CN102925459A - 人参PgPDR3基因及其编码蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种促进人参皂苷转运与积累相关基因PgPDR3及其编码蛋白和应用。该人参皂苷转运与积累相关基因PgPDR3序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究发现PgPDR3基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累密切相关。所述PgPDR3基因在促进人参皂苷合成、转运和积累方面有显著的效果。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参及其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参转基因细胞或植物生产原人参二醇、Rb、Re、Rh2、Rg2和Rg3等人参皂苷单体。

Description

人参PgPDR3基因及其编码蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及改良植物性状，具体是促人参皂苷生物合成、转运与积累的相关基因及其蛋白和应用。本发明在提高人参等植物中人参皂苷含量方面有着重要的应用价值。

背景技术

人参（P.ginseng C.A.Meyer）为五加科人参属多年生草本植物，是名贵中药材。人参中含有多种药用成分，其中人参皂苷是人参最主要的活性成分。目前已从人参根中分离出50余种人参皂苷，现代医学研究证明各皂苷单体具有重要的药用价值，且已广泛应用于临床。但是其中一些具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性强的皂苷含量极低。近年来，国内外对利用人参细胞培养等技术生产人参皂苷进行了广泛和深入的研究，但其含量仍较低，远不能满足市场的需求。

在植物次生代谢调控中，可以通过导入关键酶等基因调控合成途径中的多步限速反应，并促进次生代谢产物的合成；或通过诱导跨膜转运蛋白将合成的代谢产物转运到细胞外或细胞器中得以积累，利用转运系统使合成代谢向积累方向转变，从而提高次生代谢产物含量。通过人参皂苷的转运机制，进而促进人参皂苷合成与积累，有望成为人参皂苷高产调控的新策略。

植物ABC（ATP-binding cassette transporter）转运蛋白是目前已知最大，功能最广泛的蛋白家族，ABC转运蛋白属于跨膜运输蛋白，利用水解ATP释放的能量转运有机酸、生物碱、细胞代谢产物和药物等。参与细菌耐药性、次生代谢产物积累、胁迫反应和肿瘤抗药性等。ABC转运蛋白家族包括多向耐药性蛋白（pleiotropic drug resistance，PDR），多药耐药性蛋白（multidrug resistance，MDR）等。PDR是其中最大的亚族，是植物和真菌中特有的一种ABC转运蛋白。但目前对植物PDR基因相关研究甚少，离体细胞培养中，香紫苏醇可诱导NpPDR1基因上调表达，在细胞内NpPDR1蛋白累积增强了细胞向胞外转运香紫苏醇以及其类似物的能力。拟南芥（A.thaliana）细胞内香紫苏醇的累积亦能诱导AtPDR12基因上调表达，同时在细胞外检测到AtPDR12蛋白向胞外转运的香紫苏醇，推测萜类物质可能是AtPDR12基因表达的上游调控物质。因此，PDR蛋白可能通过转运内源性抗真菌二萜类物质参与植物防御反应。此外，尚无植物PDR蛋白转运更复杂萜类分子的报道。

发明内容

本发明旨在提供一种能够调控人参皂苷转运与积累相关的基因、由该基因编码的蛋白及其应用，为今后开发基因工程产品奠定基础。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种人参PgPDR3基因，基因序列如SEQ ID N0.1所示。

本发明还提供了一种用于扩增PgPDR3基因的简并引物对，所述引物对如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。

本发明还提供了含有PgPDR3基因重组载体，具体包括：植物表达载体pBI121，即，将PgPDR3基因克隆到空载体pBI121中，获得重组载体pBI121-PgPDR3；原核表达载体pET28a，即，将PgPDR3基因克隆到空载体pET28a中，获得重组载体pET28a-PgPDR3。PgPDR3基因亦可克隆到其他空载体中，或制备成转基因细胞及重组菌。

本发明还提供了PgPDR3基因在调控人参皂苷转运与积累中的应用；PgPDR3基因在人参育种中的应用。

本发明还提供了一种由SEQ ID NO.1所示PgPDR3基因编码的蛋白，该蛋白的序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供了SEQ ID NO.2所示蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用，以及该蛋白在人参育种中的应用。

本发明利用现有的植物基因工程技术，利用植物PDR基因同源性设计简并引物，利用cDNA-AFLP及RACE技术，分离与鉴定人参皂苷转运与积累相关的基因序列，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过异源表达鉴定证明PgPDR3基因对人参皂苷的转运功能。本发明人参ABC转运蛋白基因PgPDR3序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。研究发现PgPDR3基因表达具有组织特异性且与人参皂苷的积累有关。初步表明所述PgPDR3基因具有促进人参皂苷合成、转运和积累方面的功能。可以通过该基因或其衍生物筛选或改良人参甚至其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。亦可以采用人参组织培养或转基因植物生产Rb、Re和Rg等人参皂苷单体。附图说明

图1是本发明的PCR扩增PgPDR3基因图示；图中，1表示简并引物PCR扩增产物，M表示Marker；

图2是本发明的PgPDR3蛋白跨膜结构域预测图；

图3是本发明的PgPDR3基因编码氨基酸序列及其与其它植物PDR基因同源性比较图；

图4是本发明的PgPDR3基因编码氨基酸序列进化树分析图；

图5是本发明的PgPDR3基因在人参不同组织中的表达水平图；

图6是本发明的PgPDR3基因在100μM MeJA诱导条件下的人参细胞中表达水平图。

具体实施方式

实施实例1 PgPDR3基因的获得

1、人参悬浮细胞培养

（1）取吉林长白山人参产区四年生人参根，自来水浸泡45min后冲洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒（sec），无菌水冲洗2次，无菌室超净工作台上用0.1%HgCl₂消毒，不断搅动，无菌蒸馏水冲洗4-5次。

