CN104830898A - 一种提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法与应用。利用发根农杆菌A4介导BbRha基因转化人参根，获得转BbRha基因的人参发根。研究证实过表达BbRha基因的人参发根中人参皂苷Re含量降低，Rg1含量增加，所获得的过表达BbRha基因的人参发根与对照人参发根相比，Rg1含量显著高于对照人参发根。根据人参皂苷结构特点和生物合成代谢途径，表明所述BbRha基因表达蛋白能够酶解人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1，进而增加人参发根中人参皂苷Rg1单体的含量。可以通过异源过表达BbRha基因获得人参皂苷Rg1含量高的人参发根。本发明利用BbRha基因增加人参皂苷Rg1产量方面有着重要的应用价值。

Description

一种提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及改良植物性状，具体是通过发根农杆菌A4介导的BbRha基因在人参发根中表达，利用其表达的酶将部分人参皂苷Re转化成Rg1，进而增加人参皂苷Rg1在人参根中的含量。本发明利用异源过表达BbRha基因以促进人参根中含有鼠李糖残基的人参皂苷Re水解，并转化为人参皂苷Rg1，提高人参中人参皂苷Rg1的含量，该发明利用BbRha基因增加人参皂苷Rg1产量方面有着重要的应用价值。

背景技术

人参(P.ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物，是最著名的中草药之一。人参中含有多种药用成分，其中人参皂苷是人参最主要的活性成分。目前已从人参根中分离出100余种人参皂苷，现代医学研究证明各皂苷单体具有重要的药用价值，且已广泛应用于临床。人参皂苷是由极性极低的苷元与极性较高的糖基以糖苷键连接而成的配糖体。由于苷元和糖基的种类、糖基的数量和糖基连接的碳位的不同，形成不同种类的人参皂苷，其活性亦差别很大。其中一些具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性强的皂苷如Rg1的含量相对较低。

研究表明，与人参皂苷Rg1结构类似的人参皂苷Re能减少乙酰胆碱引起的豚鼠离体子宫的收缩，对大鼠有减慢心率和双相性血压(先升后降)作用，对猫的行为和脑电图显示中等程度的抑制作用。

人参皂苷Rg1是Re在C-6上连接一个鼠李糖残基的产物，研究发现其具有广泛的药理活性。人参皂苷Rg1在保护神经方面有着最为显著的作用，尤其是治疗帕金森氏症的潜在药物。研宄表明，Rg1具有调节和保护神经细胞、保护大脑因缺血受到的损伤、促进海马体细胞的增殖、降低神经元死亡率等作用。同时也发现Rg1在心血管系统方面具有较高的治疗效果，例如Rg1可以治疗中风引起的脑缺血、促进血管生长和保护心肌细胞的作用。最近研究表明Rg1具有类雌激素的作用，可激活促分裂原活化蛋白激酶途径，还可以是糖皮质激素受体的功能配体。Rg1还具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗疲劳、降血糖、提高免疫活性和增强记忆力等作用。与人参皂苷Re相比，Rg1更具有独特的药理活性。

发明内容

本发明旨在提供一种能够采用基因工程技术提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法，为今后利用转基因人参植物选择性提高人参皂苷Rg1的产量奠定基础。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法，利用双歧杆菌中α-L-鼠李糖苷酶基因提高人参皂苷Rg1含量。

双歧杆菌，即Bifidobacterium breve ATCC 15700；α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)基因，即BbRha基因，GenBank number,CP006715.1。

所述的BbRha基因利用RT-PCR技术克隆与鉴定。

所述的BbRha基因利用发根农杆菌A4介导法转入人参根，获得过表达BbRha基因的人参发根。

所述的发根农杆菌A4介导法中，所采用的植物表达载体优选载体pBI121，将BbRha基因克隆到空载体pBI121中，获得重组载体pBI121-BbRha，然后采用冻融法转化制备成含BbRha基因的重组菌。

所述的BbRha基因利用发根农杆菌A4介导法转入人参根后，还包括卡那霉素筛选、PCR和qRT-PCR检测。

所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法在其它含人参皂苷Re的植物中的应用。

所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法在生产人参皂苷Rg1单体中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明利用现有的植物基因工程技术，根据已报道的基因序列设计引物，采用PCR技术等方法克隆与鉴定人参皂苷Re生物转化生产Rg1的基因序列，并通过发根农杆菌介导法将基因转入人参根，经过卡那霉素筛选、PCR和qRT-PCR检测后获得异源过表达BbRha基因的人参发根。

