CN114507676B

CN114507676B - 一种人参皂苷合成调节的PgJAR1基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN114507676B
Application number: CN202210129435.0A
Authority: CN
Inventors: 张儒; 谭时泉; 李昭影; 张变玲
Original assignee: Hunan Institute of Engineering
Current assignee: Hunan Institute of Engineering
Priority date: 2022-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2042-02-11
Also published as: CN114507676A

Abstract

本发明提供了一种人参皂苷合成调节的PgJAR1基因及其编码蛋白与应用，该调节人参皂苷合成的PgJAR1基因序列如SEQ ID NO.1所示，该调节人参皂苷合成的PgJAR1基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该PgJAR1基因编码的蛋白具有I类GH3蛋白家族保守序列，属于植物生长素酶促反应基因中的GH3基因家族，是茉莉酸氨基合酶(JA amino acid synthetase，JAR)。将构建的PgJAR1基因超表达载体通过农杆菌介导转化人参愈伤组织，获得PgJAR1基因超表达的人参细胞，利用PgJAR1基因调节人参细胞中内源性茉莉酸‑异亮氨酸(JA‑Ile)的含量，以调节人参皂苷生物合成中多个酶基因的表达，JA‑Ile含量显著增加，进而高效促进人参皂苷的合成与积累。本发明在人参中利用PgJAR1基因增加人参皂苷产量和提高人参品质方面有着重要的应用价值。

Description

一种人参皂苷合成调节的PgJAR1基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种人参皂苷合成调节的 PgJAR1基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是我国的名贵中药资源，是亚洲国家几千年来最有价值的传统药材之一，因其极高的药用价值备受中西医推崇。人参皂苷是人参中最重要的药效成分，迄今为止，已经分离并鉴定结构的人参皂苷有超过50种，其中包括人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、 Re、Rf、Rf1、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3、Rs1、Rs2、Ro、CK和CM 等。现代药理学研究发现，许多人参皂苷单体在抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力、抗突变、抗炎保肝和抗糖尿病等方面具有十分独特的药理作用，临床应用十分广泛。高品质的人参资源是其在医药领域发挥优势的物质基础，然而，野生的人参资源匮乏，人工种植的人参中人参皂苷含量低，使得优质人参产业化发展受到限制。

具有高含量的人参皂苷药效成分是高品质人参资源的重要保证。然而，人参细胞中人参皂苷的组成与含量受多种因素的影响，其中最重要的因素是人参皂苷受其生物合成关键酶基因及相关的调控基因的高度调节，而这些基因又受到植物体内的重要生物信息素如茉莉酸类化合物(jasmonates，JAs)的调节。

茉莉酸类信号分子参与植物生长发育众多生理过程的调控，尤其是作为环境信号分子能有效地介导植物对生物及非生物胁迫的防御反应，在此过程中会激发一系列防御性次生代谢产物的合成。JAs是植物受外界刺激后反应最快的植物激素，常作为外源性的诱导剂或信号分子，用以提高植物中的次生代谢产物含量。迄今为止，发现的最具活性的JAs主要包括茉莉酸(jasmonic acid，JA) 以及茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和茉莉酸-异亮氨酸复合物 (jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile)。大量的研究发现，外源性的加入茉莉酸类化合物亦能诱导植物细胞中次生代谢产物的合成与积累。在人参中，JAs可以通过提高人参皂苷生物合成途径中的关键酶基因如FPS、SS、SE、DDS、β-AS和P450 等基因的表达水平，实现人参皂苷的含量提高。然而，外源性的加入茉莉酸类诱导物质会带来一些问题，比如难以精准控制施加的量和时机，通常也会对细胞的生长产生明显抑制，进而影响次生代谢产物的产量。最近的研究发现，通过激活内源性的茉莉酸类物质的合成是解决上述问题的重要方法之一。

