CN117683776B - 一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子及其在人参皂苷生物合成中的应用 - Google Patents
一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子及其在人参皂苷生物合成中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子及其在人参皂苷生物合成中的应用，属于植物基因工程技术领域，ProPgCOMT2启动子来源于茉莉酸甲酯和冠菌素诱导的人参发根，对低温和干旱胁迫具有响应性；将ProPgCOMT2启动子与植物表达载体组成重组载体pBI121‑ProPgCOMT2::GUS，GUS报告基因连接在ProPgCOMT2启动子下游，能有效地被驱动表达；通过将ProPgCOMT2启动子连接在人参的特定基因上游，可以显著提高这些基因的表达水平，并增强人参细胞对低温和干旱环境的适应能力，并且人参皂苷等次生代谢产物的生物合成及积累得到促进，从而显著提升了人参的药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子及其在人参皂苷生物合成中的应用。
背景技术
植物基因工程技术是当前生物技术领域研究的热点之一，其目标是通过改变植物的基因表达模式，实现对植物性状和产量的优化改良，启动子是基因表达调控的关键元件，在植物基因工程中发挥着重要的作用。通过深入研究不同类型启动子对基因表达的调控机制，有助于揭示植物生长发育和次生代谢产物的合成的过程，为利用植物基因工程技术改造植物提供理论支持。
人参作为一种极高药用价值的植物，其药理作用广泛，然而，人参的生长和皂苷成分的合成受到多种环境因素的影响，如温度、水分、光照等。其中，低温和干旱等胁迫环境会显著影响人参皂苷的合成和积累，进而影响其药用价值。因此，开发一种能够响应低温和干旱胁迫的启动子，用于调控人参在适应逆境的同时亦能提高皂苷的合成和积累，对于提升人参的药用价值具有重要意义。
目前，关于低温和干旱胁迫诱导的启动子虽有研究，但仍存在问题：这些启动子的响应范围有限，仅在特定的胁迫条件下有效；其调控机制尚不明晰，导致基因表达调控效果不稳定；并且缺乏针对人参皂苷合成相关基因启动子的研究和应用。鉴于此，发现并研究能够响应低温和干旱胁迫的人参皂苷合成相关基因的启动子，成为了迫切需要解决的问题。
迄今为止，ProPgCOMT2启动子尚未被研究人员发现，其活性和作用机制仍然不明。关于ProPgCOMT2启动子的克隆以及其在提高植物适应环境胁迫和人参皂苷生物合成调控方面的应用也未有报道，探究如何通过ProPgCOMT2启动子调节特定基因的表达，并进一步控制细胞内次生代谢产物的合成与积累，对于培育具备逆境适应能力的植物、提高高价值次生代谢产物的积累具有极大的应用潜力。
因此有必要系统地研究ProPgCOMT2启动子在增强植物对环境胁迫适应能力和促进次生代谢产物积累方面的作用，探索在低温、干旱等胁迫条件下该启动子对人参皂苷合成的具体影响，如果能够开发以ProPgCOMT2启动子为基础的人参皂苷合成调控技术，不仅能推动植物基因工程技术的发展，还将提升人参的药用和经济价值。
发明内容
为解决上述问题，本方案提供了一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子及其在人参皂苷生物合成中的应用，对ProPgCOMT2启动子的活性和作用机制进行深入研究，通过克隆ProPgCOMT2启动子并构建相应的重组载体，再将其与目标基因连接，实现对基因表达的调控效果。同时，基因工程技术验证ProPgCOMT2启动子在人参皂苷合成过程中的功能和作用机制。
为达到上述目的，本方案首先提供了一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子，所述ProPgCOMT2启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述ProPgCOMT2启动子克隆的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子的重组载体，所述ProPgCOMT2启动子与植物表达载体pBI121组成所述重组载体pBI121-ProPgCOMT2::GUS，所述重组载体在所述ProPgCOMT2启动子的下游连接有GUS 报告基因。
