accttttggc ttgctgcacg gttgtttgtg agcctggacg actcggttga aatcgccaag 600

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ttgtcacaca tgttgttgct gtgcgacgag cacggaagtc acatgaagga acacgatatc 840

gccgataaga ttttggggct gctgattggt ggccatgaca ccgccagcgc tacctgcact 900

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atggaggtcc taagcgcaaa agccccaggg gagttgttga attgggatga cctgcagaag 1020

atgaaatact catggaacgt agctcaggaa gttctcagat tggctccacc tcttcaagga 1080

gctttcaggg aagccttgtc tgactttgtc ttcaatggtt tcaccattcc aaagggctgg 1140

aagttatatt ggagcgcaaa ctcaacgcac aagaacgcag cttacttccc ggaaccattc 1200

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accgccgcag cttaa 1455

<210> 3

<211> 484

<212> PRT

<213> Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl

<400> 3

Met Glu His Phe Tyr Leu Thr Leu Leu Leu Gly Phe Val Ser Phe Ile

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Ser Val Leu Phe Tyr Arg His Arg Ser Gln Phe Val

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Pro Pro Gly Lys Val Gly Tyr Pro Val Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Tyr Gln Phe Leu Ala Thr Gly Trp Lys Gly His Pro Glu Lys Phe

50 55 60

Ile Phe Asp Arg Met Thr Lys Tyr Ser Ser Glu Val Phe Lys Thr Ser

65 70 75 80

Leu Met Gly Glu Lys Ala Ala Ile Phe Cys Gly Ala Ala Cys Asn Lys

85 90 95

Phe Leu Phe Ser Asn Glu Asn Lys Leu Val Thr Ala Trp Trp Pro Ser

100 105 110

Ser Val Asn Lys Val Phe Pro Ser Ser Met Glu Thr Ser Ala Lys Glu

115 120 125

Glu Ala Lys Lys Met Arg Lys Met Leu Pro Asn Phe Met Lys Pro Glu

130 135 140

Ala Leu Gln Arg Tyr Ile Gly Ile Met Asp Thr Val Ala Arg Arg His

145 150 155 160

Phe Ala Glu Gly Trp Glu Asn Lys Lys Glu Val Glu Val Phe Pro Leu

165 170 175

Ala Lys Asn Tyr Thr Phe Trp Leu Ala Ala Arg Leu Phe Val Ser Leu

180 185 190

Glu Asp Ser Val Glu Ile Ala Lys Leu Gly Asp Pro Phe Ala Val Leu

195 200 205

Ala Ser Gly Ile Ile Ser Met Pro Leu Asp Phe Pro Gly Thr Pro Phe

210 215 220

Tyr Lys Ala Ile Lys Ala Ser Asn Phe Ile Arg Glu Glu Leu Thr Lys

225 230 235 240

Ile Ile Lys Gln Arg Lys Ile Asp Leu Ala Glu Gly Lys Ala Ser Pro

245 250 255

Thr Gln Asp Ile Leu Ser His Met Leu Leu Leu Cys Asp Glu His Gly

260 265 270

Ser His Met Lys Glu His Asp Ile Ala Asp Lys Ile Leu Gly Leu Leu

275 280 285

Ile Gly Gly His Asp Thr Ala Ser Ala Thr Cys Thr Phe Ile Val Lys

290 295 300

Tyr Leu Ala Glu Leu Pro His Ile Tyr Asp Glu Val Tyr Lys Glu Gln

305 310 315 320

Met Glu Val Leu Ser Ala Lys Ala Pro Gly Glu Leu Leu Asn Trp Asp

325 330 335

Asp Leu Gln Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Ala Gln Glu Val Leu

340 345 350

Arg Leu Ala Pro Pro Leu Gln Gly Ala Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asp

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Phe Val Phe Asn Gly Phe Thr Ile Pro Lys Gly Trp Lys Leu Tyr Trp

370 375 380

Ser Ala Asn Ser Thr His Lys Asn Ala Ala Tyr Phe Pro Glu Pro Phe

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Lys Phe Asp Pro Thr Arg Phe Glu Gly Asn Gly Pro Ala Pro Tyr Thr

