CN117625628B - 一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子及其应用，属于植物基因工程技术领域；该启动子来源于四年生人参根，通过分子生物学和基因工程手段，将ProPgJOX2启动子与β‑葡萄糖苷酸酶（GUS）基因构建融合的植物表达载体，通过农杆菌介导转入人参愈伤组织中表达；此方法可检测到GUS酶的活性，且ProPgJOX2启动子受干旱胁迫和茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导；本发明的启动子可借助基因重组技术置换人参皂苷生物合成调控基因的启动子，从而提升人参对逆境的适应能力并增加人参皂苷的含量，可为人参的抗逆境育种及皂苷生物合成调控研究提供重要的理论依据，对于提升人参产业的可持续性发展具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子及其应用。
背景技术
基因启动子作为基因转录起始的核心区域，对基因的表达调控具有核心作用。这些区域位于结构基因的5端上游区域，是RNA聚合酶识别和结合的位点，没有启动子序列，转录无法进行。在植物中，启动子的功能多样性和与环境因素的相互作用，为植物适应性、生长发育调控等研究带来了挑战。植物基因启动子根据其特性可分为三类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子在多种组织中均持续表达，保证了基因表达的稳定性。组织特异性启动子则具有发育调节特性，能确保基因在特定器官或组织中精准表达。而诱导型启动子则会在特定环境刺激下表达，如生物或非生物胁迫等。这些启动子的研究不仅有助于深入了解基因表达调控的机制，也为植物基因工程提供了重要的工具和应用前景。
植物次生代谢产物是一类对植物生长发育和适应环境至关重要的化合物。这些化合物的合成和积累在不同组织中存在显著差异，而这些差异与组织特异性启动子的调控紧密相关。通过利用组织特异性启动子，可以实现在特定组织或器官中合成次生代谢产物，从而提高其产量和品质。同时，一些启动子可以在环境刺激下调控基因的表达，进而影响次生代谢产物的合成。例如，一些病原菌的侵染、激素和外界化学物质等能够诱导植物中抗病等次生代谢产物的合成，而光、温等环境因素也可以通过调节启动子的活性来影响次生代谢产物的合成。
人参（Panax ginseng C. A. Meyer）作为五加科人参属珍贵中药材，拥有着悠久的使用历史。其独特的药效成分——人参皂苷，更是赋予了它独特的药用价值。人参中人参皂苷的组成与含量受其生物合成途径中一系列关键酶基因的高度调节，这些基因的功能也受到一些重要因子如茉莉酸类化合物（jasmonates，JAs）、生物胁迫等的影响。近年来，在拟南芥中发现一类茉莉酸诱导的氧化酶（JOX），可以将JA直接羟基化生成12-OH-JA，参与调节JA介导的信号转导过程。JA介导的信号转导在植物生长发育中发挥重要调节作用。
然而，关于人参PgJOX2及其启动子ProPgJOX2的作用，以及ProPgJOX2启动子的克隆及其在提高适应环境胁迫和人参皂苷生物合成调控的应用，目前尚未有相关研究报道。因此，通过ProPgJOX2调节特定基因的表达，进而调节人参对逆境的适应能力、提高人参皂苷的积累，具有重要的应用价值。这一研究领域将为探索人参皂苷的生物合成机制、提高人参对逆境适应性和药用价值提供新的思路和途径。
发明内容
为解决上述问题，本方案提供了一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子及其应用，调节人参对逆境的适应能力，提高适应环境胁迫和人参皂苷生物合成调控。
为达到以上目的，本方案首先提供了一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子，所述ProPgJOX2启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述ProPgJOX2启动子克隆的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子的重组载体，所述ProPgJOX2启动子与植物表达载体组成所述重组载体。
作为优选，所述植物表达载体为pBI121，所述重组载体为pBI121-ProPgJOX2::GUS。
作为优选，pBI121载体中GUS基因上游的CaMV 35S启动子被ProPgJOX2启动子序列所替代而构建至pBI121载体中。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子或其重组载体在提升人参对逆境适应能力并增加人参皂苷的含量的应用。
为了使上述技术方案更加清晰，下面对本发明作进一步说明：
本发明提供的ProPgJOX2启动子属于人参JOX2基因的启动子，该启动子来源于人参（Panax ginseng C.A. Meyer）并命名为ProPgJOX2，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明利用基因工程技术，将ProPgJOX2启动子与植物表达载体pBI121进行重组，构建成重组载体pBI121-ProPgJOX2::GUS，更具体地说，是将pBI121载体中GUS基因上游的CaMV 35S启动子替换为ProPgJOX2启动子序列，并通过根癌农杆菌介导法将该重组载体导入到人参细胞中，通过筛选和培养得到转基因植物。