经体外酶活力测定鉴定，结果证明异源过表达BbRha基因的人参发根所产生的BbRha蛋白具有水解末端为α-L-鼠李糖残基的α-1,2及α-1,6糖苷键，并对人参皂苷Re的C-6位α-1,2鼠李糖残基具有水解能力。转BbRha基因的人参发根中人参皂苷Re含量明显下降，人参皂苷Rg1含量明显增加，证明人参皂苷Re部分转化为人参皂苷Rg1。

经实验证明，本发明的方法能够将人参皂苷Re部分转化为Rg1，进而提高人参皂苷Rg1在人参发根中的含量，并且BbRha基因表达蛋白对人参皂苷Re的转化选择性较高，因而本发明的方法能够选择性提高人参发根中人参皂苷Rg1含量。

本发明的方法不仅能够用于改良人参，还同样适用于其它含人参皂苷Re的植物，获得人参皂苷Rg1含量高的优良植物品种，以生产人参皂苷Rg1单体。

附图说明

图1是本发明通过PCR扩增的BbRha基因电泳结果；图中，1表示PCR扩增产物，M表示Marker；

图2是转基因人参发根中BbRha、RolB、RolC和β-Actin基因RT-PCR检测电泳结果；图中Control为对照，即转pBI121空载体筛选得到的人参发根；T8、T13和T22为转pBI121-BbRha筛选得到的转基因人参发根；

图3是转基因人参发根中BbRha基因qRT-PCR检测结果；图中Control为对照，即转pBI121空载体筛选得到的人参发根；T8、T13和T22为转pBI121-BbRha筛选得到的转基因人参发根；

图4是获得的转基因人参发根；图中Control为转pBI121空载体筛选得到的人参发根；T8、T13和T22为转pBI121-BbRha筛选得到的转基因人参发根；

图5是转基因人参发根培养30d后α-L-鼠李糖苷酶活性测定结果(*P<0.05,**P<0.01)；图中Control为转pBI121空载体筛选得到的对照人参发根；T8、T13和T22为转pBI121-BbRha筛选得到的转基因人参发根；

图6是异源表达BbRha基因的人参发根中人参皂苷Rg1的含量测定结果；图中Control为对照，即转空载体pBI121人发根中人参皂苷Rg1经HPLC测定后的含量，T8、T13和T22分别为转BbRha基因的人发根中人参皂苷Rg1经HPLC测定后的含量，结果显示异源表达BbRha基因的人参发根中，与对照相比，人参中皂苷Rg1含量明显上升；

图7是异源表达BbRha基因的人参发根中人参皂苷Re的含量测定结果；图中Control为对照，即转空载体pBI121人发根中人参皂苷Re经HPLC测定后的含量，T8、T13和T22分别为转BbRha基因的人发根中人参皂苷Re经HPLC测定后的含量，结果显示异源表达BbRha基因的人参发根中，与对照相比，人参中皂苷Re含量明显下降；

图8是BbRha基因表达蛋白转化人参皂苷Re为Rg1的分子机制示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于此。

实施例1

BbRha基因的获得

1、双歧杆菌培养及DNA提取

①以MRS液体培养基37℃厌养培养2-3d；

②5000rpm离心菌液，取50mg双歧杆菌菌体，在菌体中加入0.5mL TE缓冲液，0.1mL 10mg/mL溶菌酶，40℃放置l h；

③加入质量分数为10％十二烷基磺酸钠(SDS)0.1mL充分混匀后40℃放置1h；

④6000rpm离心5min，吸取上清液0.5mL，加人上清液1/6体积的KAc，冰水浴15min，12000rpm离心10min；

⑤取上清液，在上清液中加入上清液1/10体积的3mol/L的NaAc及上清液2倍体积的预冷无水乙醇，冰水浴30min；

⑥12000rpm离心10min，将上清液移至一新离心管，用冷乙醇洗涤沉淀，待乙醇风干后加入50-100μL ddH₂O(双蒸水，即经过2次蒸馏而得的水)溶解备用。