内源性JAs生物合成途径的激活对于应激信号的传递和放大是必不可少，近年来的研究发现JA-Ile是JAs中最后起到调控JA响应基因的最重要的效应分子，要通过分子水平控制其代谢途径合成更多的具有调节活性的信号分子如 JA-Ile，非常有必要了解其合成途径。JA-Ile的生物合成起始于细胞膜释放的α- 亚麻酸(α-linolenic acid)以及亚油酸，在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase，AOS)、丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC)和12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxophytodienoic acid reductase， OPR)的催化下，再经过三个β-氧化反应生成JA，最后再茉莉酸氨基合酶(JA amino acid synthetase，JAR)催化下，将JA催化为最具活性的JA衍生物JA-Ile。JAR是JA信号通路中的一种关键调控蛋白，当植物在正常生理条件下，体内的JAs水平很低，此时JA信号通路中的JAZ蛋白抑制MYC等转录因子的活性， JAs响应的基因如次生代谢产物生物合成关键酶等基因的表达被抑制，次生代谢产物的合成量很少。当植物受到外界刺激时产生防御反应，JAs信号通路被激活， JA-Ile的合成迅速增加，JA-Ile促进泛素连接酶复合物(SCF^COI1)与JAZ蛋白形成复合物，当形成复合物后，26S蛋白酶就会把JAZ蛋白水解掉。JAZ蛋白被水解后，之前被抑制活性的转录因子MYC等就会被释放出来，可以和下游靶基因的G-box相结合，从而影响下游基因的表达，进而影响不同的次级代谢途径，生成一系列次级代谢产物。

在人参中可能也存在大量的JAR基因家族，其中可能会包含能够调控人参内源性JA-Ile的含量的JAR基因。JAR属于家族型基因，同一物种中的成员也很多，尽管许多基因之间有较高的同源性，但是它们之间的功能仍然存在巨大的差异，例如来源于拟南芥的I类GH3家族基因AtGH3.11和AtGH3.12有着很高的同源性，然而AtGH3.11主要以JA为底物，而AtGH3.12则以SA作为底物。但是目前关于人参中JAR相关基因的克隆和应用于人参皂苷合成的研究未见报道。如何通过分子生物学水平调节人参内源性茉莉酸类的合成，进而实现对人参皂苷生物合成代谢相关基因的调控，实现持久高效的人参皂苷合成与积累，以提高人参皂苷含量和人参的药用价值，对于精准调控人参皂苷的积累、规模化高效生产人参皂苷具有重要的应用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种人参皂苷合成调节的PgJAR1基因及其编码蛋白与应用，其目的通过筛选的PgJAR1基因调控人参细胞内源性JA-Ile含量，以内源性的JA-Ile调节人参皂苷生物合成过程中的一系列基因，最终实现人参皂苷的大量合成与积累，达到提高人参皂苷产量和提升人参品质的目的。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种调节人参皂苷合成的PgJAR1 基因，所述调节人参皂苷合成的PgJAR1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了调节人参皂苷合成的PgJAR1基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种调节人参皂苷合成的PgJAR1 基因编码蛋白，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种调节人参皂苷合成的PgJAR1 基因重组载体，所述重组载体由表达载体与所述调节人参皂苷合成的PgJAR1 基因组成。

作为优选，所述表达载体为pCAMBIA1302。

作为优选，所述调节人参皂苷合成的PgJAR1基因重组载体的构建方式如下：以所述调节人参皂苷合成的PgJAR1基因的开放读码框作为超表达序列，将该cDNA片段插入到植物表达载体pCAMBIA1302中制得。

基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种调节人参皂苷合成的PgJAR1 基因在调节人参皂苷合成与积累中应用。

作为优选，所述应用方式为利用农杆菌介导所述PgJAR1基因转化人参愈伤组织。

本发明所提供的人参PgJAR1基因可以是cDNA序列(SEQ ID NO.1)，也可以是其对应的基因组序列，或者是与PgJAR1基因序列高度同源，通常在95％以上，且编码蛋白具有相同功能的DNA序列。

本发明提供的人参PgJAR1基因编码蛋白经过1至20个氨基酸残基的取代、缺失或添加可衍生出具有与人参PgJAR1基因编码蛋白相同功能的蛋白。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用MeJA诱导的人参转录组测序方法，初步筛选出人参JAR家族基因，再通过体外表达实验和农杆菌介导的转化人参细胞实验，从多个人参JAR 基因中筛选到具有高效催化茉莉酸(JA)为茉莉酸-异亮氨酸复合物(JA-Ile) 基因PgJAR1。人参PgJAR1基因编码蛋白能够在人参体内外高效催化JA合成 JA-Ile，通过筛选的PgJAR1基因及其编码的蛋白调控人参细胞内源性JA-Ile含量，以内源性的JA-Ile调节人参皂苷生物合成过程中的一系列基因，并且最终实现人参皂苷的大量合成与积累，达到提高人参皂苷产量和提升人参品质的目的。该基因及其编码的蛋白是一种高效、特异性和切实可行的提高人参皂苷的方法。