本发明研究发现，ProPgJOX2启动子具有启动GUS基因表达的活性，且GUS基因的表达受到MeJA（茉莉酸甲酯）和PEG（ 聚乙二醇）的诱导；ProPgJOX2启动子可以成功驱动DDS基因在人参愈伤组织中的瞬时表达，并且MeJA和干旱胁迫能有效促进ProPgJOX2驱动的人参皂苷合成与积累，这为利用ProPgJOX2启动子在提高人参对环境适应能力的同时增加人参中人参皂苷的含量方面提供了重要的应用价值，为生产高价值人参皂苷等次生代谢产物提供了有效的途径。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）借助转录组和基因组测序等技术，本发明成功发现了人参中多个JOX家族基因及其启动子。通过农杆菌A4介导ProPgJOX2启动子在人参愈伤组织中的表达，发现其具有较高活性，并显示出对MeJA和干旱胁迫的敏感性，这表明，利用基因重组技术，ProPgJOX2启动子可以有效地提高人参细胞中特定基因的表达水平，进而增强其对逆境环境的适应能力。
（2）本发明的另一重要贡献是利用人参ProPgJOX2启动子来调节细胞内人参皂苷等次生代谢产物的含量，通过启动子激活人参皂苷生物合成调控基因（例如DDS基因）的表达，进而实现对其含量的有效调节。这一过程不仅增强了细胞对逆境的适应能力，而且显著促进了人参皂苷等次生代谢产物的合成与积累。这一方法巧妙地平衡了人参皂苷等次生代谢产物的合成与细胞生长，为次生代谢产物的工业化生产提供了新的策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1扩增的人参ProPgJOX2启动子片段电泳结果；
图2是本发明实施例2中ProPgJOX2启动子驱动GUS基因表达载体表达框示意图；
图3是本发明实施例4中荧光定量PCR（qRT-PCR）检测转化人参愈伤组织中ProPgJOX2启动子启动的GUS基因的表达水平；
图4是本发明实施例4中转化人参愈伤组织中ProPgJOX2启动子启动的GUS基因的表达的酶活性；
图5是本发明实施例5中ProPgJOX2启动子启动人参DDS基因在人参愈伤组织中瞬时表达后人参皂苷含量测定结果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1 ProPgJOX2启动子的克隆及顺式作用元件分析
1、人参根基因组DNA的提取
取四年生新鲜人参根，用自来水冲洗干净，然后用75%乙醇清洗30s，最后用无菌水冲洗3次，使用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法或植物基因组DNA提取试剂盒提取人参根基因组DNA，并将提取的DNA保存在-20℃备用。
2、PCR扩增克隆人参ProPgJOX2启动子
对COR（冠菌素）诱导的人参细胞转录组测序结果进行分析，结合前期人参基因组测序结果，根据筛选得到的人参PgJOX2基因序列信息，设计用于体外扩增ProPgJOX2启动子的引物，引物的设计应确保能够准确、高效地扩增目标启动子序列，ProPgJOX2启动子扩增所用的引物序列如下：
ProPgJOX2-F1：5′-AGGCTAAATGGCCAAGTGTAAT-3′；（SEQ ID NO.2）
ProPgJOX2-R1：5′-CGGCTCCGGCCAACTCTGTAA-3′；（SEQ ID NO.3）
以人参基因组DNA为模板，使用设计的ProPgJOX2-F1与ProPgJOX2-R1引物进行PCR扩增，获取ProPgJOX2启动子序列，PCR反应应优化条件以确保扩增的准确性和特异性。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。
通过PCR扩增后，产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析，电泳结果如图1所示，图中1表示PCR扩增产物，M表示Marker，结果表明获得了大小约为2000bp的条带，为了确保扩增产物的准确性，对候选的电泳条带进行了胶回收，随后，对胶回收产物进行了测序分析。测序后，我们获得了长度为2060bp的基因片段，其中起始密码子上游序列长为2030bp。为了深入了解克隆的启动子序列的特性，我们使用了PlantCARE在线分析工具对其进行了顺式元件分析。分析结果如表1所示，克隆的启动子序列中包含了基本元件（TATA-Box和CAAT-Box），并且含有多种顺式作用元件。这些结果表明，我们成功克隆了含有完整基本元件和多种顺式作用元件的人参ProPgJOX2启动子序列。
实施例2 植物表达载体的构建
为了构建植物表达载体，根据启动子序列设计特定的引物，并包含Bam HI/HindIII酶切位点，设计的引物分别命名为ProPgJOX2-F2和ProPgJOX2-R2，以下是它们的序列信息：
ProPgJOX2-F2：5′-CGCGGATCCAGGCTAAATGGCCAAGTGTAAT-3′；（SEQ ID NO.4）