2、PCR扩增

(1)引物设计与合成

根据Genbank序列号为CP006715.1的序列信息，利用Primer Premier 5.0软件对基因序列设计引物如下：

F：5′-CGCGGATCCATGCTCGATGATAGTGAACTGC-3′；(SEQ ID N0.1)

R：5′-CGAGCTCGTCATACGGACCTCATTTCAATCAC-3′。(SEQ ID N0.2)

划线部分分别为BamH I和Sac I酶切位点，引物由长沙博尚生物有限公司合成。

(2)PCR扩增

以双歧杆菌DNA为模板，用引物P1、P2进行PCR扩增。

反应体系为：10×PCR缓冲液2.5μL、MgCl₂(25mmol/L)1.5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、P1(20μmol/L)1μL、P2(20μmol/L)1μL、DNA 0.5μL、dd H₂O 14μL和Taq DNApolymerase 0.5μL。

反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s、58℃退火2min、72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。采用质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。图1为PCR扩增的BbRha基因电泳结果，图中显示得到约2300bp的片段，与预期推测的2328bp大小一致。

(3)BbRha基因扩增片段胶回收、连接、测序及分析

PCR产物经质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物胶回收后BamH I和SacI双酶切，连接至pUC18载体上，并转化大肠杆菌DH5α。经蓝白筛选和酶切初步鉴定正确后，将重组质粒pUC18-BbRha送长沙博尚公司测序。测序结果利用NCBI中的Blast工具与GenBank的dbEST数据库进行同源性比对，结果表明得到的基因为BbRha基因片段。

实施例2

表达载体的构建及转化

1、植物过表达载体的构建

(1)分别用BamH I和Sac I双酶切pBI121和重组质粒pUC18-BbRha，回收pBI121载体和BbRha基因片段。将两片段连接并转化DH5α，筛选出重组子，重组质粒命名为pBI121-BbRha。

(2)发根农杆菌感受态细胞的制备

①在YEB平板上划线培养发根农杆菌(A.rhizogenes)A4，28℃暗培养2d；

②挑取单菌落接种到YEB液体培养基中，28℃振荡培养2d；

③将培养活化的发根农杆菌按l：50的体积比稀释加入YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600约为0.4-0.6，冰浴30min；

④于4℃，5000rpm离心10min，弃上清液，用10mL 0.15m mol/L NaCl重悬菌体；

⑤于4℃，5000rpm离心10min，弃上清液，用2mL 20m mol/L CaCl₂重悬菌体；

⑥每管200μL分装，液氮速冻，-70℃保存。

(3)发根农杆菌感受态细胞的转化

①将发根农杆菌感受态细胞置于冰上，缓慢解冻；

②分别加入0.5μg pBI121-BbRha和pBI121(对照)质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；

③置液氮中冷冻2min，迅速移入37℃水浴中热激5min，再迅速冰浴2min，之后加入800μL YEB液体培养基，于28℃振荡培养3-4h；

④5000rpm离心5min沉淀菌体，弃掉800μL上清后重新悬浮菌体，均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的YEB培养基上，28℃培养2-3d。

(4)发根农杆菌质粒提取和鉴定

①PCR鉴定

挑取转化的农杆菌单菌落接种于1.5mL含卡那霉素的YEB液体培养基中28℃振荡培养，提取质粒DNA，用BbRha基因特异性引物PCR检测。PCR反应程序如下：94℃3min；94℃30s，58℃50s，72℃40s，35个循环；72℃5min。其所用引物如下：

BbRha：F：5′-ACGCAATATTTCGAAGCGCC-3′；(SEQ ID N0.3)

R：5′-GGAGTCTGCGGGGTGATATG-3′；(SEQ ID N0.4)

PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。

②酶切鉴定

挑取农杆菌单菌落接种于含有50μg/mL的卡那霉素的YEB培养基中，28℃培养1-2d，提取重组质粒pBI121-BbRha，采用上述方法以BamH I和Sac I双酶切提取的质粒。

(5)含pBI121-BbRha质粒的发根农杆菌培养

28℃划线培养含有pBI121-BbRha质粒的农杆菌约2d。挑取单菌落接种于含有50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD600约为0.6时收集菌液，4000rpm离心10min，沉淀重悬于1/2MS液体培养基中。