本发明通过构建了PgJAR1基因的植物超表达重组载体，利用农杆菌介导 PgJAR1基因转化人参愈伤组织，通过PgJAR1基因在人参细胞中高水平表达，与对照人参细胞相比，获得的PgJAR1基因超表达人参细胞中人参总皂苷含量显著提高。由此说明，利用基因编辑或超表达PgJAR1基因能够获得人参总皂苷含量显著提高的人参细胞、组织或植株，为提高人参品质或提高人参总皂苷产量提供了一种高效的技术手段。

本发明利用现有的植物基因工程技术，利用人参PgJAR1在内源性JA-Ile 合成中的重要作用，通过其调节内源性JA-Ile的合成实现对人参皂苷积累的调控。并根据PgJAR1基因设计超表达重组载体，在人参细胞中超表达PgJAR1基因，实现人参总皂苷含量的提高，可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参，获得人参总皂苷含量高的优良人参品种，也是一种切实可行的生产人参总皂苷的有效方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中PgJAR1基因电泳结果，图中，1、2和3泳道表示PCR扩增产物，M表示DNA标准分子量；

图2是本发明实施例2荧光定量PCR(qRT-PCR)检测100μmol/L外源性 MeJA处理不同时间后人参细胞中PgJAR1基因的表达水平，以β-actin作为内参；

图3是本发明实施例2荧光定量PCR(qRT-PCR)检测100μmol/L外源性 MeJA处理不同时间后人参细胞中人参皂苷生物合成关键酶基因的表达水平；

图4是本发明实施例5中PgJAR1基因植物超载体构建示意图；

图5是本发明实施例5荧光定量PCR(qRT-PCR)检测农杆菌介导转化人参细胞中PgJAR1基因表达水平；

图6是本发明实施例5荧光定量PCR(qRT-PCR)检测农杆菌介导转化人参细胞中人参皂苷合成关键酶PgSS、PgSE、PgDDS和PGUGT71A27基因的表达水平；

图7是本发明实施例5农杆菌介导转化PgJAR1基因的人参细胞中JA-Ile 含量；

图8是本发明实施例5农杆菌介导转化PgJAR1基因的人参细胞中人参皂苷含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。

实施例1

PgJAR1基因的获得

1、人参RNA提取及其反转录制备cDNA

将新鲜4年生人参根诱导的发根于1/2MS液体培养基中，120rpm、25℃暗培养 3周，再在培养基中加入100μmol/L MeJA，25℃，继续暗培养24h后，取适量人参发根于液氮预冷的研钵内，加入液氮后快速研磨成细粉。取30-40mg于1.5mL 离心管中，加入1mL TRIzol试剂，40μLβ-巯基乙醇，混匀后置于室温5-10min；加入0.2mL氯仿，振摇l5s，室温放置10-15min；4℃，12000×g离心15min，收集上层置于于1.5mL离心管中，弃去沉淀；再加入0.4mL3mol/L醋酸铵(pH5.2)和 0.6mL异丙醇后混匀，室温放置5-10min，4℃、12000×g离心10min，弃去上清；加入1mL 75％的乙醇，混匀；4℃，10000×g离心5min，弃去上清液，再加入20μL DEPC水溶解RNA，备用。

以oligod(T)18为引物，利用逆转录酶合成cDNA第一链，将合成的cDNA 作为模板PCR扩增，或者置于-20℃保存，备用。

2、PgJAR1基因的PCR扩增

根据MeJA诱导的人参转录组测序所获得的候选PgJAR1基因序列信息，并以PrimerPremier 5软件设计PCR扩增引物，候选PgJAR1基因的PCR扩增引物如下。

PgJAR1-F：5′-ATGTTGGAAACTATGGAGAA-3′；(SEQ ID NO.3)

PgJAR1-R：5′-TCAATCAAAAGCAGTACTAAAG-3′；(SEQ ID NO.4)

PgJAR1基因PCR扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性25s，55℃退火 25s，72℃延伸70s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳进行分析。图1为PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳结果，图1中1、2和3泳道表示 PCR扩增产物，M表示DNA标准分子量，结果显示PCR产物大小约为1750bp。

3、PgJAR1基因的亚克隆及其测序分析

将PCR产物中与理论大小一致的电泳条带胶回收后连接至pGEM-T Easy载体，并转化大肠杆菌DH5α，将重组质粒测序，对测序结果进行Blast分析比对，基因编码的蛋白具有I类GH3蛋白家族保守序列，属于植物生长素酶促反应基因中的GH3基因家族，是茉莉酸氨基合酶JAR，也即是证明获得了PgJAR1基因。

