CN111534523A

CN111534523A - 人参PgHDZ01基因及其在提高人参皂苷含量方面的应用

Info

Publication number: CN111534523A
Application number: CN202010596923.3A
Authority: CN
Inventors: 张美萍; 王�义; 李俐; 赵明珠; 王康宇; 孙春玉; 姜悦; 朱蕾
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111534523B

Abstract

本发明公开了一种人参PgHDZ01基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因；所述的人参PgHDZ01基因在提高人参总皂苷含量方面的应用；培养的人参发状根单根系，有3个转基因阳性单根系的人参总皂苷含量与转化空载的阴性对照相比显著上升，同时有5个转基因阳性单根系的Rb1含量与转化空载的阴性对照相比显著上升。

Description

人参PgHDZ01基因及其在提高人参皂苷含量方面的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人参PgHDZ01基因及其在提高人参皂苷含量方面的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A. Meyer)是伞形目、五加科、人参属多年生草本植物，具有极高的药用价值、研究价值及经济价值。人参主根入药的文字记载可追溯至至少2,000年前，《神农本草经》及《本草纲目》等中药典籍将其列为中药上品；现代医学研究表明，其在治疗疾病及保健方面具有重要功能。人参作为孑遗植物，生长环境要求严苛，基因组结构复杂，在物种基因组进化等方面具有重要研究价值。

人参皂苷属于三萜类物质，是人参属植物的次生代谢产物，同时也是其特有的特征性药效成分。目前从人参属植物中已分离出150余种人参皂苷，按其结构可分为三大类：五环三萜的齐墩果烷型 (oleanene type) 皂苷，四环三萜类的达玛烷型 (dammarane-type) 皂苷及奥克梯隆型 (ocotillo-typ)皂苷。其中达玛烷型皂苷又可根据苷元的不同而分为原人参二醇类(protopanaxadiol，PPD)，如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2等；与原人参三醇类(protopanaxatriol，PPT)，如Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、Rh3等。不同人参单体皂苷被证明在抗癌、抗炎、保护心脏、保护肝脏、修复神经系统、恢复认知等诸多方面具有重要治疗作用，同时在提高免疫力、抗疲劳等方面具有保健功能。

人参皂苷生物合成途径包括甲羟戊酸合成途径(mevalonic acid, MVA) 与甲基赤磷酸合成途径 (methylerythritol phosphate, MEP)，其中MVA途径存在于细胞质中，是人参皂苷生物合成的主要途径；MEP途径存在于叶绿体中，是人参皂苷生物合成的补充途径。在人参皂苷的合成过程中，已有许多编码执行催化作用的关键酶基因被鉴定与克隆，但依然有一些合成过程及其催化酶尚未明确。另外，人参皂苷的合成过程受到植物机体的整体调控，可能有许多调控因子，如转录因子等参与其中。

同源异型域-亮氨酸拉链 (HD-Zip) 基因家族是植物中特有的转录因子基因家族，其编码蛋白由同源异型结构域 (Homeodomain, HD) 与亮氨酸拉链结构域 (Homeoboxassociated leucine zipper, HALZ) 为基础结构域构成，另外可根据所含有的其他保守结构域或保守基序，如START、MEKHLA、CPSCE等，而被划分为四个亚家族（类型）。该家族基因编码蛋白广泛参与植物耐旱、耐盐、抗病、耐寒或耐热等逆境胁迫，在植物胚胎、根、茎、叶、花等组织器官的发育中其重要调节作用，并且被证明参与调控不同植物中甾醇、黄酮等次生代谢产物的合成。

人参发状根是利用发根农杆菌对人参材料进行遗传转化后，由其中的Ri质粒诱导产生的人参培养材料类型，具有遗传稳定、激素自养、生长快速等优点。人参发状根不但可以用于人参皂苷的生产，同时成为了人参分子生物学及基因工程等相关研究的基础材料。一方面，可以利用不同的诱导子及非生物胁迫对人参发状根进行处理，在表型显著变化的条件下，研究相关基因的表达及功能；另一方面，可以将重要功能基因通过人参发状根进行超表达或基因沉默，以验证基因功能。由于人参发状根具有遗传背景清晰、培养周期短、培养不受季节限制、对环境污染小、品质均一等诸多优点，为人参的相关基础研究提供了优质的材料，同时弥补了栽培人参产品无法满足的加工与应用市场，在人参相关的科研及应用领域具有无法替代的重要作用。