2、发根农杆菌介导转化人参根

(1)发根农杆菌A4菌株的培养

取-70℃保存的分别含有pBI121载体和pBI121-BbRha的发根农杆菌(A.rhizogenes)A4在YEB固体培养基划线培养2d，挑取单菌落转入YEB液体培养基中28℃、110rpm培养过夜，使其OD₆₀₀至0.6左右，5000rpm、4℃离心10min，收集菌体，用1/2MS培养基清洗3次后，用1/2MS+乙酰丁香酮20mg/L培养基将菌液稀释10倍后作为侵染液。

(2)人参根外植体的准备

取4年生人参根自来水清洗干净，质量分数为70％的酒精及质量分数为0.1％的氯化汞消毒，无菌水冲洗3次，将新鲜人参根切成2～3mm的薄片，置于无激素的1/2MS固体培养基上预培养1～2d。

(3)人参发根的诱导及其培养

取消毒处理的外植体，放入侵染液中10min，用无菌滤纸吸干菌液，置于1/2MS培养基上避光共培养。先避光共培养3-5d，如果有农杆菌长出则要用无菌水清洗掉，将外植体转入1/2MS培养基上暗培养10d；这期间发根会从下胚轴切口处长出。将长至1cm左右的小发根切下，接于含有500mg/L氨苄青霉素的1/2MS基本培养基上进行灭菌处理。每隔5～7d转移1次，直至无细菌生长。将无菌的发根培养在不含激素的1/2MS固体培养基上，每4周继代1次。

(4)人参发根的PCR检测

参考E.Z.N.A.HP Plant DNA Kit说明书提取人参发根基因组DNA以进一步检测发根的转化情况。

①取一定量发根置预冷的研钵中，加入液氮研磨至细粉，取约100mg细粉于2mL离心管中，在离心管中立即加入500μL CPL缓冲液和10μLβ-巯基乙醇，涡旋震荡使其充分混匀；

②在混合液中加入2μL RNase，65℃水浴15min，期间翻转混合样品2次；

③加入800μL氯仿/异丙醇(24：1)，涡旋震荡使其充分混匀，10000×g离心5min；

④小心吸取约300μL上清液至一新的1.5mL离心管；

⑤加入150μL CXD缓冲液和300μL无水乙醇，涡旋震荡；

⑥取一新DNA column置于2mL收集管中，加入100μL Equilibration Buffer，室温放置4min，13000rpm离心20s，并将HiBind DNA column放回收集管中；

⑦将第5步中所有样品(包括沉淀)加入到DNA column中，10000×g离心1min，弃去2.0mL收集管和收集液；

⑧转移DNA column至一新的收集管，加入700μL Wash Buffer(按试剂盒说明加入无水乙醇，10000×g离心1min，弃去滤液，并将DNA column放回收集管，并重复操作一次；

⑨将DNA column装回收集管，13000rpm离心2min以甩干残留液体；

⑩转移DNA column至一新的1.5mL离心管，加入100μL Elution Buffer(可提前预热至65℃)室温放置5min，13000rpm离心1min，将滤液置-20℃备用。

以提取的发根基因组DNA为模板，PCR扩增RolB、RolC、BbRha及β-Actin基因，PCR扩增条件为：预变性94℃2min；94℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环；72℃7min。PCR扩增产物以质量分数为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。其中BbRha基因扩增所用的引物为SEQID N0.3和SEQ ID N0.4；RolB和RolC基因扩增引物如下：

RolB PCR扩增引物：

F：5′-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3′(SEQ ID N0.5)

R：5′-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3′(SEQ ID N0.6)

RolC PCR扩增引物：

F：5′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′(SEQ ID N0.7)

R：5′-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3′(SEQ ID N0.8)

β-Actin PCR扩增引物：

F：5′-CGTGATCTTACAGATAGCTTCATGA-3′(SEQ ID N0.9)

R：5′-AGAGAAGCTAAGATTGATCCTCC-3′(SEQ ID N0.10)

RT-PCR结果见图2，结果显示获得的转基因发根T8、T13和T22，对照(Control)中均有发根特有的基因RolB和RolC；对照发根中没有发现BbRha基因的表达；而T8、T13和T22发根中均发现BbRha基因较高水平的表达，结果初步表明获得对照和转基因发根。