作为优选，所述低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子的重组载体的构建步骤为：用Bam HI/Hind III双酶切pBI121和ProPgCOMT2，回收pBI121载体和ProPgCOMT2启动子片段，将两片段连接并转化TOP10，通过筛选和鉴定成功后获得重组质粒。
作为优选，所述Bam HI和Hind III酶切位点的特异引物如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子或低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子的重组载体在促进人参皂苷合成与积累中的应用。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子或低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子的重组载体在增强人参细胞对低温和干旱环境的适应能力中的应用。
下面对本发明做进一步说明：
本发明提供的ProPgCOMT2启动子属于人参PgCOMT2基因的启动子，来源于人参（Panax ginseng C.A. Meyer）并命名为ProPgCOMT2，基因序列如SEQ ID NO.1所示，受茉莉酸甲酯（MeJA）、冠菌素（COR）、低温（4℃）和干旱（PEG）胁迫诱导，利用该启动子可以提高人参对环境胁迫的适应能力并提高人参皂苷的含量。
通过基因重组ProPgCOMT2启动子，启动人参皂苷生物合成调控基因，适度调节细胞中人参皂苷生物合成调控基因的表达水平，在提高细胞对环境适应能力的情况下，激活人参皂苷的生物合成，本发明所用的ProPgCOMT2启动子是DNA序列（SEQ ID NO.1），或者是与ProPgCOMT2启动子序列高度同源，且具有相同功能的DNA序列。
ProPgCOMT2启动子植物表达载体是ProPgCOMT2启动子DNA序列替换pBI121载体GUS基因上游的CaMV 35S启动子构成的pBI121-ProPgCOMT2::GUS重组载体。
总之，本发明利用ProPgCOMT2启动子较高的启动活性，且受低温和干旱胁迫的诱导，通过基因重组所述ProPgCOMT2启动子，控制人参细胞、组织和植株中人参皂苷生物合成及调控相关基因的表达，实现促进人参皂苷的合成，是一种比较有效的生产高价值人参皂苷的方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明基于转录组和基因组测序等技术发现人参中多个COMT家族基因及其启动子，通过农杆菌A4介导ProPgCOMT2启动子在人参愈伤组织中的表达，发现ProPgCOMT2启动子具有较高的启动活性，且受低温和干旱胁迫的诱导；基于这些研究结果可知，利用基因重组ProPgCOMT2启动子可以提高人参细胞中特定基因的表达水平，并对低温和干旱等逆境具有较强的适应能力。
（2）本发明利用ProPgCOMT2启动子调节在人参细胞内人参皂苷的含量，具体体现在ProPgCOMT2启动人参皂苷生物合成调控基因例如DDS基因但不限于该基因的表达进而实现对人参皂苷含量的调节，在提高细胞对不利环境适应的同时，诱导的人参皂苷的生物合成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1扩增的ProPgCOMT2启动子顺式作用元件分析图；
图2是实施例2中ProPgCOMT2启动子驱动GUS基因表达载体表达框示意图；
图3是实施例2中荧光定量PCR检测转化人参愈伤组织中ProPgCOMT2启动子启动的GUS基因的表达水平；
图4是实施例2中转化人参愈伤组织中ProPgCOMT2启动子启动的GUS基因的表达的酶活性；
图5是实施例3中ProPgCOMT2启动子启动人参DDS基因在人参愈伤组织中瞬时表达后人参皂苷含量测定结果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1 ProPgCOMT2启动子的克隆
1、人参根基因组DNA的提取
以四年生新鲜的人参根为材料，用自来水冲洗干净后，再以75%乙醇清洗30s进行消毒，最后以无菌水冲洗3次去除表面残留的微生物，以植物基因组DNA提取试剂盒提取人参基因组DNA。
2、PCR扩增克隆ProPgCOMT2启动子