实施例2

荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PgJAR1和人参皂苷生物合成酶基因的表达水平

1、RNA提取及反转录

提取4年生新鲜人参根诱导的发根的RNA，发根在1/2MS液体培液基中 25℃，110r/min暗培养21d，再加入MeJA(100μmol/L)进行处理，处理不同时间后分别取出发根，用于提取RNA，提取方法同实施例1。上述RNA以oligod (T)18为引物，以拟转录酶合成cDNA。β-actin、PgJAR1、PgSS、PgSE、PgDDS 和PgUGT71A27基因的qRT-PCR分析引物如下：

β-actin荧光定量引物F：5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；(SEQ ID NO.5)

β-actin荧光定量引物R：5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCTTGA-3′；(SEQ ID NO.6)

PgJAR1荧光定量引物F：5′-GCGGACCTACCGCTATTGAG-3′；(SEQ ID NO.7)

PgJAR1荧光定量引物R：5′-ACAGCAAAAGTTGCCGACTC-3′；(SEQ ID NO.8)

PgSS荧光定量引物F：5′-ATCCCTCCGGAGCCACACTGG-3′；(SEQ ID NO.9)

PgSS荧光定量引物R：5′-GAGCTGAGGGCCGAGCTGTTG-3′；(SEQ ID NO.10)

PgSE荧光定量引物F：5′-TGGCCTAAACCCGCGTCCAA-3′；(SEQ ID NO.11)

PgSE荧光定量引物R：5′-AGCGCCGAGCCACATTCGT-3′；(SEQ ID NO.12)

PgDDS荧光定量引物F：5′-TGAGATTAGATGAAAACGAAC-3′；(SEQ ID NO.13)

PgDDS荧光定量引物R：5′-GGCAATGATAAGGGGAGGTGT-3′；(SEQ ID NO.14)

PgUGT71A27荧光定量引物F：5′-TCGGAGGGTTCCTGTCTCAT-3′；(SEQ ID NO.15)

PgUGT71A27荧光定量引物R：5′-AGCATTGAGTTGTTGCTCGC-3′；(SEQ ID NO.16)。

图2是荧光定量PCR(qRT-PCR)检测100μmol/L外源性MeJA处理不同时间后人参细胞中PgJAR1基因的表达水平，以β-actin作为内参。图2结果显示人参细胞中PgJAR1基因的表达水平受MeJA诱导会显著提升，随着MeJA处理时间的加长，PgJAR1基因的表达水平有所下降。

2、qRT-PCR分析基因表达水平

以CFX Connect荧光定量PCR仪进行分析检测，按照SYBR Premix Ex Taq 荧光定量PCR试剂盒进行扩增。反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL，cDNA模板0.5μL，上游和下游引物(10μmol/L)各0.5μL，补ddH2O至25μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性40s，60℃退火30s，40个循环；95℃15s， 60℃1min，95℃15s。每个样品3个重复，反应结束后，分析PgJAR1、PgSS、 PgSE、PgDDS和PgUGT71A27基因的表达模式。

图3是荧光定量PCR(qRT-PCR)检测100μmol/L外源性MeJA处理不同时间后人参细胞中人参皂苷生物合成关键酶基因的表达水平，以β-actin作为内参；其中PgSS为鲨烯合成酶基因；PgSE为鲨烯环氧酶基因；PgDDS为达玛烯二醇合成酶基因；PgUGT71A27为尿苷二磷酸糖基转移酶，催化合成人参皂苷F2；结果显示与0h相比，PgSS、PgSE、PgDDS和PgUGT71A27基因的表达均受 MeJA诱导，且与PgJAR1基因表达水平类似。

实施例3

人参细胞中JA-Ile提取及含量测定

1、人参JA-Ile的提取

取新鲜的人参愈伤组织或发根于液氮中研磨至干粉，称取适量并加入异丙醇-水-盐酸混合提取液，添加8μL 1μg/mL的内标溶液，4℃振荡30min；加入二氯甲烷，低温振荡30min；4℃13000r/min离心5min，取下层有机相；避光，以氮气吹干有机相，以甲醇(0.1％甲酸)复溶，4℃13000×g离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，HPLC-MS/MS检测JA-Ile。

2、人参JA-Ile含量测定

液相测定条件为：Agilent 1290色谱仪，色谱柱为Poroshell 120SB-C18反相色谱柱(2.1×150，2.7μm)；柱温：30℃；流动相：A：B＝甲醇/0.1％甲酸)： (水/0.1％甲酸)；洗脱梯度：0–1min，A＝20％；1–9min，A递增至80％；9–10min， A＝80％；10-10.1min，A递减至20％；10.1-15min，A＝20％；进样体积：2μL。