（2）在无菌条件下，将消毒过的外植体接种到含有2，4-D（2.0mg/L）和KT（0.5mg/L）的MS培养基中。经3次继代培养后外植体完全脱分化，待完全形成愈伤组织后，每100ml三角瓶接种6个外植体，培养条件如前述，培养45天（d）后将愈伤组织行继代培养，以补充培养物所需的营养物质和其它要求。接种30d后进行第一次继代培养，以后每3-4周继代一次。

（3）当得到愈伤组织后，将其转入到MS液体培养基中。愈伤组织块直径应小于3mm。若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在50ml的锥形瓶内，每10ml液体培养基接种1.5-2.0g愈伤组织，接种后震荡培养，120rpm，24℃，暗培养。每隔4-7d继代一次。

2、细胞处理及其RNA提取

（1）细胞处理

1）取460μL茉莉酸甲酯（MeJA）溶于4540μL乙醇，加5ml双蒸水至10ml，配成10ml 200mM的MeJA母液，用0.22μm的滤器过滤除菌，处理组每10ml液体培养基加入10μL母液至终浓度为200μM；取4540μL乙醇加入双蒸水中定容至10ml做为对照，用0.22μm的滤器过滤除菌后，对照组每10ml液体培养基加入10μL。

2）在悬浮细胞继代的48h后按以上方法处理处理组与对照组的细胞，120rpm，24℃，振荡暗培养，培养24h后分别提取处理组的对照组的人参细胞的总RNA。

（2）人参悬浮细胞总RNA提取

①3000×g离心5min收集的悬浮细胞，在研钵内用液氮充分研磨成粉末。每40mg研磨的粉末置于1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol试剂，40μL β-巯基乙醇，用移液器吸头重悬细胞沉淀，室温孵育5-10min。

②加入0.2ml氯仿，振摇l5sec，室温孵育10-15min。

③4℃、12000×g离心15min，收集上层无色水相于1.5ml离心管中，勿吸动中间层，弃沉淀。

④加入0.4ml 3mol/L醋酸铵（pH5.2），0.6ml异丙醇，轻柔振荡混匀，室温孵育5-10min（RNA沉淀）。4℃、12000×g离心10min，弃上清。

⑤加入1ml 75％乙醇并振荡；4℃，7500×g离心5min，弃上清，重复该步骤。

⑥空气中干燥10min，加入20μL DEPC水溶解RNA。

⑦RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在0.5×TBE中进行，琼脂糖浓度为1％（每100ml凝胶中加入2.5μL的10mg/ml EB），4μL上样量，8v/cm恒压40min，然后在紫外凝胶成像系统中观察所提取RNA的完整性。

（3）mRNA的纯化

①取人参悬浮细胞总RNA200μg，用DEPC水补至500μL，65℃水浴10min后，加入3μL生物素酰化的oligo(dT)探针与13μL20×SSC溶解并孵育至室温，使生物素酰化的oligo(dT）探针与mRNA分子poly(A)尾充分杂交。

②悬浮于管中的链亲和顺磁珠（Stroptavidin-Paramagnetic Particles，SA-PMPs）用0.5×SSC溶液洗涤3次，0.3ml/次，然后重悬于0.1ml 0.5×SSC中。

③将上述经处理的RNA溶液与SA-PMPs混合，室温孵育10min，每12min混匀一次，用磁力架收集含有RNA的SA-PMPs，弃上清。

④用0.1×SSC溶液重复洗涤SA-PMPs 4次，其中0.3ml/次，用磁力架收集SA-PMPs并弃上清。

⑤加入100μL DEPC水重悬SA-PMPs，磁力架收集SA-PMPs，吸取水相。再加入150μL DEPC水重悬SA-PMPs，磁力架收集SA-PMPs，吸取水相。

⑥收集合并以上两次的水相，加入1/10体积3M NaAc和等体积异丙醇，震荡混匀，-20℃静置1h。

⑦4℃，12000×g离心20min，弃上清。

⑧用75%乙醇8000×g，5min，洗涤沉淀两次，1ml/次。

⑨mRNA空气中自然干燥10min，用20μLDEPC水溶解。

3、cDNA合成

纯化mRNA后，以oligo(dT)为引物，M-MuLV反转录酶反转录总mRNA。

（1）反应体系如下:

（2）轻柔搅拌混匀；室温放置10min后，移至恒温水浴箱；42℃，1h；结束后，冰上冷却2min。

4、cDNA-AFLP

（1）cDNA第二链的合成以及末端平滑化

①在第一条cDNA合成后的离心管中按下列顺序配制合成cDNA第二条链的反应液:

②16℃反应2h。

③70℃加热10min。

④加入4μL的T4DNA Ploymerase，轻轻搅拌。

⑤37℃反应10min。

⑥加入15μL的0.25M EDTA（pH8.0）以及15μL的10%SDS溶液，终止反应。

（2）合成的cDNA的精制

①在上述反应液中加入等量（180μL）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液。

②剧烈振荡混匀。

③在室温条件下12000×g离心5min，液体分为三层。小心取出水相（上层），移至另外一个新的1.5ml离心管中。

④向水相中加入等量的氯仿/异戊醇（24：1）溶液，剧烈振荡混匀。

⑤在室温下12000×g离心5min，液体分为二层。小心取出水相移至另外一个新的1.5ml离心管中。

⑥加入150μL的4M醋酸铵，2.5体积的乙醇，充分混匀，室温下放置10min。

⑦在4℃下14000×g离心20min，去上清。

⑧用1ml 70%乙醇8000×g离心5min，重复2次。

⑨用适量的TE缓冲液溶解。

（3）cDNA酶切消化

①将上一实验步骤合成的cDNA与以下试剂混合于1.5ml的反应管中：

②轻柔混匀后短暂离心，37℃，水浴2h。

③70℃，水浴15min结束酶切反应。

（4）接头连接

①在上一步的反应管中加入24μL adapter ligation solution和1μL的T4DNA ligase。

②轻柔混匀后短暂离心，20℃左右水浴2h。

③将10μL反应液转移至1.5ml的离心管中，加入90μL的TE缓冲液，使连接反应液稀释10倍，轻柔混匀后短暂离心。

④连接反应液于-20℃保存。

（5）cDNA-AFLP预扩增、选择性扩增和电泳分析

将连接接头的产物稀释10倍，进行预扩增。预扩增引物为:EcoRI引物:5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’（SEQ ID NO.3），Mse I引物:5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’（SEQ ID N0.4）;预扩增反应条件为:94℃，30s，56℃，1min，72℃，1min，20个循环。将预扩增产物稀释20倍，再选用8条选择性扩增E引物和8条M引物进行选择性扩增。其中8条E引物与预扩增的EcoR I引物匹配，8条M引物与Mse I引物匹配;每条选择性EcoR I引物（E引物）分别与选择性Mse I引物（M引物）进行组合，共有64个引物对组合。用于选择性扩增的引物如下:

E引物为5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’序列的3’端分别加AC、AG、CA、CT、CC、CG、GC和GG）;M引物5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’序列的3’分别加AA、AC、AG、AT、TA、TC、TG和TT）。

cDNA-AFLP选择性扩增采用“touchdown”PCR，条件为:94℃，1min；94℃，30sec，65℃，1min，72℃，90sec;每循环一次，退火温度降低1℃，至56℃后循环23次。对照组和MeJA处理组的各引物组合均重复3次选择性扩增反应。然后将三次重复反应产物合并，加入1/10体积的3M NaAc，再加入3倍体积预冷的无水乙醇沉淀；70%乙醇洗2次，沉淀重悬于20μL双蒸水，2%琼脂糖凝胶电泳分析。

（6）差异表达条带二次扩增和克隆

从琼脂糖凝胶中切出明显差异的条带，采用胶回收试剂盒回收差异表达片段，以回收片段为模板进行二次PCR扩增，PCR反应体系及程序与选择性扩增相同。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收并与pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α，提取单菌落质粒。对质粒进行双酶切鉴定和PCR检测，检测无误后送上海英骏公司测序。测序后获得序列长度为439bp，测序结果经Blast比对，与其他植物PDR基因高度同源。

5、cDNA全长扩增

根据cDNA-AFLP扩增获得的439bp PDR基因序列设计5’端和3’端扩增引物，5’-RACE引物（GSP5-1）和3’-RACE引物（GSP3-1）分别为：

GSP5-1：5’-TGCCCGCCTGAGATACCCCTTACCA-3’，（SEQ ID N0.5）

GSP3-1：5’-CAGGCGGGCAAATGAAGCGTGTTAC-3’。（SEQ ID N0.6）

①RNA提取及其反转录

RNA提取采用上述方法进行，反转录采用SMART RACE cDNA AmplificationKit中反转录酶和引物。

②5’端扩增反应体系

③5’端扩增反应条件

94℃  2min，1 cycles:

94℃  30sec，72℃  1min 30sec，5 cycles;

94℃  30sec，70℃  30sec，72℃  1min 30sec，5 cycles;

94℃  30sec，68℃  30sec，72℃  1min 30sec，20 cycles

④3’端扩增体系

⑤3’端扩增反应条件

94℃ 2min，1cycles:

94℃ 30 sec，72℃4 min，5 cycles;

94℃ 30 sec，70℃30 sec，72℃4 min，5 cycles;

94℃ 30 sec，68℃30 sec，72℃4 min，20 cycles

⑥电泳及其测序

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，胶回收并与pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α，提取单菌落质粒。对质粒进行双酶切鉴定和PCR检测，检测无误后送上海英骏公司测序。测序后获得5’端cDNA长度为1043bp，3’端cDNA长度为3482bp，经拼接后得到包含完整编码框的全长为4515bp的序列（PgPDR3），提交到Genbank，登录号为KC013238。

6、序列分析

经过测序成功获得了长度为4515bp的cDNA序列，利用NCBI中在线分析工具BLAST和ORFFinder（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi和http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）进行比较和ORF查找发现该序列中CDS序列长度为4137bp，对其编码的氨基酸序列采用CLUSTALX软件分析比较，与其他植物PDR基因如大豆（GmPDR1，XM003546171）、烟草（NpPDR1，AJ404328；NtPDR1，AB109388.1和NpPDR2，BAD07484.1）、水稻（OsPDR1，AJ535054；OsPDR2，AJ535053和OsPDR3，AJ535052）有较高的同源性。利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在线分析软件分析跨膜结构域，结果显示该蛋白为跨膜蛋白。并使用MEGA4软件以邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发生树。系统树中分支的置信水平用自引导值（Bootstrap test）估计，重复1000次，结果显示该基因与大豆的PDR基因亲缘性最近，其次是烟草和水稻。

7、表达分析

取新鲜的人参的根、不定根、芽、种子和发根，分别提取RNA；再以100μMMeJA分别诱导人参根0、1、3、6、12和24h，提取各时间点人参根总RNA。以oligod（T）18为引物，AMV反转录酶合成cDNA，并以β-actin为内参，利用real-time PCR扩增PgPDR3基因，PgPDR3和β-actin扩增引物分别为：

PgPDR3：F：5’-GTGGGGCTGGGAAGACCACTCT-3’；（SEQID N0.7）

R：5’-GCTCCCAGTATCCTGCTATGCGA-3’；（SEQ ID N0.8）

βactin：F：5’-CGTGATCTTACAGATAGCTTCATGA-3’；（SEQID N0.9）

R：5’-AGAGAAGCTAAGATTGATCCTCC-3’。（SEQ ID N0.10）

反应体系为：

采用两步法PCR扩增标准程序:95℃30sec；95℃40sec，60℃30sec共40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃15sec。每个样品三次重复。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，采用2^-ΔΔCt方法计算PgPDR3基因在不同组织和MeJA诱导下不同时间表达水平的差异。结果显示其在发根中表达最高，其次是根、不定根和种子，芽中表达最低。MeJA可以显著诱导人参皂苷的合成，MeJA诱导24h，PgPDR3基因表达迅速增加至10倍以上，PgPDR3表达与人参皂苷的合成密切相关。