将人参发根接种于1/2MS（无机盐为MS培养基的一半）固体培养基中25℃暗培养3周后，接种于1/2MS液体培养基中，120rpm、25℃条件下暗培养3周，再在培养液中分别加入终浓度为1μmol/L的COR（冠菌素）和100μmol/L的MeJA（茉莉酸甲酯），培养48h后收集人参发根，最后对人参发根进行转录组测序，根据筛选得到的人参基因序列信息设计ProPgCOMT2启动子PCR扩增引物，ProPgCOMT2启动子扩增所用的引物序列如下：
ProPgCOMT2-F1：5′-CTGTCGACTGATCCCCATTT-3′；（SEQ ID NO.2）
ProPgCOMT2-R1：5′-CTTTGCCAGTGCCTTCAATTT-3′；（SEQ ID NO.3）
以人参基因组DNA为模板,利用ProPgCOMT2-F1与ProPgCOMT2-R1引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下表1所示：
PCR反应的扩增条件如下表2所示：
PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分析，并对候选的电泳条带进行胶回收，再对胶回收产物进行测序，测序后获得序列长度为1816bp的基因片段。
对克隆的序列采用PlantCARE进行在线分析，其顺式元件分析结果见图1，结果显示克隆的ProPgCOMT2序列中含有启动子应有的基本元件（TATA-Box和CAAT-Box）、ABA响应元件（ABRE）、MeJA响应顺式作用调控元件（CGTCA-motif和TGACG-motif）、MYC结合位点（MYC）、MYB结合位点（MYB）、渗透压胁迫应答元件（STRE）和干旱诱导的MYB结合位点（MBS）多种顺式作用元件，ProPgCOMT2启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2 ProPgCOMT2启动子植物表达载体的构建及转化
1、ProPgCOMT2启动子植物表达载体的构建
（1）根据ProPgCOMT2启动子序列设计上下游分别含Bam HI和Hind III酶切位点的引物，上下游引物分别命名为ProPgCOMT2-F2和ProPgCOMT2-R2。
ProPgCOMT2-F2：5′-CGCGGATCCCTGTCGACTGATCCCCATTT-3′；（SEQ ID NO.4）
ProPgCOMT2-R2：5′-CCCAAGCTTCTTTGCCAGTGCCTTCAATTT-3′；（SEQ ID NO.5）
以实施例1所扩增的启动子为模板，引物ProPgCOMT2-F2和ProPgCOMT2-R2进行PCR扩增，PCR反应体系参考康为世纪生物科技有限公司的PCR反应MIX，具体如下表3所示：
PCR反应的扩增条件如下表4所示：
经过PCR扩增后的产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收大小约为1816bp左右的目标条带，再以Bam HI和Hind III对pBI121载体进行双酶切以获得切除GUS基因CaMV35S启动子的载体片段，同时用Bam HI和Hind III对以ProPgCOMT2-F2和ProPgCOMT2-R2引物扩增的产物进行双酶切，以获得ProPgCOMT2启动子片段，胶回收和质粒提取方法参见全式金公司质粒提取试剂盒和胶回收说明书，pBI121载体和ProPgCOMT2启动子双酶切反应体系如下表5所示：
反应条件：37℃酶切10h，通过琼脂糖凝胶电泳分析后回收片段，将切除GUS基因CaMV 35S启动子的pBI121载体片段和ProPgCOMT2启动子片段以T4 DNA连接酶连接，连接体系及条件如下表6所示：
16℃下连接过夜，连接产物转化以琼脂糖凝胶电泳进行分析，然后对候选的电泳条带进行胶回收，分别用Bam HI/Hind III双酶切pBI121和ProPgCOMT2，回收pBI121载体和ProPgCOMT2启动子片段，将两片段连接并转化TOP10（感受态细胞），通过卡那霉素筛选和Bam HI/Hind III双酶切鉴定成功后获得重组质粒，并将获得的重组质粒命名为pBI121-ProPgCOMT2::GUS，ProPgCOMT2启动子驱动GUS基因表达载体表达框示意图见图2，在图2中示意图为T-DNA区，是农杆菌侵染植物细胞时从质粒上导入植物细胞的一段DNA，包括左右边界序列，图中LB为左边界序列，RB为右边界序列，NPT II为新霉素磷酸转移酶基因，NOS-pro为胭脂碱合成酶基因nos 启动子，NOS-ter为胭脂碱合成酶基因nos终止子，ProPgCOMT2为ProPgCOMT2启动子，GUS为β-葡萄糖苷酸酶基因。