405 410 415

Phe Val Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly Lys Glu Tyr

420 425 430

Ala Arg Leu Glu Ile Leu Val Phe Met His Asn Leu Val Lys Arg Phe

435 440 445

Lys Trp Glu Lys Val Leu Pro Asp Glu Gln Ile Val Val Asp Pro Leu

450 455 460

Pro Met Pro Ala Lys Gly Leu Pro Val Arg Leu Phe Ser His Pro Lys

465 470 475 480

Thr Ala Thr Ala

<210> 4

<211> 484

<212> PRT

<213> Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl

<400> 4

Met Glu His Phe Tyr Leu Thr Leu Leu Leu Gly Phe Val Ser Phe Ile

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Ser Val Leu Phe Tyr Arg His Arg Ser Gln Phe Val

20 25 30

Gly Thr Asn Leu Pro Pro Gly Lys Val Gly Tyr Pro Val Ile Gly Glu

35 40 45

Thr Tyr Gln Phe Leu Ala Thr Gly Trp Lys Gly His Pro Glu Lys Phe

50 55 60

Ile Phe Asp Arg Met Ser Lys Tyr Ser Ser Glu Val Phe Lys Thr Ser

65 70 75 80

Leu Met Gly Glu Lys Ala Ala Ile Phe Cys Gly Ala Ala Cys Asn Lys

85 90 95

Phe Leu Phe Ser Asn Glu Asn Lys Leu Val Thr Ala Trp Trp Pro Ser

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Ser Val Asn Lys Val Phe Pro Ser Ser Met Glu Thr Ser Ala Lys Glu

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Glu Ala Lys Lys Met Arg Lys Met Leu Pro Asn Phe Met Lys Pro Glu

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Ala Leu Gln Arg Tyr Ile Gly Ile Met Asp Thr Val Ala Arg Arg His

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Phe Ala Asp Gly Trp Glu Asn Lys Lys Glu Val Glu Val Phe Pro Leu

165 170 175

Ala Lys Asn Tyr Thr Phe Trp Leu Ala Ala Arg Leu Phe Val Ser Leu

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Asp Asp Ser Val Glu Ile Ala Lys Leu Gly Asp Pro Phe Ala Val Leu

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Ala Ser Gly Ile Ile Ser Met Pro Leu Asp Phe Pro Gly Thr Pro Phe

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Tyr Lys Ala Ile Lys Ala Ser Asn Phe Ile Arg Glu Glu Leu Thr Lys

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Ile Ile Lys Gln Arg Lys Ile Asp Leu Ala Glu Gly Lys Ala Ser Pro

245 250 255

Thr Gln Asp Ile Leu Ser His Met Leu Leu Leu Cys Asp Glu His Gly

260 265 270

Ser His Met Lys Glu His Asp Ile Ala Asp Lys Ile Leu Gly Leu Leu

275 280 285

Ile Gly Gly His Asp Thr Ala Ser Ala Thr Cys Thr Phe Ile Val Lys

290 295 300

Tyr Leu Ala Glu Leu Pro His Ile Tyr Asp Glu Val Tyr Lys Glu Gln

305 310 315 320

Met Glu Val Leu Ser Ala Lys Ala Pro Gly Glu Leu Leu Asn Trp Asp

325 330 335

Asp Leu Gln Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Ala Gln Glu Val Leu

340 345 350

Arg Leu Ala Pro Pro Leu Gln Gly Ala Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asp

355 360 365

Phe Val Phe Asn Gly Phe Thr Ile Pro Lys Gly Trp Lys Leu Tyr Trp

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Ser Ala Asn Ser Thr His Lys Asn Ala Ala Tyr Phe Pro Glu Pro Phe

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Lys Phe Asp Pro Ser Arg Phe Glu Gly Lys Gly Pro Ala Pro Tyr Thr

405 410 415

Phe Val Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly Lys Glu Tyr

420 425 430

Ala Arg Leu Glu Ile Leu Val Phe Met His Asn Leu Val Lys Arg Phe

435 440 445

Lys Trp Glu Lys Val Leu Pro Asn Glu Gln Ile Val Val Asp Pro Leu

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Pro Met Pro Ala Lys Gly Leu Pro Val Arg Leu Phe Pro His Pro Lys