实施实例2表达载体的构建及转化

1、植物过表达载体的构建及转基因植株筛选

（1）分别用BamH I和Sac I双酶切pBIl2 1和PgPDR3，回收pBIl2 1载体和PgPDR3基因片段。将两片段连接并转化DH5α，筛选出重组子，重组质粒命名为pBI-PgPDR3。其中扩增PgPDR3基因的上下游引物分别为：

PgPDR 3：F1:5’-CGGGATCCCGCACCATGGCATTAAAAAGTAGCAG-3’；（SEQID N0.11）

R1:5’-CGCGAGCTCGGCCATTTTGTTATCTCTTTTGG-3’。（SEQ IDN0.12）

其中划线部分为BamH I和Sac I酶切位点。

（2）根癌农杆菌感受态细胞的制备

①在含有100μg/ml利福霉素的YEB平板上划线培养农杆菌LBA4404，28℃暗培养2d。

②挑取单菌落接种到含有100μg/ml利福霉素的YEB培养基中，28℃振荡培养过夜。

③将过夜活化的农杆菌按l:50的比例稀释到50ml含有100μg/ml的卡那霉索的YEB培养基中，28℃振荡培养至OD600约为0.4-0.6，冰浴30min。

④于4℃，5000rpm离心10min，弃上清液，用10ml0.15mMNaCl悬浮菌体。

⑤于4℃，5000rpm离心10min，弃上清液，用2ml20mMCaCl₂悬浮菌体。

⑥每管200μL分装，液氮速冻，-70℃保存。

（3）根癌农杆菌感受态细胞的转化

①将根癌农杆菌感受态细胞置于冰上，缓慢解冻。

②加入0.5μgpBI121-PgPDR3质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min。

③置液氮中冷冻2min，迅速移入37℃水浴中热激5min，再迅速冰浴2min，之后加入800μLYEB液体培养基，于28℃振荡培养3-4h。

④5000rpm离心5min沉淀菌体，弃掉800μL上清后重新悬浮菌体，均匀涂布于含有100μg/ml利福霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB培养基上，28℃培养2-3d。

（4）根癌农杆菌质粒提取和鉴定

①PCR鉴定

挑取转化的农杆菌单菌落接种于1.5ml含卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养，用PgPDR3基因特异性引物：

F：5’-GTGGGGCTGGGAAGACCACTCT-3’；（SEQ IDN0.7）

R：5’-GCTCCCAGTATCCTGCTATGCGA-3’；（SEQ IDN0.8）

进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。PCR反应程序如下：94℃30sec，55℃45sec，72℃30sec，35个循环；72℃2min。

②酶切鉴定

挑取农杆菌单菌落接种于含有100μg/ml的利福霉素和50μg/ml的卡那霉素的YEB培养基中，28℃培养过夜培养，提取重组质粒pBI121-PgPDR3，采用上述方法以BamH I和Sac I酶切提取的质粒。

（5）含pBI121-PgPDR3质粒的根癌农杆菌培养

28℃划线培养含有pBI121-PgPDR3质粒的农杆菌约2d。挑取单菌落接种于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，至OD600约为0.6时收集菌液，4000rpm离心10min，沉淀重悬于1/2MS液体培养基中。

（6）叶盘法侵染烟草

将烟草幼叶置于自来水中冲洗3-4次，然后在70％乙醇中浸泡30-60sec，10％次氯酸钠中消毒10-20min，再用无菌水充分冲洗，然后置于无菌培养皿中，将叶片切成0.5-lcm²的小片，将剪好的叶片分别放入含有pBI121-PgPDR3质粒的农杆菌菌液中侵染5min，将叶片上的菌液用无菌滤纸吸干。

（7）共培养

侵染过并吸干表面菌液的叶盘，气孔面朝上，紧靠着放在共培养基上（MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L），黑暗处培养2d。

（8）筛选及分化培养

暗培养2d后，转换到筛选分化培养基上（MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L+Kan100mg/L+Cef300mg/L），每15d换一次筛选分化培养基，至分化出的烟草长至3-5cm时转至生根培养基中。

（9）生根培养

将分化至3-5cm的烟草分别切下，转移至生根培养基（1/2MS+IBA 2.0mg/L）。

（10）移栽

当再生植株的根长至5-8cm时，打开封口膜炼苗2-3d，将幼苗移栽至花盆内，移栽后最初的5-l0d罩上透明塑料，保持90%-100%的湿度，并在罩上打些小孔以利于气体交换。移栽的基质以及花盆均预先消毒。

（7）转基因植株PCR鉴定

以转基因植株的基因组DNA为模板，采用上述重组质粒鉴定所用的PgPDR3基因特异性引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同上。经鉴定得到分化成苗的T₀代阳性转基因植株。

2、转运功能鉴定

取转PgPDR3基因的烟草幼叶，采用上述相同方法诱导产生悬浮细胞，利用人参皂苷饲喂及比较植物功能基因组学技术，通过通过气相色谱-质谱联用(gaschromatography-mass spectrometry，GC/MS)法直接定量测定并比较分析转基因烟草培养系中人参皂苷化学成分谱表型的改变，确定PgPDR3转运蛋白对人参皂苷的转运功能。

3、原核表达分析

（1）PCR扩增

以已扩增的PgPDR3基因为模板，以上下游分别添加EcoR I和Hind III酶切位点序列的引物进行扩增，其扩增所用的引物如下（划线部分分别为EcoR I和HindIII酶切位点）：