（2）重组载体转化农杆菌
将获得的pBI121-ProPgCOMT2::GUS重组载体以冻融法转化农杆菌A4，转化后阳性克隆以PCR进行筛选，再经测序鉴定成功后获得含pBI121-ProPgCOMT2::GUS的农杆菌。
2、农杆菌介导基因转化
（1）含pBI121-ProPgCOMT2::GUS质粒的根癌农杆菌培养
划线培养含有pBI121-ProPgCOMT2::GUS质粒的农杆菌，培养条件28℃，2d，挑取单菌落接种于含有50mg/L卡那霉素的YEB（发根农杆菌）液体培养基中，在28℃下振荡培养过夜，直到OD600（在600nm波长处的吸光值）值约为0.6，此时收集菌液，4000rpm离心10min，使菌体沉淀，将沉淀的细胞重悬于1/2MS液体培养基中，待用。
（2）农杆菌介导pBI121-ProPgCOMT2::GUS基因转化人参愈伤组织
取4年生人参新鲜根诱导的愈伤组织为材料，将这些愈伤组织分别放入含有pBI121-ProPgCOMT2::GUS和pBI121的农杆菌A4侵染液中，持续浸染5min，取出愈伤组织，用无菌滤纸吸干菌液，然后将愈伤组织置于添加了2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的1/2MS培养基上，进行避光共培养，持续5d。
（3）qRT-PCR分析GUS基因表达水平
取上述农杆菌与愈伤组织共培养5d后的人参愈伤组织，用无菌去离子水清洗吸干表面水分后，提取总RNA，以oligod(T)18为引物，反转录合成cDNA，qRT-PCR分析基因表达水平，GUS基因所用引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，内参基因β-actin所用引物为SEQ IDNO.8和 SEQ ID NO.9。
图3是荧光定量PCR检测转化人参愈伤组织中ProPgCOMT2启动子启动的GUS基因的表达水平，其中CK为野生型人参愈伤组织，作为对照；TE为ProPgCOMT2启动子启动GUS基因瞬时过表达的人参愈伤组织；MeJA、COR、PEG和4℃分别表示ProPgCOMT2启动子启动GUS报告基因在100μM MeJA、1μM COR、10%PEG6000（平均分子量为6000的聚乙二醇）（模拟干旱胁迫）和4℃（低温）处理48h后的GUS基因表达水平，以β-actin作为内参，对照CK中几乎没有检测到GUS基因表达，TE中ProPgCOMT2启动子具有启动GUS基因表达的活性，且GUS基因的表达受MeJA、COR、干旱和低温的诱导。
GUS-F：5′-ATACCGAAAGGTTGGGCAGG-3′；（SEQ ID NO.6）
GUS-R：5′-CGGCAATAACATACGGCGTG-3′。（SEQ ID NO.7）
β-actin F：5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；（SEQ ID NO.8）
β-actin R：5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCTTGA-3′。（SEQ ID NO.9）
（4）ProPgCOMT2启动GUS表达及其活性检测
取农杆菌介导转化后的新鲜的人参愈伤组织，用液氮将其迅速冷冻，研磨成细粉，再加入GUS提取缓冲液，充分混匀，4℃条件下12,000rpm离心5min，取上清液置于冰上，用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白的浓度。
参考GUS活性测定试剂盒操作步骤，取提取的蛋白上清液，加入适量37℃预热的GUS提取缓冲液里，再加入MUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸）底物，37℃温浴，在不同时间的混合反应物加入反应终止液，测定样品液的荧光强度值。
图4是本发明实施例2中农杆菌介导转化人参愈伤组织中ProPgCOMT2启动子启动的GUS基因的表达的酶活性，其中CK为野生型人参愈伤组织，作为对照；CaMV 35S为CaMV35S启动子启动GUS基因瞬时过表达的人参愈伤组织；TE为ProPgCOMT2启动GUS基因瞬时过表达的人参愈伤组织；MeJA、COR、PEG和4℃分别表示ProPgCOMT2启动子启动GUS报告基因在100μM MeJA、1μM COR、10%PEG6000（模拟干旱胁迫）和4℃（低温）处理48h后的GUS酶活性，结果显示ProPgCOMT2启动子具有启动GUS基因表达的活性，且GUS的活性受MeJA、COR、干旱和低温的诱导。