发明内容

本发明目的是提供人参PgHDZ01基因及其在提高人参皂苷含量方面的应用。

人参PgHDZ01基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。

所述的人参PgHDZ01基因在提高人参总皂苷含量方面的应用。

本发明提供了人参PgHDZ01基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因；所述的人参PgHDZ01基因在提高人参总皂苷含量方面的应用；培养的人参发状根单根系，有3个转基因阳性单根系的人参总皂苷含量与转化空载的阴性对照相比显著上升，同时有5个转基因阳性单根系的Rb1含量与转化空载的阴性对照相比显著上升。

附图说明

图1 PgHDZ01基因PCR扩增产物电泳结果图；M：DL2,000；泳道1：阴性对照；泳道2-6：PCR产物；

图2 PgHDZ01-pCAMBIA3301重组超表达载体XmaI酶切验证电泳图；M：DL2,000；泳道1：原质粒；泳道2-5：酶切产物；

图3 遗传转化工程菌菌液PCR；M：DL2000；泳道1：阴性对照；泳道2：PCR产物；

图4 超表达PgHDZ01基因人参发状根的诱导；A：人参无菌苗；B：预培养；C：诱导培养；D、E、F：诱导出的发状根单根；

图5 超表达PgHDZ01基因人参发状根的PCR检测；M：DL2000; a：PgHDZ01基因；b：含PgHDZ01基因的部分载体序列；c：含PgHDZ01基因的上游部分载体序列；d：含PgHDZ01基因的下游部分载体序列；e：rol C基因；

图6 超表达PgHDZ01基因人参发状根中人参总皂苷含量；pCOMBIA3301:00：阴性对照；positive line 3, positive line 54, positive line 63, positive line 65,positive line 67: 超表达PgHDZ01基因阳性发状根单根系；

图7 超表达PgHDZ01基因人参发状根中人参皂苷Rb1含量；pCOMBIA3301:00：阴性对照；positive line 3, positive line 54, positive line 63, positive line 65,positive line 67: 超表达PgHDZ01基因阳性发状根单根系。

具体实施方式

实施例1 人参PgHDZ01基因的克隆

一、人参无菌苗的培养

人参种子购买于吉林省通化市，进行预处理；取层积于沙土中的裂口人参种子，剥去种皮，置于流水中冲洗净沙土；在无菌条件下75 %酒精消毒1 min，5 %次氯酸钠消毒10 min，用无菌水冲洗三次；切开人参胚乳，取出人参胚置于MS培养基中，22 ℃，16 h光照/8 h黑暗培养14-21 d，即可得到人参无菌苗。

二、人参总RNA的提取与cDNA的合成

利用Tripure regent提取人参无菌苗中的总RNA，并利用反转录试剂盒反转录为cDNA备用。

三、PgHDZ01基因的克隆

PgHDZ01基因全长819 bp，基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

依据以上序列，利用Primer Premier 5软件设计扩增引物，并在引物5’端添加XmaI酶切识别位点，得到引物如下：

HDZ01-F: 5’-TCCCCCCGGGATGCAGCGGTTCAGTTCAACAAAT-3’

HDZ01-R: 5’-TCCCCCCGGGTTACCAATGAAGGTTTGGTGCTTGAT-3’；

利用以上引物在人参无菌苗cDNA中扩增PgHDZ01基因，其PCR扩增产物电泳结果如图1所示，产物大小符合基因长度；对以上电泳结果进行琼脂糖凝胶回收，并将其连接至T载体中，通过热击法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用含有100 mg/L氨苄青霉素的抗性平板进行筛选，对其中的抗性克隆进行PCR验证，将阳性克隆送至送测公司测序，测序结果与以上序列完全一致，完成对PgHDZ01基因的克隆。