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Thr Ala Ala Ala

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<211> 1443

<212> DNA

<213> Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl

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atggagaccc tttaccttat attttctgtg ggtgctgctt tcttagccct taccatcttt 60

gcactcaaag gcaaatcaga tgatggcaaa aaccttccac cagggagcat ggggtggcct 120

attgtgggtg aatcaatcga gttcttgttc gggaagccgg aaaattttgt gttcaatagg 180

atgaagaagt actctcctga catcttcaag acctatattc ttggagagaa aactgctgtg 240

atctgtggtc ctagtggaca taaatttctg ttctccaatg aacaaaagta cttcacagct 300

tttcgaccac attcgatgca aaagatgttt cgatcataca aggctgccgc ccccactgct 360

tctgctgctc ccgctgtggc acaaccatct cgcgatgaag aatcgaaagt tataagatcg 420

ccggggtttt tgaagccgga agcattggtg aggtacttgg ggaaaatgga ctctatcact 480

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atattgtcac atatgatcgt ggctagtgat ccatccggca aacacatgcc cgaggctgag 840

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actttcttca tgaaatatgt cggagaaagg ccagacattt atgccaaggt cctagctgag 960

cacaaggaga ttgcagactc gaagaagcca ggagactttt tggagtggga agacatcaac 1020

aaaatgaagt actcgtggaa tgtgttgtat gaagtgatga gattcacgcc gccacttcaa 1080

gggacattca gagaggcctt gacagatttt acctacgccg gttacaccat cccaaagggc 1140

tggaaggtat attggactgt gagtacaaca aacatgaacc cacagtactt ccccaacccc 1200

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actttcgttc acaatgtggt gaagaggttc gaatgggaag ttctgtttcc caaggagaag 1380

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tag 1443

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atgagaaggt actctcctga aatcttcaag acctatattc ttggagagaa aactgcagtt 240

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tctgctgttc ctgctgtggc acaaccttct cgtgatgaag aagcgaaagt aataagatct 420

ccagggtttc tgaagccgga agcattggtg aggtacttgg ggaaaatgga ctctatcact 480

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attgcaaggc ttgtgagcaa ttttgacgat gttaccgttg ggatgcattc gcttattatc 660

gacttcccag gaacaacatt ctacaaggca accaaagcgg ccgatgcgct gcgaaaggag 720

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atattgtcgc acatgattgt ggctagtgac ccatctggca aacacatgcc tgaggctgag 840

gttgcagata agatcatggg tttgctcaca gcaggatata gcactgtggc tactgccatg 900

actttcttca tgaaatatgt tggagagagg ccagacatct atgccaaggt tctagctgag 960

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aaaatgaagt actcatggaa tgtgttgtat gaagtgatga gattcactcc accacttcag 1080

gggacattca gagaggcttt gactgatttc acctatgctg gttacaccat cccaaagggc 1140

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Lys Tyr Val Gly Glu Arg Pro Asp Ile Tyr Ala Lys Val Leu Ala Glu

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245 250 255

Pro Leu His Asp Ile Leu Ser His Met Ile Val Ala Ser Asp Pro Ser

260 265 270

Gly Lys His Met Pro Glu Ala Glu Val Ala Asp Lys Ile Met Gly Leu

275 280 285

Leu Thr Ala Gly Tyr Ser Thr Val Ala Thr Ala Met Thr Phe Phe Met

290 295 300

Lys Tyr Val Gly Glu Arg Pro Asp Ile Tyr Ala Lys Val Leu Ala Glu

305 310 315 320

Gln Met Glu Ile Ala Ser Ala Lys Lys Pro Gly Asp Phe Leu Glu Trp

325 330 335

Glu Asp Ile Asn Lys Met Lys Tyr Ser Trp Asn Val Leu Tyr Glu Val

340 345 350

Met Arg Phe Thr Pro Pro Leu Gln Gly Thr Phe Arg Glu Ala Leu Thr

355 360 365

Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Tyr Thr Ile Pro Lys Gly Trp Lys Val Tyr

