CN103215234B - 携带锌指核酸酶表达元件和供体dna的腺病毒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒,缺失E1区和E3区,在缺失区插入了锌指核酸酶表达元件和供体DNA。构建方法由构建腺病毒骨架载体、构建携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体、构建携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体、构建携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体、包装和扩增以及纯化步骤组成,携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒在制备治疗遗传性疾病药物中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒及其构建方法和应用。
技术背景
基因组的靶向修饰包括对基因组内源性基因序列的改造或者在基因组的特定位置插入外源性基因片段。这项技术为研究特定基因功能提供了有力工具,此外研究人员可以利用该技术建立特定的动物模型来进行基因功能研究或新药物的研发。传统的基因靶向修饰技术是依赖于自然状态下的同源重组(Homologous recombination,HR),效率非常低,大约为10-6,因而大大限制了该技术的应用。锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)技术的出现给基因组靶向修饰带来了希望。
ZFN技术是近年来发展起来的一项新的技术,通过人工设计的ZFN在基因组DNA的特定位置切割产生双链断裂(DSB),继而通过细胞内源性的修复机制对断裂部位的基因进行修饰。同自然状态下的同源重组技术相比较,ZFN技术可以使基因组靶向修饰的效率提高了103~105倍。ZFN介导的基因定点修饰已经在多种体外培养的细胞中获得成功,包括人的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)、植物、果蝇、爪蟾、线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠等的细胞,显示出该技术的广泛适用性,这将有力地推动基因靶向修饰技术的应用研究。
由于ZFN介导的基因靶向修饰技术需要将ZFN表达元件和供体DNA同时导入到细胞中,因此将ZFN表达元件和供体DNA导入靶细胞的效率成为影响ZFN介导的基因靶向修饰的效率的重要因素。在体外实验中通常采用核转染的方法,这种方法转染效率较高,然而该方法只局限于部分细胞,对有些细胞的转染效率仍然是很低的,且该方法无法在体内实验中使用。腺病毒载体由于其诸多特点,如:宿主范围广、病毒滴度高、载体容量大等,成为将ZFN表达元件和供体DNA同时导入到靶细胞中的一种理想的工具。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述现有技术的缺点,提供一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒的构建方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒提供一种新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是:缺失E1和E3区,在缺失区插入了锌指核酸酶表达元件和供体DNA。
本发明在缺失的E1区插入供体DNA、在缺失的E3区插入锌指核酸酶表达元件,或在缺失的E1区插入锌指核酸酶表达元件、在缺失的E3区插入供体DNA。
本发明的锌指核酸酶表达元件是由真核启动子与其下游的锌指核酸酶基因和转录终止信号组成。
本发明的真核启动子是Tet-on诱导性启动子,该Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的四环素反应元件,在该重复序列两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA,在右侧tightminiCMV的下游插入一对锌指核酸酶基因,在锌指核酸酶基因的3'端连接有转录终止信号;所述的两个锌指核酸酶基因间通过自剪切多肽相连;所说的转录终止信号是SV40pA、TKpA中的一种;
miniCMV的序列如下:
GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC
tight miniCMV的序列如下:
GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。
本发明的供体DNA是靶向该腺病毒所携带的锌指核酸酶的识别位点,它由上、下游同源臂组成,上、下游同源臂分别是由距离该腺病毒载体携带的锌指核酸酶的识别位点1bp到5000bp碱基数的DNA序列组成,每条同源臂的长度为50bp到3000bp。
本发明的供体DNA在上、下游同源臂之间插入了限制性内切酶位点、报告基因表达元件、筛选基因表达元件、功能基因表达元件中的任意一种。
上述携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒的构建方法由以下步骤组成:
1、构建腺病毒骨架载体
以商业化的pAdEasy-1载体为基础进行改造。构建腺病毒E3区穿梭载体,在E3区穿梭载体中插入lacZα筛选基因和SwaⅠ酶切位点,通过同源重组和蓝白斑筛选将SwaⅠ酶切位点引入到腺病毒缺失的E3区,获得可以在缺失的E3区插入外源基因的腺病毒骨架载体。
2、构建携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体
将真核启动子、锌指核酸酶基因、转录终止信号依次插入到腺病毒E3区穿梭载体中。
3、构建携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体