质谱条件：AB SCIEX-6500QTRAP质谱仪，电喷雾电离源(ESI)雾化温度：400℃，气帘气(CUR)：15psi，喷雾电压(IS)：4500V，雾化气压力(Gas1)： 65psi，辅助气压力(Gas2)：70psi，监测模式为多反应监测模式(MRM)，每个离子对根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测。

实施例4

人参皂苷提取及含量测定

1、人参皂苷的提取

取新鲜的人参发根或组织，自来水清洗2min后用ddH2O清洗，60℃干燥至恒重。将其研磨成细粉，用80％甲醇60℃浸提(1g：40mL)，超声波处理3 次，每次15min；60℃水浴蒸干甲醇，水洗超声溶解，乙醚萃取两次，取水相，用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃水浴蒸干正丁醇，即得到人参总皂苷，用适量的甲醇超声波溶解，定容至刻度，过0.45μm的微孔滤膜，得到样品溶液。

2、人参皂苷含量测定

人参皂苷含量测定采用HPLC法，HPLC测定条件为：LC-MS 8050高效液相色谱仪；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(1.7μm， 2.1mm×50mm)；流动相为乙腈(A)：1％甲酸(B)，洗脱条件如下：A：B(10： 90)-(25：75)2min；A：B(25：75)2-8min；A：B(25：75)–(45：55) 8–16.5min；A：B(45：55)16.5–21.5min；A：B(45：55)–(98：2)21.5–21.6min； A：B(98：2)21.6–25min；A：B(98：2)–(10：90)25–25.1min；A：B(10： 90)25.1–29min。流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为3μL，检测波长为 202nm。

以人参总皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1和Rg3作为标准品分别测定样品中的各皂苷单体的含量，再以各皂苷单体含量之和代表人参细胞中总皂苷的含量。

实施例5

1、PgJAR1基因超表达载体构建，PgJAR1基因植物超载体构建如图4所示。

(1)PCR扩增用于同源重组的PgJAR1基因片段

根据PgJAR1基因序列设计同源重组引物以扩展其全长，同源重组扩增引物如SEQID N0.6和SEQ ID N0.7。并以Bgl II限制性核酸内切酶酶切 pCAMBIA1302制备线性化载体，将PCR扩增产物和线性化的载体胶回收。同源重组PCR扩增引物如下：

PgJAR1-F1：5′-GGACTCTTGACCATGTTGGAAACTATGGAGAA-3′；(SEQ ID NO.17)

PgJAR1-R1：

5′-TCGCCTTTGGAAGTTGAATGCCTCAATCAAAAGCAGTACTAAAG-3′；

(SEQ ID NO.18)

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min。

(2)pCAMBIA1302-PgJAR1载体构建及农杆菌A4的转化

参考In-Fusion HD Cloning Kit说明书将PgJAR1基因连接至pCAMBIA1302 载体，连接后以PCR和测序鉴定是否连接成功。经PCR和测序鉴定正确后，构建的载体命名为pCAMBIA1302-PgJAR1。

将构建好的pCAMBIA1302-PgJAR1以冻融法转化发根农杆菌A4，转化后阳性克隆以PCR进行筛选。再经测序鉴定成功后获得含PgJAR1基因超表达载体的农杆菌。

2、发根农杆菌介导转化人参愈伤组织

(1)含pCAMBIA1302-PgJAR1的发根农杆菌培养

挑取含有pCAMBIA1302-PgPDR3载体的农杆菌和对照农杆菌(含有空载体pCAMBIA1302)单菌落分别接种于10mL加相应抗生素的LB液体培养基中培养16-24h。取1mL菌液转接到50mL LB加相应抗生素的液体培养基中，并加入 10μL 100mmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS；母液用DMSO配制，使其终浓度为20μmol/L)。28℃培养过夜。培养物与5000rpm、4℃离心10min，收集菌体，用MS培养基清洗3次后，用MS+乙酰丁香酮(终浓度为20μmol/L)培养基将菌液稀释至OD600为0.8左右，作为侵染液。

(2)农杆菌介导PgJAR1基因转化人参愈伤组织

取4年生人参新鲜根诱导的愈伤组织，放入含有pCAMBIA1302-PgJAR1和pCAMBIA1302的发根农杆菌A4侵染液中2-5min，用无菌滤纸吸干菌液，置于 1/2MS+2,4D的培养基上避光共培养3-5d；待发根长出后将其切下，接于1/2MS 基本培养基中培养。每隔5–7d转移1次，直至无细菌生长，每4周继代1次。