(5)转基因人参发根中BbRha基因qRT-PCR鉴定

1)人参发根总RNA提取

①取适量人参发根，在研钵内用液氮充分研磨成粉末。取40mg研磨的粉末置于1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol试剂，40μLβ-巯基乙醇，重悬沉淀，室温孵育5-10min；

②加入0.2mL氯仿，振摇l5s，室温孵育10-15min；

③4℃，12000×g离心15min，收集上层无色水相于1.5mL离心管中，勿吸动中间层，弃沉淀；

④加入0.4mL 3M醋酸铵(pH 5.2)，0.6mL异丙醇，轻柔振荡混匀，室温孵育5-10min(RNA沉淀)。4℃、12000×g离心10min，弃上清；

⑤加入1mL质量分数为75％的乙醇并振荡；4℃，7500×g离心5min，弃上清，重复该步骤；

⑥空气中干燥10min，加入20μL DEPC水溶解RNA；

⑦RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在0.5×TBE中进行，琼脂糖浓度为1％(每100mL凝胶中加入2.5μL的10mg/mL EB)，4μL上样量，8v/cm恒压40min，然后在紫外凝胶成像系统中观察所提取RNA的完整性。

2)cDNA合成及PCR扩增

以提取RNA为模板，oligod(T)₁₈为引物，AMV反转录酶合成cDNA，并以β-actin为内参，利用real-time PCR扩增BbRha基因，BbRha和β-actin扩增引物分别为：

BbRha：F：5′-CATGCGCAGTGCTATAGGGA-3′；(SEQ ID N0.11)

R：5′-CCCGACGATCTTTAGGGACG-3′；(SEQ ID N0.12)

β-actin：F：5′-TGCCCCAGAAGAGCACCCTGT-3′；(SEQ ID N0.13)

R：5′-AGCATACAGGGAAAGATCGGCTTGA-3′。(SEQ ID N0.14)

反应体系为：

采用两步法PCR扩增标准程序：95℃30s；95℃40s，60℃30s共40个循环；每个样品三次重复。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，计算BbRha基因在转BbRha基因和对照发根中表达水平的差异。结果显示转BbRha基因的发根(T8，T13和T22)中是对照发根中表达水平的35.8，46.5和37.3倍(结果见图3)。结果表明BbRha基因在转基因发根中过表达，已成功获得过表达BbRha基因的人参发根(见图4；T8，T13和T22)，其表达蛋白是否具有酶的活性，需要下述方案测定其其表达的蛋白活性。

3)转基因人参发根中BbRha基因表达蛋白的提取及活性测定

取一定量的人参发根，室温水洗后，滤纸吸干水分。称取1g发根在液氮中研磨成细粉，再加入1mL缓冲液A(pH 6.5，50mM Tris-HCl，5mM DTT，1％PVP，40mM抗坏血酸)，涡旋振荡30s，4℃条件下15000×g离心20min；移取上清液至新的离心管，加入2mL缓冲液A，以Folin-酚法测定提取蛋白质的含量。

BbRha基因表达蛋白(α-L-鼠李糖苷酶)活性测定：以4-硝基苯基-α-L-鼠李糖苷(pNP-Rha)为底物，对硝基苯酚为产物测定酶的活性。取200μL发根蛋白提取液，加入200μL pNP-Rha(10mM)，pH6.5，55℃，孵育2h后，加入等体积200mM Na₂CO₃，405nm测定pNP。1个酶活力单位定义为1min释放1μmol pNP。图5结果显示转基因人参BbRha酶的活性是对照的9.9，14.4和11.9倍。

3、转基因人参发根中BbRha酶体外转化人参皂苷Re

(1)体外转化

配制底物溶液：将人参皂苷Re溶于上述缓冲液A中(pH 6.5，50mM Tris-HCl，5mM DTT，1％PVP，40mM抗坏血酸)，配制成5mM人参皂苷Re溶液作为底物待用。0.1mL底物溶液与等体积的酶液(1.2U)在pH 6.5，5％(v/v)DMSO，55℃反应2h，反应结束后，乙醚萃取两次，取水相，然后用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃蒸干正丁醇，即得到人参总皂苷，用适量的甲醇超声波溶解，定容，HPLC测定含量。结果表明转BbRha基因的转基因发根系T8，T13和T22中BbRha酶对人参皂苷Re的转化率分别为32.3％、36.1％和31.9％。