370 375 380

Trp Thr Val Ser Thr Thr Asn Met Asn Pro Glu Tyr Phe Pro Asn Pro

385 390 395 400

Glu Lys Phe Asp Pro Ser Arg Tyr Asp Asp Leu Asn Ala Phe Pro Ala

405 410 415

Phe Thr Phe Val Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Met Cys Pro Gly Lys

420 425 430

Glu Tyr Ala Arg Leu Ala Ile Leu Thr Phe Val His Asn Val Val Lys

435 440 445

Arg Phe Lys Trp Glu Val Leu Phe Pro Lys Glu Lys Ile Thr Gly Asp

450 455 460

Met Met Pro Thr Pro Glu Lys Gly Leu Pro Val Arg Leu Thr Arg His

465 470 475 480

<210> 9

<211> 2283

<212> DNA

<213> Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl

<400> 9

atgtggagga ttaagtttgg agaaggtgca aacgacccct tgttgttcag cacaaacaac 60

ttccacggaa ggcagacatg ggagttcgac ccagatgcag gtaccgagga ggaacgagca 120

gaagttgaag ctgctcgtga gcatttctac caaaatcgct tcaaggtcac gcctagcagt 180

gacctcctat ggcgttttca gattttaaga gaaaaaaact tcaaacaaga aattcctcca 240

gtaagaattg gcgagggtga ggagattaca tatgatcaag ccacagctgc attcaggagg 300

gctgctacct tctggaatgc cttgcaatca ccccatggac attggcctgc tgaaaatgct 360

ggcccaaact tttacttccc tcccttggtc atggctgcat acattccagg atatctcaat 420

gttattttct cagctgagca caagaaggaa atcttgcggt atacatacaa ccatcagaat 480

gaagatggtg ggtggggact gcacatatca ggccctagta tgatgtttac tacatgcctt 540

aactattgta tgatgcgtat tctcggagag ggccctgatg gtgggcgtga caatgcatgc 600

gcaagggcac gaaagtggat tcttgatcgt ggtggtgctt actattctgc atcatgggga 660

aaaacttgga tggcaattct tggtgtgtat gactgggaag gcagcaaccc aatgcccccg 720

gaattctgga ctgggtctac actgcttcct tttcatccat caaaaatgtt ctgctactgt 780

aggttgactt acctacctat gtcttacttt tacgccacaa gatttgttgg cccgatcact 840

cctctagttg aggaattgag acaggaaatt tactgtgaac cttacaacga aattaactgg 900

cctaaagtgc gccattggtg tgcaccggag gataactact atccccatgg tcgtgtacaa 960

cgttttatgt gggatggttt ttacaatatc gctgagcctc tcctaaaacg ctggccctta 1020

aagaagatca gagacaatgc cattcaattc acaattgacc aaattcatta cgaagatgag 1080

aacagtcgct acattacaat cggatgtgtg gaaaagccat taatgatgct tgcttgctgg 1140

gccgaggatc ctagtggaga agctttcaag aagcatattc ctagagttac tgattatatc 1200

tggctcggag aggatggaat caagatgcag agttttggaa gccagtcatg ggattgtgct 1260

cttgtgattc aagctttgct tgctggcaat ctaaatactg aaatggcacc tacccttaag 1320

caagcacacg aatttctcaa gatatctcag gtgagggtga atacttctgg tgactaccta 1380

gctcatttcc gtcacgtttc taagggcgca tggacattct ctgaccgcga ccatggatgg 1440

caagtgtcgg attgtactgc agaagcactg aggtgttgct gcattttcgc aaatatgtcc 1500

ccagaacttg ttggtgagcc aatggatgct gagtgtatgt atgatgccgt caatgtcatc 1560

ttgacccttc agagtccaaa tggtggtgta tcagcctggg agccaacagg agcaccaaaa 1620

tggttggagt ggctcaaccc tgtggagttt cttgaggacc tagtcattga gtacgagtac 1680

atcgaatgca cttcatcttc gatccaggcc ttaactttgt ttaggaagtt gtaccctggc 1740