(3)qRT-PCR分析转化后的人参细胞中PgJAR1基因表达水平

取筛选的转基因人参愈伤组织，提取总RNA，以oligod(T)18为引物，利用反转录酶反转录合成cDNA第一链，并通过qRT-PCR的方法对转基因发根进行筛选鉴定，获得的阳性人参发根，PgJAR1基因分析所用引物为SEQ ID NO.7 和SEQ ID NO.8，内参β-actin所用引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。Control 表示转化空载体的人参愈伤组织，OE(overexpression)表示转化含PgJAR1基因的人参愈伤组织，即转pCAMBIA1302空载体筛选得到的人参愈伤组织；OE8、 OE16和OE21为转PgJAR1基因超表达载体筛选得到的转基因人参愈伤组织； OE+Jarin-1表示转化含PgJAR1基因的人参愈伤组织外源施加JAR1合成酶抑制剂Jarin-1。

图5是荧光定量PCR(qRT-PCR)检测农杆菌介导转化人参细胞中PgJAR1 基因表达水平；以β-actin作为内参；结果显示转化PgJAR1基因的人参细胞中 PgJAR1基因上调表达，其中最高的细胞株系中的PgJAR1基因表达水平是对照细胞的5.11倍(OE16)；加入JAR1合成酶抑制剂后PgJAR1基因的表达水平与超表达细胞相比显著下降，并且是对照组的0.82倍；图5结果显示，与对照 Control相比，获得的OE8、OE16和OE21愈伤组织中PgJAR1基因水平均明显的上升，初步表明获得了PgJAR1基因超表达的人参愈伤组织。

图6是荧光定量PCR(qRT-PCR)检测农杆菌介导转化人参细胞中人参皂苷合成关键酶PgSS、PgSE、PgDDS和PGUGT71A27基因的表达水平；以β-actin 作为内参；图中Control表示转化空载体的人参愈伤组织，OE表示转化含PgJAR1 基因的人参愈伤组织，OE+Jarin-1表示转化含PgJAR1基因的人参愈伤组织外源施加JAR1合成酶抑制剂Jarin-1；结果显示转化PgJAR1基因的人参细胞中PgSS、 PgSE、PgDDS和PgUGT71A27基因的表达水平均上调，加入JAR1合成酶抑制剂后，人参皂苷合成酶基因表达水平受到抑制。

(4)超表达PgJAR1基因的人参细胞中JA-Ile和人参皂苷含量测定

JA-Ile提取和含量测定方法见实施例3，人参皂苷提取和含量测定方法见实施例4。

图7是农杆菌介导转化PgJAR1基因的人参细胞中JA-Ile含量，图中Control 表示转化空载体的人参愈伤组织，OE16表示转化含PgJAR1基因的人参愈伤组织(株系16)，OE16+Jarin-1表示转化含PgJAR1的人参愈伤组织外源施加JAR1 合成酶抑制剂Jarin-1；结果显示转化PgJAR1基因的人参细胞JA-Ile含量明显上调，是对照的43.11倍，加入JAR1合成酶抑制剂后，JA-Ile合成与积累受到抑制，JA-Ile的含量是OE16株系中的0.05倍，是对照的2.26倍，PgJAR1基因超表达的人参细胞OE6、OE11和OE18的总皂苷均显著增加。

图8是农杆菌介导转化PgJAR1基因的人参细胞中人参皂苷含量，图中 Control表示转化空载体的人参愈伤组织，OE16表示转化含PgJAR1基因的人参愈伤组织(株系16)，OE+Jarin-1表示转化含PgJAR1的人参愈伤组织外源施加 JAR1合成酶抑制剂Jarin-1；结果显示转化PgJAR1基因的人参细胞人参总皂苷含量明显上调，是对照的6.48倍，加入JAR1合成酶抑制剂后，人参皂苷合成与积累受到抑制，即使是超表达PgJAR1基因的人参细胞中，加入抑制剂后人参皂苷的含量仅仅是对照的1.27倍。上述结果表明PgJAR1基因可以有效的促进人参细胞中JA-Ile的合成，进而促进人参皂苷的高效积累。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 湖南工程学院