实施例2 PgHDZ01基因植物超量表达载体的构建

提取大肠杆菌中的PgHDZ01基因重组克隆载体与pCAMBIA3301植物超表达载体，利用XmaI进行酶切，回收酶切产物后利用T4连接酶对二者进行连接；利用热击法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用含有50 mg/L卡那霉素的抗性平板进行筛选，对其中的抗性克隆进行PCR验证，并提取PCR验证阳性克隆中的重组载体进行酶切验证（图2），结果显示酶切产物的大小与目的基因长度一致，PgHDZ01基因植物超量表达载体构建成功。

实施例3 超量表达PgHDZ01基因遗传转化工程菌

利用热击法将以上重组PgHDZ01基因植物超量表达载体转入农杆菌C58C1感受态细胞中，利用含有50 mg/L卡那霉素与30 mg/mL利福平的抗性平板进行筛选，对抗性克隆进行PCR验证（图3），结果显示条带大小符合目的基因长度，因此超量表达PgHDZ01基因遗传转化工程菌的构建成功，保存备用。

实施例4 农杆菌介导法转化PgHDZ01基因

1、预培养

将人参无菌苗的叶片、叶柄与幼根切为约0.5-1 cm长的小段，置于固体MS培养基中22℃、16 h光照/8 h黑暗条件下培养3 d；

2、工程菌活化

利用含有50 mg/L卡那霉素与30 mg/mL利福平的抗性平板活化超量表达PgHDZ01基因遗传转化工程菌，挑取单克隆在含有上述抗生素的液体LB培养基中过夜培养至OD₆₀₀=0.4-0.6，用含有20 μM乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基对菌体进行重悬，将重悬后菌液置于28℃、180 rpm条件下震荡培养30 min，备用；

3、侵染与共培养

在无菌条件下将预培养的人参幼苗外植体浸入上述活化后的侵染液中，震荡侵染10min，利用无菌滤纸吸干外植体表面菌液，置于1/2 MS培养基中共培养3 d；

4、筛选培养

将共培养的外植体转入含有200 mg/L 头孢霉素与5 mg/L卡那霉素的1/2MS培养基中，22 ℃暗培养，每隔14天继代一次，直至诱导出抗性发状根（图4）。筛选培养约一个月后，可见人参叶柄与幼根外植体两侧长出白色新根，生长迅速且有分支，该新根即为抗性发状根。将该新生根从外植体上齐根切下，置于液体1/2MS培养基中扩大培养，以备检测。

实施例5 抗性发状根的PCR验证

根据PgHDZ01基因、pCAMBIA3301载体T区及发根农杆菌C58C1的RolC基因设计特异性扩增引物如下:

HDZ01-F: ATGCAGCGGTTCAGTTCAACAAAT

HDZ01-R: TTACCAATGAAGGTTTGGTGCTTGAT;

3301-F: CGCTCTTTCTTTCCAAGGTAATAG

3301-R: GTTGTACTCCATCTTATTGCCCAG；

RolC-F：ATGGCTGAAGACGACTTGTGTTC

RolC-R：TTAGCCGATTGCAAACTT;

利用以上引物对抗性发状根单根系进行PCR检测，PCR产物预期长度如下：

a: gene (

+

=819 bp)

b: gene & vector (

+

=1838 bp)

c: gene & vector-L (

+

=1397 bp)

d: gene & vector-R (

+

=1227 bp)

e: RolC gene (

+

=586 bp)

所得电泳结果如图5所示，共鉴定出转化空载的单根系2个，超表达PgHDZ01基因的阳性单根系14个。

实施例6 超量表达PgHDZ01基因阳性发状根中皂苷含量的检测

一、阳性发状根的培养

选取在固体培养基中生长良好的5个阳性发状根单根系及2个转化空载的发状根单根系，接种于含150 mL液体1/2 MS培养基的250 mL三角瓶中进行摇瓶培养，接种量1.0 g，培养条件为22 ℃，110 rpm，继而以同样的条件将培养体系扩大至500 mL，培养30天时取材；