F:5’-CGGGA ATTCATGGCATTAAAAAGTAGCAG-3’；（ SEQ ID N0 13）

R:5’-CCCAAGCTTGGGCATTTTGTTATCTCTTTTGG-3’。（SEQ ID N0.14）

反应体系同上，PCR反应程序如下：94℃30sec，55℃45sec，72℃4min30sec，35个循环；72℃10min。

（2）酶切、连接转化及其筛选

分别用EcoR I和Hind III双酶切pET28a和PCR产物，回收pET28a和PCR产物片段。将两片段连接并转化BL21，通过卡那霉素筛选、PCR扩增和酶切鉴定出重组子，重组质粒命名为pET28a-PgPDR3。

（3）PgPDR3蛋白诱导表达及其功能分析

挑取含有重组pET28a-PgPDR3质粒的菌落BL21(DE3)，至l0mlLB（含Kan50μg/ml）中37℃过夜培养。取lml菌液加入到含100m1 LB培养基(含Kan50μg/ml)，37℃震荡培养至OD600约为0.4-0.6。加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导，每隔1h收集一次菌液，5000×g离心10min，收获沉淀，以1g菌体加入4ml PBS缓冲液的比例重悬，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴5min取上清进行SDS-PAGE分析。

选取PgPDR3蛋白表达量高的时间点，加入人参皂苷等底物，分析PgPDR3蛋白的转运功能，并结合His-tag进行蛋白纯化，体外解析其结构。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中南大学