ProPgJOX2-R2：5′-CCCAAGCTTCGGCTCCGGCCAACTCTGTAA-3′。（SEQ ID NO.5）
以实施例1所扩增的启动子为模板，使用引物ProPgJOX2-F2和ProPgJOX2-R2进行PCR扩增，具体扩增条件为：
预变性94℃ 5min，变性94℃ 30s，退火58℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；终延伸72℃ 5min。扩增后的产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目标条带。
然后使用Bam HI和Hind III对pBI121载体进行双酶切以获得切除GUS基因CaMV35S启动子的载体片段，以及Bam HI和Hind III双酶切ProPgJOX2启动子片段，其中胶回收和质粒提取步骤分别参见全式金公司质粒提取试剂盒和胶回收说明书。pBI121载体和ProPgJOX2启动子双酶切反应体系如下：
反应条件：37℃酶切10h，通过琼脂糖凝胶电泳分析后回收片段，将切除GUS基因CaMV 35S启动子的pBI121载体片段和ProPgJOX2启动子片段以T4 DNA连接酶并转化TOP10感受态细胞，通过卡那霉素筛选和Bam HI/Hind III双酶切鉴定，成功获得重组质粒，该重组质粒被命名为pBI121-ProPgJOX2::GUS。，连接体系及条件如下：
图2为ProPgJOX2启动子驱动GUS基因表达的载体表达框示意图，RB： T-DNA右边界；LB：T-DNA左边界；NOS-pro：NOS 启动子；NPTⅡ：卡那霉素抗性基因；NOS-ter：NOS 终止子；通过以上步骤，成功构建了植物表达载体pBI121-ProPgJOX2::GUS，为进一步的研究和应用奠定了基础。
实施例3 重组载体转化农杆菌及其转化愈伤组织
（1）重组载体转化农杆菌
将获得的pBI121-ProPgJOX2::GUS重组载体采用冻融法转化农杆菌A4，转化后的阳性克隆通过PCR进行筛选，并通过测序鉴定以确保成功，获得含有pBI121-ProPgJOX2::GUS的农杆菌。
（2）培养含pBI121-ProPgJOX2::GUS质粒的根癌农杆菌
在28℃下，将含有pBI121-ProPgJOX2::GUS质粒的农杆菌进行划线培养，约2天后进行单菌落挑选，将挑取的单菌落接种于含有50mg/L卡那霉素的YEB（发根农杆菌）液体培养基中，在28℃下振荡培养过夜。当OD600（在600nm波长处的吸光值）达到约0.6时，收集菌液，通过4000rpm离心10min，将菌液中的沉淀物重悬于1/2MS（无机盐为MS培养基的一半）液体培养基中。
（3）农杆菌介导pBI121-ProPgJOX2::GUS基因转化人参愈伤组织
取四年生人参新鲜根诱导的愈伤组织，分别放入含有pBI121-ProPgJOX2::GUS和pBI121的农杆菌A4侵染液中，处理5min，用无菌滤纸吸干菌液后，将愈伤组织置于1/2MS+2,4D（2,4-二氯苯氧乙酸）的培养基上，避光共培养，时间为5d。
实施例4 qRT-PCR分析基因转化的GUS基因表达水平及其活性
（1）qRT-PCR分析基因转化的GUS基因表达水平
取农杆菌与愈伤组织共培养5d后的人参愈伤组织，用无菌去离子水清洗并吸干表面水分，提取总RNA，使用oligod(T)18作为反转录引物，反转录合成cDNA，再进行qRT-PCR分析，检测GUS基因的表达水平。GUS基因所使用引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，而内参基因β-actin所使用引物为SEQ ID NO.8和 SEQ ID NO.9。
图3是通过qRT-PCR检测转化人参愈伤组织中ProPgJOX2启动子启动的GUS基因的表达水平，其中CaMV 35S为CaMV 35S启动GUS基因瞬时过表达的人参愈伤组织；TE表示ProPgJOX2启动GUS基因瞬时表达的人参愈伤组织；MeJA和PEG分别表示ProPgJOX2启动子启动GUS报告基因在100μM MeJA和10%PEG6000（平均分子量为6000的聚乙二醇）（模拟干旱胁迫）诱导下表达水平。通过比较和分析，我们发现TE中ProPgJOX2启动子具有启动GUS基因表达的活性，且GUS基因的表达受到MeJA和PEG的诱导。
GUS-F：5′-ATACCGAAAGGTTGGGCAGG-3′；（SEQ ID NO.6）
GUS-R：5′-CGGCAATAACATACGGCGTG-3′。（SEQ ID NO.7）
β-actin F：5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；（SEQ ID NO.8）
β-actin R：5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCTTGA-3′。（SEQ ID NO.9）
（2）ProPgJOX2启动GUS表达及其活性检测