二、人参皂苷的提取

将阳性人参发状根材料烘干至恒重，研磨为粉末，记录粉末重量并用滤纸包好，置于30mL纯甲醇中浸泡过夜，然后60 ℃超声30 min，之后将甲醇体积补足100 mL并置于索氏提取器中90 ℃回流36小时；

三、人参皂苷的纯化

将回流后的甲醇溶液减压蒸干，以20 mL蒸馏水回溶，用等体积的乙酸乙酯纯化三次，再用等体积的水饱和正丁醇纯化三次，蒸干后用10 mL色谱甲醇回溶，并以0.22 μm有机系滤膜过滤，以备检测；

四、高效液相色谱法检测人参皂苷含量

对14种单体皂苷标准品粉末以色谱甲醇配置为浓度约为1.0 mg/mL的单体皂苷标准品溶液，并取等体积各单体皂苷标准品溶液配置成混合标准品溶液；将单体皂苷标准品溶液、混合标准品溶液及提取的人参发状根皂苷样品以高效液相色谱法进行检测；色谱条件为：Waters C18色谱柱 (4.6×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈 (A) 和水 (B)，流动相流速1.0mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长为203 nm，流动相梯度洗脱条件如表1所示：

表1 高效液相色谱流动相梯度条件表

时间 (min)	溶剂A (%)	溶剂B (%)
			0-40	18-21	82-79
40-42	21-26	79-74
			42-46	26-32	74-68
46-66	32-33.5	68-66.5
			66-71	33.5-38	66.5-62
71-86	38-65	62-35
			86-91	65	35
91-96	65-85	35-15
			96-103	85	15
103-105	85-18	15-82
			105-106	18	82

据标准品浓度/标准品峰面积=样品浓度/样品峰面积的公式，利用所得色谱图中样品的峰面积计算其中各单体皂苷含量；各阳性发状根单根系的人参总皂苷含量结果如图6所示，有3个转基因阳性单根系的人参总皂苷含量与转化空载的阴性对照相比显著上升，同时有5个转基因阳性单根系的Rb1含量与转化空载的阴性对照相比显著上升（图7）；以上结果说明PgHDZ01基因参与调控人参皂苷的合成，特别是对人参皂苷Rb1的合成具有显著促进作用。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 人参PgHDZ01基因及其在提高人参皂苷含量方面的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> Panax ginseng

<400> 1

atgcagcggt tcagttcaac aaattcattg agcactttac tctatccacc tcaagagaag 60

aagaacccaa aagacaattg catttacagt agtgaaaaat acaaagaaat gccgaatggt 120

ttagacgacg aagacagcag cacatacatg gaagaaacag ggcagaacac agataaaaaa 180

aggcgattga gctatactca agtaaagaca atggagaaga tatttgaggt ggataacaaa 240

cttgatcctg ggaaaaaagt aacactggca catgaactag gcctccagcc tcgacaggtt 300

gcgatttggt tccaaaatcg tcgtgcccgg tggaaaacaa agcagctgga gagagactat 360

aaccacctta aggccaatta tgaatctctt aagctgaatt acagtaagct tgagcagagt 420

aaagataatt tgattcatga gttgagagag ttaaaagcta aacttgaaga ggaaaacaca 480

gagacaaatc agcctatttc gggcttacaa agcaatggac tatcccaaat ttttgtagag 540

aaagggttat cggatagcga ttctacagga attttgaatg aagagatgaa tcgtaatttt 600

catatgctaa aatctcctcc agctttatca actccaaggt tggatttttc ttctttttct 660

tcgtcgagta aatatgaaga ttgtttggaa tcaagagctg atttgaggaa tgcatatcaa 720

caacaatgga tgaaaatgga agaagggtgt ttttttggta gttcagagga atcctgcaat 780

attttctcgg ttgatcaagc accaaacctt cattggtaa 819

Claims

1.人参PgHDZ01基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。

3.权利要求1所述的人参PgHDZ01基因在提高人参总皂苷含量方面的应用。