HPLC测定条件为：LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，包括LC-6A输液泵、SCL-6A系统控制器、SL-6A自动进样器、SPD-6AV紫外可见光检测器、CTO-6A柱温箱；Hw-2000数据站(南京千谱软件有限公司)；色谱柱为Diamonsil C₁₈柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-50mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾10∶90(V/V)(磷酸调pH至4.0)，用前经0.45μm的过滤膜，超声脱气，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，AUFS 20mV，进样量为20μL，检测波长为202nm。

(2)人参发根中BbRha基因表达蛋白对人参皂苷Re的转化能力

取转BbRha基因和对照人参发根，自来水清洗5min后用蒸馏水清洗，滤纸吸干水分，称重，60℃干燥3d后称量干重。将其研磨成细粉，取一定量用80％甲醇60℃浸提(1g：40mL)，超声波处理3次，每次15min；60℃水浴蒸干甲醇，然后用5-10mL水，超声波促其溶解，乙醚萃取两次，取水相，然后用水饱和正丁醇萃取，收集正丁醇层。60℃蒸干正丁醇，即得到人参总皂苷，用适量的甲醇超声波溶解，定容，HPLC测定含量。

图6为异源表达BbRha基因的人参发根中人参皂苷Rg1的含量测定结果。图中Control为对照，即转空载体pBI121人发根中人参皂苷Rg1经HPLC测定后的含量，T为转BbRha基因的人发根中人参皂苷Rg1经HPLC测定后的含量，结果显示异源表达BbRha基因的人参发根中，人参中皂苷Rg1含量明显上升，与对照相比，转基因人参发根T8，T13和T22在培养30d后，人参皂苷Rg1的含量是对照的1.96、2.17和2.08倍，其中T13中人参皂苷Rg1的含量为3.56mg/g干重。

图7为异源表达BbRha基因的人参发根中人参皂苷Re的含量测定结果。图中Control为对照，即转空载体pBI121人发根中人参皂苷Re经HPLC测定后的含量，T为转BbRha基因的人发根中人参皂苷Re经HPLC测定后的含量，结果显示异源表达BbRha基因的人参发根中，人参中皂苷Re含量明显下降，与对照相比下降了0.6倍。

人参皂苷Re是Rg1分子在C-6位上以鼠李糖糖基化(1,2糖苷键连接)的产物，α-L-鼠李糖苷酶是水解C末端鼠李糖基的重要水解酶，能够水解1,2、1,6等糖苷键(图8)。图6和图7结果表明，BbRha基因表达蛋白在人参发根中能够通过水解1,2糖苷键使人参皂苷Re部分转化成Rg1，进而增加人参皂苷Rg1的含量，并且对人参皂苷Re的转化具有较高选择性，通过该方法可以促进人参皂苷Rg1在人参发根中积累。

综上所述，异源表达来自双歧杆菌的α-L-鼠李糖苷酶基因的转基因人参发根能有效将活性较低人参皂苷Re转化成具有特殊药理活性的人参皂苷Rg1，结果证实BbRha基因表达蛋白在人参根中能够有效提高人参皂苷Rg1的含量，可以利用该方法提高人参皂苷Rg1的产量。

Claims (7)

1.一种提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法，其特征在于：利用BbRha基因提高人参皂苷Rg1含量。

2.根据权利要求1所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法，其特征在于：所述的BbRha基因利用PCR技术克隆与鉴定。

3.根据权利要求1所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法，其特征在于：所述的BbRha基因利用发根农杆菌A4介导法转入人参根，获得过表达BbRha基因的人参发根。

4.根据权利要求3所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法，其特征在于：所述的发根农杆菌A4介导法中，所采用的植物表达载体优选载体pBI121，将BbRha基因克隆到空载体pBI121中，获得重组载体pBI121-BbRha，然后采用冻融法转化制备成含BbRha基因的重组菌。

5.根据权利要求1所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法，其特征在于：所述的BbRha基因利用发根农杆菌A4介导法转入人参根后，还包括卡那霉素筛选、PCR和qRT-PCR检测。

6.权利要求1至5任一项所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法在含人参皂苷Re的植物中的应用。

7.权利要求1至5任一项所述的提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法在生产人参皂苷Rg1单体中的应用。