<120>  人参PgPDR3基因及其编码蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用

<160>  14   

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  4137

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  1

atggcattaa aaagtagcag tacaagtcct tcaatgtgga ggactaatgg tatggaagtt     60

gatattcaca atcttggact caaggagaag aaagatttac tagagaggct agtcagagtt    120

gctgaagaag ataatgaaaa gtttttgtac aagctcaggg atcgagttga tagagttgga    180

attgaattgc ccacgattga agtcagattt gagcatttaa atgttgatgc agaagcttat    240

gtaggaagca gagctctgcc tactttctgg aacttctatg tcaatctatt agaggggttc    300

ttgaattatc tccgcatact tccaaataga aagaagcatc ttcctatcct tcgtgatgtg    360

agtggaatcc tcaagccctg cagaatgaca ttacttttag gtcctccaag ttgtggcaaa    420

acaacattgt tgctggcttt agctggcaag cttgatcctg accttaaatt ttcaggaaat    480

gtgacttaca atggccatgg catgcatgaa ttcgtacccc agagaacggc tgcctatatc    540

agccaaaatg attgtcatat aggagaaatg actgtgagag aaaccttggc tttctctgca    600

atgtgtcagg gagttggatc gcgttatgag atgctggcag agctgttaag aaaggagaaa    660

gaagccaata ttaagcccga tcctgacatt gatatcttta tgaaggctgc cgcgacagaa    720

ggtcaagagg ccagtgtggt cacagattac attctaaagc ttttggggct ggaagtctgt    780

gcagatacta tggtaggaaa tgaaatggta aggggtatct caggcgggca aatgaagcgt    840

gttactactg gtgagatgtt ggttggacca tcaaaggcac tttttatgga tgagatatct    900

aatggactgg acagttcaac aacttatcag attgtgaatt cactgcggca tagtgtccac    960

attcttcagg gaactgccct catctctctc ctgcagccag cacctgaaac ttatgatttg   1020

ttcgatgata ttattctcct atcggatggc catatagtgt atcagggttc ccgtgaaaat   1080

gtgcttgagt ttttcgagtc tatgggcttc aagtgtccag agaggaaagg tgtggcagac   1140

ttcttgcaag aagtgacatc caagaaagat cagaaacaat attggttaca taaagatgaa   1200

ccatacagat ttattagtgc ccacgaattt gctaaagctt acaaatcatt ccatgttgga   1260

caaaaaatgg gagatgatct tgaaacacca ttcgacaaga gcaaaagtca cccagccgct   1320

ttgacaacaa ataagtatgg tgttgggaag agggagctct taaaagcttg tacctctaga   1380

gaaattttgc ttatgaaaag aaagtctttt gtttacatct ttaaattgtc ccaacttttc   1440

ataacggcct tgattaccat gacactgttc ctgagaacta agatgcaaca gaattcagta   1500

aatgacggag ggatatatac tggtgcattg ttcttcacag tgagtacgac tataataaat   1560

ggaatggcag agatttcctt gacagttgca aagattcctg tctttcataa gcaaagggac   1620

cttctctttt atcccccatg gtcatatgct cttccgtcat ggatcatcaa gatccccatt   1680

tcatttgttg aagttgccct gtgggtattt ctcacttact atgttattgg atatgatcca   1740

aatgctggaa gattgtttaa gcagtactta ctactcgtac tcgtcaacca gatggcttct   1800

gcattattcc gattgcttgg ggcagtgggt aggaatatga ttgttgcaaa cacatttggt   1860

gcatttgcag tgcttattct ttatgcactc ggaggcttta tcctatcacg agtgaatgta   1920

aagaagtggt ggttatgggg tttctggtca tcaccaatta tgtatgggat gaatgcaatt   1980

gcagtgaatg aatttcttgg ggatcaatgg aataattttc tcccaaatac aacagaacca   2040

ctaggagttg caattctaaa gtcacgaggt ttcttcccgt atgcatattg gtattggata   2100

ggagtagtgg cattgcttgg attcgtactg ctacttaatt tatgcttcac aatggctctc   2160

agttatctca atcctctagg gaagcctcaa gctgttatag cggaagaacg ctacactgca   2220

gtggccactg acttctcatc catatcagaa gatcatatca gtagaaaaga atccattgta   2280

aaagctaatc agaacaagaa aaaaggaatg gttcttcctt ttgaaccgca ctccataacc   2340

tttgatgaaa ttaaatattc tgttgacatg cctcaggaaa tgaaagacca aggcgttgtt   2400

gaagatagat tgatgcttct gaaaggtgtg agtggagcat tcaggccagg cgttctcact   2460

gcactaatgg gtatcagcgg tgctggtaaa acaactctga tggatgtgct ggcaggtaga   2520

aaaactggtg gatacattga gggtcacatt acaatttccg ggtatccaaa aaggcaagaa   2580

acctttgctc ggatttctgg atactgtgag cagaatgaca ttcactcgcc tcatgttact   2640

gtctacgagt ccttgctcta ctcagcatgg cttcgcctac ctccagaagt tgattctgag   2700

accagaaaga tgtttgtcga agaggtcatg gaacttgtgg aactgaaatc attgagggat   2760

gcactcgttg ggttgccagg tgtaaatggc ctctcaactg agcagcgaaa gaggctaact   2820

attgcagttg agctggtggc aaacccatcc ataatattca tggacgagcc aacttcaggt   2880

ttggatgcaa gagctgctgc aatcgtgatg agaacagtca ggaatacagt agatactgga   2940

agaactgttg tttgcaccat ccatcagcca agcattgaca tatttgaagc ttttgatgag   3000

ttattactga tgaagcaagg aggacaggag ttatatgtag gaccagtggg tcgggactct   3060

tgccagttaa tcaagtactt tgaggaaatt gaaggaataa gtaaaatcaa agatggatac   3120

aatccagcca cctggatgtt ggaagttact agttctaagc aagaaatgat tcttggggtt   3180

gatttcaatg aagtgtacaa gaactcacat ttatacagga gaaacaaagc ttgcattaag   3240

gaactaagta caccttctcc tcgatcgaag gatctctatt ttcctaccat atactcgcag   3300

tctttcctca accaatgtgt cgcatgctta tggaaacagc gacggtccta ctggcgaaat   3360

ccaccctaca ctgcagtccg attcctcttc acaactttca tagcgttagc gtttggaaca   3420

atgttctggg atcttggttc caaaatgaaa actaaacaag atctcttcaa tgcaatggga   3480

tctatgtatg ccgcggttct cttcattggc tatcaaaatg cctcgtcagt gcaaccagtg   3540

gtggccgtag aacgaacagt gttttacaga gaaagggctg ctggaatgta ctcagccttg   3600

ccatatgcat ttgctcaggt tctggtggaa gtaccgtatg tttttgtgca agctgtggta   3660

tatagtgtta tggtttattc aatgattgga tttgaatgga cagtggcaaa attctgttgg   3720

tacttattct tcatgtatgt cactttatta tacttcacct tttatgggat gatgactgtg   3780

gccgtgactc ccaaccccaa cattgctgct gttattgctg cttcctttta cggaatgtgg   3840

aatttatttt cagggtttat agtcccgcga actaggatac ctgtatggtg gagatggtat   3900

tactgggcat gtccagttgc atggagcctg tatggactgc ttgcgtcaca gtttggagac   3960

gtcaaggatg tggcgctgca ggatacgaat caaactgtgg aagaattcct gaaaacttac   4020

tacggctatc atcacgactt tcttggagta gttgcagcta tggtttcttg cttcgctatt   4080

ctttttgcct tcatttttgc ctactccatt aaggcattta acttccaaaa gagataa      4137

 

<210>  2

<211>  1378

<212>  PRT

<213>  智人

<400>  2

Met Ala Leu Lys Ser Ser Ser Thr Ser Pro Ser Met Trp Arg Thr Asn

1               5                   10                  15     

Gly Met Glu Val Asp Ile His Asn Leu Gly Leu Lys Glu Lys Lys Asp

            20                  25                  30         

Leu Leu Glu Arg Leu Val Arg Val Ala Glu Glu Asp Asn Glu Lys Phe

        35                  40                  45             

Leu Tyr Lys Leu Arg Asp Arg Val Asp Arg Val Gly Ile Glu Leu Pro

    50                  55                  60                 

Thr Ile Glu Val Arg Phe Glu His Leu Asn Val Asp Ala Glu Ala Tyr

65                  70                  75                  80 

Val Gly Ser Arg Ala Leu Pro Thr Phe Trp Asn Phe Tyr Val Asn Leu

                85                  90                  95     

Leu Glu Gly Phe Leu Asn Tyr Leu Arg Ile Leu Pro Asn Arg Lys Lys

            100                 105                 110        

His Leu Pro Ile Leu Arg Asp Val Ser Gly Ile Leu Lys Pro Cys Arg

        115                 120                 125            

Met Thr Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ser Cys Gly Lys Thr Thr Leu Leu

    130                 135                 140                

Leu Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Pro Asp Leu Lys Phe Ser Gly Asn