catagaagga aggagatcaa caatttcatc acgagagcag cagactacat tgaagacata 1800

cagtaccctg atggctcatg gtatggaaac tggggaatct gctttgtgta tggtacatgg 1860

ttcgcaatca aagggctgga ggccgctggt aggacgtaca acaactgcga ggcagtgcgc 1920

aaaggtgttg actttttgct caaaacacaa agggcagatg gtggctgggg agagcactac 1980

acctcatgca caaacaagaa atatacagct caagatagca caaatttggt ccaaactgca 2040

ctcggattaa tgggtctgat tcatggtcga caggctgaga gagatccaac tcctattcac 2100

cgtgctgctg cggtgttaat gaaaggtcag ttggatgatg gcgatttccc acaacaggaa 2160

ctgatgggag tttttatgag gaatgctatg ttgcactatg cagcatacag aaacatcttc 2220

ccattgtggg ctcttggaga ataccgcact ctggtttcgt tgcctataaa aaggattgct 2280

tga 2283

<210> 10

<211> 760

<212> PRT

<213> Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl

<400> 10

Met Trp Arg Ile Lys Phe Gly Glu Gly Ala Asn Asp Pro Leu Leu Phe

1 5 10 15

Ser Thr Asn Asn Phe His Gly Arg Gln Thr Trp Glu Phe Asp Pro Asp

20 25 30

Ala Gly Thr Glu Glu Glu Arg Ala Glu Val Glu Ala Ala Arg Glu His

35 40 45

Phe Tyr Gln Asn Arg Phe Lys Val Thr Pro Ser Ser Asp Leu Leu Trp

50 55 60

Arg Phe Gln Ile Leu Arg Glu Lys Asn Phe Lys Gln Glu Ile Pro Pro

65 70 75 80

Val Arg Ile Gly Glu Gly Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Gln Ala Thr Ala

85 90 95

Ala Phe Arg Arg Ala Ala Thr Phe Trp Asn Ala Leu Gln Ser Pro His

100 105 110

Gly His Trp Pro Ala Glu Asn Ala Gly Pro Asn Phe Tyr Phe Pro Pro

115 120 125

Leu Val Met Ala Ala Tyr Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Val Ile Phe Ser

130 135 140

Ala Glu His Lys Lys Glu Ile Leu Arg Tyr Thr Tyr Asn His Gln Asn

145 150 155 160

Glu Asp Gly Gly Trp Gly Leu His Ile Ser Gly Pro Ser Met Met Phe

165 170 175

Thr Thr Cys Leu Asn Tyr Cys Met Met Arg Ile Leu Gly Glu Gly Pro

180 185 190

Asp Gly Gly Arg Asp Asn Ala Cys Ala Arg Ala Arg Lys Trp Ile Leu

195 200 205

Asp Arg Gly Gly Ala Tyr Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Lys Thr Trp Met

210 215 220

Ala Ile Leu Gly Val Tyr Asp Trp Glu Gly Ser Asn Pro Met Pro Pro

225 230 235 240

Glu Phe Trp Thr Gly Ser Thr Leu Leu Pro Phe His Pro Ser Lys Met

245 250 255

Phe Cys Tyr Cys Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Met Ser Tyr Phe Tyr Ala

260 265 270

Thr Arg Phe Val Gly Pro Ile Thr Pro Leu Val Glu Glu Leu Arg Gln

275 280 285

Glu Ile Tyr Cys Glu Pro Tyr Asn Glu Ile Asn Trp Pro Lys Val Arg

290 295 300

His Trp Cys Ala Pro Glu Asp Asn Tyr Tyr Pro His Gly Arg Val Gln

305 310 315 320

Arg Phe Met Trp Asp Gly Phe Tyr Asn Ile Ala Glu Pro Leu Leu Lys

325 330 335

Arg Trp Pro Leu Lys Lys Ile Arg Asp Asn Ala Ile Gln Phe Thr Ile

340 345 350

Asp Gln Ile His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Arg Tyr Ile Thr Ile Gly