取适量的新鲜人参愈伤组织，迅速在液氮中冷冻，然后在液氮中研磨成细粉，并立即加入GUS提取缓冲液，充分混匀，在4℃下以12,000rpm离心5分钟，取上清液至冰上。参考GUS活性测定试剂盒说明，取提取的蛋白上清液，加入适量37℃预热的GUS提取缓冲液里，再加入MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）底物，进行37℃温浴，在不同的时间点，将混合反应物加入反应终止液，测定样品液的荧光强度值。
图4是转化人参愈伤组织中ProPgJOX2启动子启动的GUS基因的表达的酶活性，通过比较和分析，我们发现ProPgJOX2启动子具有启动GUS基因表达的活性，在100μM MeJA和10%PEG6000（模拟干旱胁迫）处理后，GUS酶活性也得到了显著提高。
综上所述，通过酶活性检测，我们成功地验证了ProPgJOX2启动子具有启动GUS基因表达的活性，并且在MeJA和PEG的诱导下，GUS酶活性显著增加，这为进一步研究ProPgJOX2启动子的功能和调控机制提供了有力支持。
实施例5 ProPgJOX2启动子启动人参DDS基因在人参愈伤组织中瞬时表达
为了验证ProPgJOX2启动子驱动的人参DDS基因在人参愈伤组织中的瞬时表达效果，我们采用了以下实验步骤：
将pBI121-ProPgJOX2::GUS载体中的GUS基因序列替换为人参皂苷生物合成途径中的关键酶达玛烯二醇合成酶（DDS）基因（KJ939266）。参考实施例2中的方法，将转化后的载体转化人参愈伤组织。取共培养后的新鲜人参愈伤组织，清洗干净后60℃下干燥，研磨成细粉。用80%甲醇60℃浸提（1g:40mL），超声波提取3次，每次10min。60℃下蒸干甲醇，用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层，60℃下水浴蒸干正丁醇，用适量甲醇溶解后待测。
采用HPLC法进行人参皂苷含量测定，使用LC-MS 8050高效液相色谱仪，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱（1.7μm，2.1mm×50mm），流动相为乙腈:1%甲酸，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为3μL，检测波长为202nm。
以人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2和Rg3作为标准品，分别测定样品中的各皂苷单体的含量，以8种皂苷含量之和代表总皂苷的含量。
图5是ProPgJOX2启动子启动人参DDS基因在人参愈伤组织中瞬时表达后人参皂苷含量测定结果，其中CK为转空载体pBI121后的人参愈伤组织，为对照组；ProPgJOX2::DDS为ProPgJOX2启动子驱动的DDS基因转化后的人参愈伤组织，为实验组；与对照CK相比，ProPgJOX2::DDS中人参皂苷含量明显提高，增加1.91倍；与ProPgJOX2::DDS相比，ProPgJOX2::DDS+MeJA和ProPgJOX2::DDS+PEG中人参皂苷含量均明显提高，分别提高2.48和2.19倍；ProPgJOX2::DDS在MeJA和PEG（模拟干旱）处理后，人参皂苷含量分别增加1.23和1.28倍。
综上所述，实验结果表明ProPgJOX2启动子可以成功驱动DDS基因在人参愈伤组织中的瞬时表达，并且MeJA和干旱胁迫能有效促进ProPgJOX2驱动的人参皂苷合成与积累。这为利用ProPgJOX2启动子在提高人参对环境适应能力的同时增加人参中人参皂苷的含量方面提供了重要的应用价值。
以上所述仅是本发明专利的优选实施方式，本发明专利的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明专利的技术构思前提下所得到的改进和变换也应视为本发明专利的保护范围。
Claims (6)
1.一种增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子，其特征在于，所述ProPgJOX2启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子，其特征在于，所述ProPgJOX2启动子克隆的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子的重组载体，其特征在于，所述ProPgJOX2启动子与植物表达载体组成所述重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述植物表达载体为pBI121，所述重组载体为pBI121-ProPgJOX2::GUS。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方式为：pBI121载体中GUS基因上游的CaMV 35S启动子被ProPgJOX2启动子序列所替代而构建至pBI121载体中。
6.一种如权利要求1-2任一项所述的增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子或如权利要求3-5任一项所述的增强人参抗逆性的ProPgJOX2启动子的重组载体在提升人参对MeJA 和干早胁迫的适应能力并增加人参皂苷的含量的应用。
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