145                 150                 155                 160

Val Thr Tyr Asn Gly His Gly Met His Glu Phe Val Pro Gln Arg Thr

                165                 170                 175    

Ala Ala Tyr Ile Ser Gln Asn Asp Cys His Ile Gly Glu Met Thr Val

            180                 185                 190        

Arg Glu Thr Leu Ala Phe Ser Ala Met Cys Gln Gly Val Gly Ser Arg

        195                 200                 205            

Tyr Glu Met Leu Ala Glu Leu Leu Arg Lys Glu Lys Glu Ala Asn Ile

    210                 215                 220                

Lys Pro Asp Pro Asp Ile Asp Ile Phe Met Lys Ala Ala Ala Thr Glu

225                 230                 235                 240

Gly Gln Glu Ala Ser Val Val Thr Asp Tyr Ile Leu Lys Leu Leu Gly

                245                 250                 255    

Leu Glu Val Cys Ala Asp Thr Met Val Gly Asn Glu Met Val Arg Gly

            260                 265                 270        

Ile Ser Gly Gly Gln Met Lys Arg Val Thr Thr Gly Glu Met Leu Val

        275                 280                 285            

Gly Pro Ser Lys Ala Leu Phe Met Asp Glu Ile Ser Asn Gly Leu Asp

    290                 295                 300                

Ser Ser Thr Thr Tyr Gln Ile Val Asn Ser Leu Arg His Ser Val His

305                 310                 315                 320

Ile Leu Gln Gly Thr Ala Leu Ile Ser Leu Leu Gln Pro Ala Pro Glu

                325                 330                 335    

Thr Tyr Asp Leu Phe Asp Asp Ile Ile Leu Leu Ser Asp Gly His Ile

            340                 345                 350        

Val Tyr Gln Gly Ser Arg Glu Asn Val Leu Glu Phe Phe Glu Ser Met

        355                 360                 365            

Gly Phe Lys Cys Pro Glu Arg Lys Gly Val Ala Asp Phe Leu Gln Glu

    370                 375                 380                

Val Thr Ser Lys Lys Asp Gln Lys Gln Tyr Trp Leu His Lys Asp Glu

385                 390                 395                 400

Pro Tyr Arg Phe Ile Ser Ala His Glu Phe Ala Lys Ala Tyr Lys Ser

                405                 410                 415    

Phe His Val Gly Gln Lys Met Gly Asp Asp Leu Glu Thr Pro Phe Asp

            420                 425                 430        

Lys Ser Lys Ser His Pro Ala Ala Leu Thr Thr Asn Lys Tyr Gly Val

        435                 440                 445            

Gly Lys Arg Glu Leu Leu Lys Ala Cys Thr Ser Arg Glu Ile Leu Leu

    450                 455                 460                

Met Lys Arg Lys Ser Phe Val Tyr Ile Phe Lys Leu Ser Gln Leu Phe

465                 470                 475                 480

Ile Thr Ala Leu Ile Thr Met Thr Leu Phe Leu Arg Thr Lys Met Gln

                485                 490                 495    

Gln Asn Ser Val Asn Asp Gly Gly Ile Tyr Thr Gly Ala Leu Phe Phe

            500                 505                 510        

Thr Val Ser Thr Thr Ile Ile Asn Gly Met Ala Glu Ile Ser Leu Thr

        515                 520                 525            

Val Ala Lys Ile Pro Val Phe His Lys Gln Arg Asp Leu Leu Phe Tyr

    530                 535                 540                

Pro Pro Trp Ser Tyr Ala Leu Pro Ser Trp Ile Ile Lys Ile Pro Ile

545                 550                 555                 560

Ser Phe Val Glu Val Ala Leu Trp Val Phe Leu Thr Tyr Tyr Val Ile

                565                 570                 575    

Gly Tyr Asp Pro Asn Ala Gly Arg Leu Phe Lys Gln Tyr Leu Leu Leu

            580                 585                 590        

Val Leu Val Asn Gln Met Ala Ser Ala Leu Phe Arg Leu Leu Gly Ala

        595                 600                 605            

Val Gly Arg Asn Met Ile Val Ala Asn Thr Phe Gly Ala Phe Ala Val

    610                 615                 620                

Leu Ile Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Phe Ile Leu Ser Arg Val Asn Val

625                 630                 635                 640

Lys Lys Trp Trp Leu Trp Gly Phe Trp Ser Ser Pro Ile Met Tyr Gly

                645                 650                 655    

Met Asn Ala Ile Ala Val Asn Glu Phe Leu Gly Asp Gln Trp Asn Asn

            660                 665                 670        

Phe Leu Pro Asn Thr Thr Glu Pro Leu Gly Val Ala Ile Leu Lys Ser

        675                 680                 685            

Arg Gly Phe Phe Pro Tyr Ala Tyr Trp Tyr Trp Ile Gly Val Val Ala

    690                 695                 700                

Leu Leu Gly Phe Val Leu Leu Leu Asn Leu Cys Phe Thr Met Ala Leu

705                 710                 715                 720

Ser Tyr Leu Asn Pro Leu Gly Lys Pro Gln Ala Val Ile Ala Glu Glu

                725                 730                 735    

Arg Tyr Thr Ala Val Ala Thr Asp Phe Ser Ser Ile Ser Glu Asp His

            740                 745                 750        

Ile Ser Arg Lys Glu Ser Ile Val Lys Ala Asn Gln Asn Lys Lys Lys

        755                 760                 765            

Gly Met Val Leu Pro Phe Glu Pro His Ser Ile Thr Phe Asp Glu Ile

    770                 775                 780                

Lys Tyr Ser Val Asp Met Pro Gln Glu Met Lys Asp Gln Gly Val Val

785                 790                 795                 800

Glu Asp Arg Leu Met Leu Leu Lys Gly Val Ser Gly Ala Phe Arg Pro

                805                 810                 815    

Gly Val Leu Thr Ala Leu Met Gly Ile Ser Gly Ala Gly Lys Thr Thr

            820                 825                 830        

Leu Met Asp Val Leu Ala Gly Arg Lys Thr Gly Gly Tyr Ile Glu Gly

        835                 840                 845            

His Ile Thr Ile Ser Gly Tyr Pro Lys Arg Gln Glu Thr Phe Ala Arg

    850                 855                 860                

Ile Ser Gly Tyr Cys Glu Gln Asn Asp Ile His Ser Pro His Val Thr

865                 870                 875                 880

Val Tyr Glu Ser Leu Leu Tyr Ser Ala Trp Leu Arg Leu Pro Pro Glu

                885                 890                 895    

Val Asp Ser Glu Thr Arg Lys Met Phe Val Glu Glu Val Met Glu Leu

            900                 905                 910        

Val Glu Leu Lys Ser Leu Arg Asp Ala Leu Val Gly Leu Pro Gly Val

        915                 920                 925            

Asn Gly Leu Ser Thr Glu Gln Arg Lys Arg Leu Thr Ile Ala Val Glu

    930                 935                 940                 

Leu Val Ala Asn Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Pro Thr Ser Gly