355 360 365

Cys Val Glu Lys Pro Leu Met Met Leu Ala Cys Trp Ala Glu Asp Pro

370 375 380

Ser Gly Glu Ala Phe Lys Lys His Ile Pro Arg Val Thr Asp Tyr Ile

385 390 395 400

Trp Leu Gly Glu Asp Gly Ile Lys Met Gln Ser Phe Gly Ser Gln Ser

405 410 415

Trp Asp Cys Ala Leu Val Ile Gln Ala Leu Leu Ala Gly Asn Leu Asn

420 425 430

Thr Glu Met Ala Pro Thr Leu Lys Gln Ala His Glu Phe Leu Lys Ile

435 440 445

Ser Gln Val Arg Val Asn Thr Ser Gly Asp Tyr Leu Ala His Phe Arg

450 455 460

His Val Ser Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Asp Arg Asp His Gly Trp

465 470 475 480

Gln Val Ser Asp Cys Thr Ala Glu Ala Leu Arg Cys Cys Cys Ile Phe

485 490 495

Ala Asn Met Ser Pro Glu Leu Val Gly Glu Pro Met Asp Ala Glu Cys

500 505 510

Met Tyr Asp Ala Val Asn Val Ile Leu Thr Leu Gln Ser Pro Asn Gly

515 520 525

Gly Val Ser Ala Trp Glu Pro Thr Gly Ala Pro Lys Trp Leu Glu Trp

530 535 540

Leu Asn Pro Val Glu Phe Leu Glu Asp Leu Val Ile Glu Tyr Glu Tyr

545 550 555 560

Ile Glu Cys Thr Ser Ser Ser Ile Gln Ala Leu Thr Leu Phe Arg Lys

565 570 575

Leu Tyr Pro Gly His Arg Arg Lys Glu Ile Asn Asn Phe Ile Thr Arg

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Ala Ala Asp Tyr Ile Glu Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Gly Ser Trp Tyr

595 600 605

Gly Asn Trp Gly Ile Cys Phe Val Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Ile Lys

610 615 620

Gly Leu Glu Ala Ala Gly Arg Thr Tyr Asn Asn Cys Glu Ala Val Arg

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645 650 655

Gly Glu His Tyr Thr Ser Cys Thr Asn Lys Lys Tyr Thr Ala Gln Asp

660 665 670

Ser Thr Asn Leu Val Gln Thr Ala Leu Gly Leu Met Gly Leu Ile His

675 680 685

Gly Arg Gln Ala Glu Arg Asp Pro Thr Pro Ile His Arg Ala Ala Ala

690 695 700

Val Leu Met Lys Gly Gln Leu Asp Asp Gly Asp Phe Pro Gln Gln Glu

705 710 715 720

Leu Met Gly Val Phe Met Arg Asn Ala Met Leu His Tyr Ala Ala Tyr

725 730 735

Arg Asn Ile Phe Pro Leu Trp Ala Leu Gly Glu Tyr Arg Thr Leu Val

740 745 750

Ser Leu Pro Ile Lys Arg Ile Ala

755 760

Claims

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进枇杷生成三萜酸中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述三萜酸为乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乌苏烷型三萜酸为熊果酸和/或科罗索酸，所述齐墩果烷型三萜酸为齐墩果酸和/或山楂酸。

4.核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的任一蛋白，在促进α-香树精生成熊果酸、α-香树精生成科罗索酸、β-香树精生成齐墩果酸、和/或β-香树精生成山楂酸生成方面的应用。

5.一种提高乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸产量的方法，其特征在于，过表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的一种或两种基因，和/或提高氨基酸序列如SEQ ID NO.3～4所示的一种或两种蛋白的表达量。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述乌苏烷型三萜酸为熊果酸和/或科罗索酸，所述齐墩果烷型三萜酸为齐墩果酸和/或山楂酸。

7.核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进枇杷生成乌苏烷型和/或齐墩果烷型三萜酸中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述乌苏烷型三萜酸为科罗索酸，所述齐墩果烷型三萜酸为山楂酸。

9.核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示的任一基因，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的任一蛋白，在促进熊果酸生成科罗索酸，和/或促进齐墩果酸生成山楂酸中的应用。

10.一种提高科罗索酸和/或山楂酸产量的方法，其特征在于，过表达核苷酸序列如SEQID NO.5～6所示的一种或两种基因，和/或提高氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8所示的一种或两种蛋白的表达量。