<120> 一种人参皂苷合成调节的PgJAR1基因及其编码蛋白与应用

<141> 2022-02-11

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttggaaa ctatggagaa tatttttgac cccaaagaat ttatagaaga atttgaggct 60

ctgacgaagg atgccgggag agttcaaaag gataccttaa ggaaaatatt ggaagaaaat 120

ggtagaacag agtatttaca gaaatggggt cttgatggaa aaactgatcc cgagagtttt 180

gcagaatttg tgcctcttgc cactcacagt gatttggaac cttacattca aaggatcgtg 240

gatggtgatg tttccccaat tctcaccgga aagcccatca aaaccatctc attaagttct 300

ggaactactc agggtaagcc caagtttgta cctttcaatg atgaattagt ggagtccact 360

atgcagatat ttaagacatc ttttgccttt agaaacagag aatttcctat ccgaaatgga 420

aaggccttgc agtttatcta tagcagcaag cagttcaaaa caaaaggggg actgccagca 480

ggaacggcta ctacaaatgt gtttcgtagt tcacaattca agaaaacaat gaaggtaatg 540

catgccttga gttgtagccc ggatgaagtg atatttggtc ctgattacca ccagtccttg 600

tactgccatc tcctatgtgg acttattttc cgggatgaca tacaagttgt gtcctctaca 660

tttgcccaca gcattgttta tgccttcaag acttttgaac aagtctgtga agaactctgt 720

actgacatcc gagaaggagt cttgagcagt cgagttactg ttccatccat ccgaacagct 780

atggcgaaac tgctcaagcc taatcctgat ttggctgaca tggtttacga aaagtgttgt 840

gggttaagta attggtatgg attaatacca gagctatttc ccaatgctaa gtacatatat 900

ggtatcatga cagggtcaat ggaaccttat ttaaaaaaat tgaggcacta tgcagcggac 960

ctaccgctat tgagtgctga ttatgggtct tctgaagggt ggattggggc aaatgttaac 1020

ccgaaattgc ccccggagtc ggcaactttt gctgtgcttc ctaatattgg gtatttcgaa 1080

tttatacccc tgagggagaa tctggacttc ctggttcaag ataaaaatga ttccactttc 1140

cactttttag agcccaagcc agtgagtatg actgaagtca aggttggcga agaatacgag 1200

atcattgtca ccaatttcgc aggtctgtac aggtatagat taggagatgt ggttaaggtt 1260

atgggatttc acaactcggc cccggaactc caatttgttt gtaggagaaa tcttctgctc 1320

accatcaaca ttgataagaa cacggagaaa gatttacagc tatcggttga agcagcagca 1380

gctgcagaaa aacttgaagt tgtggatttc acaagccgtg tggatttatc cacagatccc 1440

ggtcattatg tcatcttctg ggaaataaat ggcgaagcaa atgacgaggt tctgaaggaa 1500

tgctgcaatt gtttggacaa atcatttgtg gatgcaggct atacgagctc ccgaaaggtg 1560

aatgccatag gaccactcga gctccgagtc ttgaggaggg gaacttttca tgagattctt 1620

gatcattttg taggattggg tggctctgta agccaattca aaactcctcg atgcgtcgga 1680

cccaataata acacactgtt gcagatacta tgcaacaatg ttgtcaagtg ctactttagt 1740

actgcttttg attga 1755

<210> 2

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Glu Thr Met Glu Asn Ile Phe Asp Pro Lys Glu Phe Ile Glu

1 5 10 15

Glu Phe Glu Ala Leu Thr Lys Asp Ala Gly Arg Val Gln Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Arg Lys Ile Leu Glu Glu Asn Gly Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Lys

35 40 45

Trp Gly Leu Asp Gly Lys Thr Asp Pro Glu Ser Phe Ala Glu Phe Val

50 55 60

Pro Leu Ala Thr His Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gln Arg Ile Val

65 70 75 80

Asp Gly Asp Val Ser Pro Ile Leu Thr Gly Lys Pro Ile Lys Thr Ile

85 90 95

Ser Leu Ser Ser Gly Thr Thr Gln Gly Lys Pro Lys Phe Val Pro Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Leu Val Glu Ser Thr Met Gln Ile Phe Lys Thr Ser Phe

115 120 125

Ala Phe Arg Asn Arg Glu Phe Pro Ile Arg Asn Gly Lys Ala Leu Gln

130 135 140

Phe Ile Tyr Ser Ser Lys Gln Phe Lys Thr Lys Gly Gly Leu Pro Ala

145 150 155 160

Gly Thr Ala Thr Thr Asn Val Phe Arg Ser Ser Gln Phe Lys Lys Thr

165 170 175

Met Lys Val Met His Ala Leu Ser Cys Ser Pro Asp Glu Val Ile Phe

180 185 190

Gly Pro Asp Tyr His Gln Ser Leu Tyr Cys His Leu Leu Cys Gly Leu

195 200 205

Ile Phe Arg Asp Asp Ile Gln Val Val Ser Ser Thr Phe Ala His Ser

210 215 220

Ile Val Tyr Ala Phe Lys Thr Phe Glu Gln Val Cys Glu Glu Leu Cys

225 230 235 240

Thr Asp Ile Arg Glu Gly Val Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser

245 250 255

Ile Arg Thr Ala Met Ala Lys Leu Leu Lys Pro Asn Pro Asp Leu Ala

260 265 270

Asp Met Val Tyr Glu Lys Cys Cys Gly Leu Ser Asn Trp Tyr Gly Leu

275 280 285

Ile Pro Glu Leu Phe Pro Asn Ala Lys Tyr Ile Tyr Gly Ile Met Thr

290 295 300

Gly Ser Met Glu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Arg His Tyr Ala Ala Asp

305 310 315 320

Leu Pro Leu Leu Ser Ala Asp Tyr Gly Ser Ser Glu Gly Trp Ile Gly

325 330 335

Ala Asn Val Asn Pro Lys Leu Pro Pro Glu Ser Ala Thr Phe Ala Val

340 345 350

Leu Pro Asn Ile Gly Tyr Phe Glu Phe Ile Pro Leu Arg Glu Asn Leu

355 360 365

Asp Phe Leu Val Gln Asp Lys Asn Asp Ser Thr Phe His Phe Leu Glu

370 375 380

Pro Lys Pro Val Ser Met Thr Glu Val Lys Val Gly Glu Glu Tyr Glu

385 390 395 400

Ile Ile Val Thr Asn Phe Ala Gly Leu Tyr Arg Tyr Arg Leu Gly Asp

405 410 415

Val Val Lys Val Met Gly Phe His Asn Ser Ala Pro Glu Leu Gln Phe

420 425 430

Val Cys Arg Arg Asn Leu Leu Leu Thr Ile Asn Ile Asp Lys Asn Thr

435 440 445

Glu Lys Asp Leu Gln Leu Ser Val Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Lys

450 455 460

Leu Glu Val Val Asp Phe Thr Ser Arg Val Asp Leu Ser Thr Asp Pro

465 470 475 480

Gly His Tyr Val Ile Phe Trp Glu Ile Asn Gly Glu Ala Asn Asp Glu

485 490 495

Val Leu Lys Glu Cys Cys Asn Cys Leu Asp Lys Ser Phe Val Asp Ala

500 505 510

Gly Tyr Thr Ser Ser Arg Lys Val Asn Ala Ile Gly Pro Leu Glu Leu

515 520 525

Arg Val Leu Arg Arg Gly Thr Phe His Glu Ile Leu Asp His Phe Val

530 535 540

Gly Leu Gly Gly Ser Val Ser Gln Phe Lys Thr Pro Arg Cys Val Gly

545 550 555 560

Pro Asn Asn Asn Thr Leu Leu Gln Ile Leu Cys Asn Asn Val Val Lys

565 570 575

Cys Tyr Phe Ser Thr Ala Phe Asp

580

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgttggaaa ctatggagaa 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaatcaaaa gcagtactaa ag 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgccccagaa gagcaccctg t 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcatacagg gaaagatcgg cttga 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggacctac cgctattgag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acagcaaaag ttgccgactc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atccctccgg agccacactg g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagctgaggg ccgagctgtt g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggcctaaac ccgcgtccaa 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcgccgagc cacattcgt 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgagattaga tgaaaacgaa c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggcaatgata aggggaggtg t 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcggagggtt cctgtctcat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcattgagt tgttgctcgc 20

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggactcttga ccatgttgga aactatggag aa 32

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcgcctttgg aagttgaatg cctcaatcaa aagcagtact aaag 44

Claims

1.一种调节人参皂苷合成的PgJAR1基因，其特征在于，所述调节人参皂苷合成的PgJAR1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于扩增如权利要求1所述的调节人参皂苷合成的PgJAR1基因的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.一种如权利要求1所述的调节人参皂苷合成的PgJAR1基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种如权利要求1所述的调节人参皂苷合成的PgJAR1基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体由表达载体与所述PgJAR1基因组成。

5.根据权利要求4所述的调节人参皂苷合成的PgJAR1基因的重组载体，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA1302。

6.根据权利要求5所述的调节人参皂苷合成的PgJAR1基因的重组载体，其特征在于，所述PgJAR1基因的重组载体的构建方式如下：以所述调节人参皂苷合成的PgJAR1基因的开放读码框作为超表达序列，将该cDNA片段插入到植物表达载体pCAMBIA1302中制得。

7.一种如权利要求1所述的调节人参皂苷合成的PgJAR1基因在调节人参皂苷合成与积累中应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用方式为利用农杆菌介导所述PgJAR1基因转化人参愈伤组织。