945                 950                 955                 960

Leu Asp Ala Arg Ala Ala Ala Ile Val Met Arg Thr Val Arg Asn Thr

                965                 970                 975    

Val Asp Thr Gly Arg Thr Val Val Cys Thr Ile His Gln Pro Ser Ile

            980                 985                 990        

Asp Ile Phe Glu Ala Phe Asp Glu  Leu Leu Leu Met Lys  Gln Gly Gly

        995                 1000                 1005            

Gln Glu  Leu Tyr Val Gly Pro  Val Gly Arg Asp Ser  Cys Gln Leu

    1010                 1015                 1020            

Ile Lys  Tyr Phe Glu Glu Ile  Glu Gly Ile Ser Lys  Ile Lys Asp

    1025                 1030                 1035            

Gly Tyr  Asn Pro Ala Thr Trp  Met Leu Glu Val Thr  Ser Ser Lys

    1040                 1045                 1050            

Gln Glu  Met Ile Leu Gly Val  Asp Phe Asn Glu Val  Tyr Lys Asn

    1055                 1060                 1065            

Ser His  Leu Tyr Arg Arg Asn  Lys Ala Cys Ile Lys  Glu Leu Ser

    1070                 1075                 1080            

Thr Pro  Ser Pro Arg Ser Lys  Asp Leu Tyr Phe Pro  Thr Ile Tyr

    1085                 1090                 1095            

Ser Gln  Ser Phe Leu Asn Gln  Cys Val Ala Cys Leu  Trp Lys Gln

    1100                 1105                 1110            

Arg Arg  Ser Tyr Trp Arg Asn  Pro Pro Tyr Thr Ala  Val Arg Phe

    1115                 1120                 1125            

Leu Phe  Thr Thr Phe Ile Ala  Leu Ala Phe Gly Thr  Met Phe Trp

    1130                 1135                 1140            

Asp Leu  Gly Ser Lys Met Lys  Thr Lys Gln Asp Leu  Phe Asn Ala

    1145                 1150                 1155            

Met Gly  Ser Met Tyr Ala Ala  Val Leu Phe Ile Gly  Tyr Gln Asn

    1160                 1165                 1170            

Ala Ser  Ser Val Gln Pro Val  Val Ala Val Glu Arg  Thr Val Phe

    1175                 1180                 1185            

Tyr Arg  Glu Arg Ala Ala Gly  Met Tyr Ser Ala Leu  Pro Tyr Ala

    1190                 1195                 1200            

Phe Ala  Gln Val Leu Val Glu  Val Pro Tyr Val Phe  Val Gln Ala

    1205                 1210                 1215            

Val Val  Tyr Ser Val Met Val  Tyr Ser Met Ile Gly  Phe Glu Trp

    1220                 1225                 1230            

Thr Val  Ala Lys Phe Cys Trp  Tyr Leu Phe Phe Met  Tyr Val Thr

    1235                 1240                 1245            

Leu Leu  Tyr Phe Thr Phe Tyr  Gly Met Met Thr Val  Ala Val Thr

    1250                 1255                 1260            

Pro Asn  Pro Asn Ile Ala Ala  Val Ile Ala Ala Ser  Phe Tyr Gly

    1265                 1270                 1275            

Met Trp  Asn Leu Phe Ser Gly  Phe Ile Val Pro Arg  Thr Arg Ile

    1280                 1285                 1290            

Pro Val  Trp Trp Arg Trp Tyr  Tyr Trp Ala Cys Pro  Val Ala Trp

    1295                 1300                 1305            

Ser Leu  Tyr Gly Leu Leu Ala  Ser Gln Phe Gly Asp  Val Lys Asp

    1310                 1315                 1320            

Val Ala  Leu Gln Asp Thr Asn  Gln Thr Val Glu Glu  Phe Leu Lys

    1325                 1330                 1335            

Thr Tyr  Tyr Gly Tyr His His  Asp Phe Leu Gly Val  Val Ala Ala

    1340                 1345                 1350            

Met Val  Ser Cys Phe Ala Ile  Leu Phe Ala Phe Ile  Phe Ala Tyr

    1355                 1360                 1365            

Ser Ile  Lys Ala Phe Asn Phe  Gln Lys Arg

    1370                 1375            

<210>  3

<211>  17

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  3

gactgcgtac caattca                                                    17

 

<210>  4

<211>  17

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  4

gatgagtcct gagtaac                                                    17

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  5

tgcccgcctg agatacccct tacca                                           25

 

<210>  6

<211>  25

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  6

caggcgggca aatgaagcgt gttac                                           25

 

<210>  7

<211>  22

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  7

gtggggctgg gaagaccact ct                                              22

 

<210>  8

<211>  23

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  8

gctcccagta tcctgctatg cga                                             23

 

<210>  9

<211>  25

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  9

cgtgatctta cagatagctt catga                                           25

 

<210>  10

<211>  23

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  10

agagaagcta agattgatcc tcc                                             23

 

<210>  11

<211>  34

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  11

cgggatcccg caccatggca ttaaaaagta gcag                                 34

 

<210>  12

<211>  32

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  12

cgcgagctcg gccattttgt tatctctttt gg                                   32

 

<210>  13

<211>  29

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  13

cgggaattca tggcattaaa aagtagcag                                       29

 

<210>  14

<211>  32

<212>  DNA

<213>  智人

<400>  14

cccaagcttg ggcattttgt tatctctttt gg                                   32

 

 

Claims (9)

1.一种人参PgPDR3基因，其特征在于，所述PgPDR3基因序列如SEQ ID N0.1所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述PgPDR3基因的引物对，其特征在于，所述引物对如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。

3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的PgPDR3基因。

4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pBI121或pET28a。

5.根据权利要求1所述PgPDR3基因在调控人参皂苷转运与积累中的应用。

6.根据权利要求1所述PgPDR3基因在人参育种中的应用。

7.一种转运蛋白，其特征在于，所述蛋白由SEQ ID N0.1所示的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。

8.根据权利要求6所述蛋白在调控人参皂苷转运与积累中的应用。

9.根据权利要求6所述蛋白在人参育种中的应用。

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