实施例3 ProPgCOMT2启动子启动人参DDS基因在人参愈伤组织中瞬时表达
将pBI121-ProPgCOMT2::GUS载体中的GUS基因序列以实施例2中双酶切的方法替换为人参达玛烯二醇合成酶（dammarenediol-II synthase，DDS）基因（KJ939266），其中DDS为人参皂苷生物合成途径中的关键酶。参考实施例2中方法农杆菌介导转化人参愈伤组织，取共培养后的新鲜的人参愈伤组织，用去离子水清洗干净，然后在60℃下干燥至恒重，将干燥后的愈伤组织研磨成细粉，用80%甲醇在60℃下浸提（比例为1g:40mL），超声波提取3次，每次10min，以便充分提取其中的皂苷成分。60℃下蒸干甲醇，然后用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层，60℃水浴蒸干正丁醇，用适量的甲醇溶解后待测。
人参皂苷含量的测定采用HPLC法。具体色谱条件如下：使用LC-MS 8050高效液相色谱仪；色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)；流动相为乙腈:1%甲酸，流速为1.0mL/min，保持柱温在35℃，进样量为3μL，检测波长为202nm。
以人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2和Rg3作为标准品测定样品中的各皂苷单体的含量，再以各皂苷单体含量之和代表人参细胞中总皂苷的含量。
图5是ProPgCOMT2启动子启动人参DDS基因在人参愈伤组织中瞬时表达后人参皂苷含量测定结果；其中CK为转空载体pBI121后的人参愈伤组织，作为对照；ProPgCOMT2::DDS为ProPgCOMT2启动子驱动的DDS基因转化后的人参愈伤组织，作为实验组；Water指的是以水处理48h后的皂苷含量，4℃指的是以4℃处理48h后的皂苷含量，PEG指的是以10%PEG6000（模拟干旱胁迫）处理48h后的皂苷含量；与对照CK相比，ProPgCOMT2::DDS中人参皂苷含量明显提高，增加1.66倍；与ProPgCOMT2::DDS相比，ProPgCOMT2::DDS+4℃和ProPgCOMT2::DDS+PEG中人参皂苷含量均明显提高，分别提高1.86和2.09倍。这表明ProPgCOMT2启动子可以启动DDS基因表达的同时，干旱胁迫和低温均能有效促进ProPgCOMT2驱动的人参皂苷合成，为利用ProPgCOMT2启动子在提高人参对环境适应能力的同时增加人参中人参皂苷的含量方面具有重要应用价值。
以上所述仅是本发明专利的优选实施方式，本发明专利的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明专利的技术构思前提下所得到的改进和变换也应视为本发明专利的保护范围。
Claims (5)
1.一种低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子，其特征在于，所述ProPgCOMT2启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子，其特征在于，所述ProPgCOMT2启动子克隆的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.一种包含权利要求1所述的低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子的重组载体，其特征在于，所述ProPgCOMT2启动子的重组载体是ProPgCOMT2启动子DNA序列替换pBI121载体GUS基因上游的CaMV 35S启动子构成的pBI121-ProPgCOMT2::GUS重组载体。
4.一种如权利要求1 -2任一项所述的低温和干旱诱导的ProPgCOMT2启动子在启动人参皂苷生物合成调控基因DDS促进人参皂苷合成与积累中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：ProPgCOMT2启动子启动人参皂苷生物合成调控基因DDS在低温和干旱胁迫下促进人参皂苷合成与积累。
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