将供体DNA的上、下游同源臂依次插入到腺病毒E1区穿梭载体,在上、下游同源臂之间插入限制性内切酶位点、筛选基因表达元件、功能基因表达元件中的任意一种。
4、将携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体与SwaⅠ线性化的腺病毒骨架载体同源重组获得携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体,将携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体与携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体同源重组获得携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体。
5、将构建好的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞进行包装、扩增、纯化获得纯化的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒。
携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒在制备治疗遗传性疾病药物中的用途。
附图说明
图1是pAdEasy-1载体的结构图。
图2是腺病毒E3区穿梭载体pE3 shuttle的结构图。
图3是腺病毒骨架载体pAd5 backbone的结构图。
图4是锌指核酸酶表达元件Tet on AAVS1 ZFN结构图。
图5是pE1/AAVS1 donor载体的结构图。
图6是携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒结构图。
图7是Ad5(E3)Tet on AAVS1 ZFN/(E1)AAVS1 donor对U2-OS细胞中AAVS1位点靶向修饰效率检测。
图8是pE1/AAVS1 UP-CMV-eGFP-TKpA-DOWN载体的结构图。
图9是pE3 shuttle SwaⅠ载体的结构图。
图10是小鼠部分活化凝血酶原激酶时间检测结果。
具体实施方案
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明,但本发明不限于这些实施例。
实施例1
以携带靶向AAVS1的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒为例,该腺病毒的结构如下:
该腺病毒载体是5型腺病毒载体,缺失了E1区和E3区。在缺失的E3区插入了有Tet-on诱导性启动子调控的锌指核酸酶表达元件。其中Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的四环素反应元件(TRE),在7个重复的TRE两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,
miniCMV的序列如下:
GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC
tight miniCMV的序列如下:
GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。
在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA。在右侧tight miniCMV的下游连接有转录终止信号SV40pA,也可以是TKpA。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之间携带有多克隆位点,在该多克隆位点间插入一对锌指核酸酶基因AAVS1 ZFN。靶向AAVS1位点的一对(左侧AAVS1 ZFNL和右侧AAVS1 ZFNR)锌指核酸酶基因之间通过自剪切多肽(T2A)连接。
在该腺病毒载体缺失的E1区插入了靶向AAVS1位点的供体DNA。该供体DNA由距离AAVS1 ZFN识别位点1bp的长度为500bp的上游同源臂和距离AAVS1位点3bp长度为500bp的下游同源臂组成,在上游同源臂和下游同源臂之间插入了SalⅠ酶切位点,也可以插入ClaI、XbaI、XhoI酶切位点中的任意一种。
该腺病毒的构建方法如下:
1.腺病毒骨架载体的构建
以商业化的pAdEasy-1载体(安捷伦科技有限公司,Agilent technologies)为基础,该载体是E1区和E3区缺失的5型腺病毒(Ad5)骨架载体(如图1)。将其改造为可以在缺失的E3区插入外源表达基因的腺病毒骨架载体。
(1)构建携带LacZα筛选元件的E3区穿梭载体
在上海生工合成以下引物:
P1:ENSHL for aattgcatatgggatccgcggccgcttcgaat;
P2:ENSHL reverse agctattcgaagcggccgcggatcccatatgc;
将ENSHL for和ENSHL reverse在室温退火获得ENSH linker(EcoRⅠ M-NdeⅠ-BamHⅠ-NotⅠ-SfuⅠ-HindⅢ M)。将ENSH linker与经过EcoRⅠ和HindⅢ酶切处理的pUC19载体连接,连接条件:2μl ENSH linker片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,0.5μl pUC19载体,0.5μl T4连接酶,6μl三蒸水,16℃连接过夜,将连接产物转化感受态的DH5α细胞,并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中,14~16小时后,经碱性裂解法提取质粒DNA,通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆分别命名为pUC19/ENSHL。
在上海生工合成以下引物:
P3:E3 UP NdeⅠ for ACATATGCCTTTCTCAAATTTAAGCGCG;
P4:E3 UP BamHⅠ reverse AGGATCCTTGATGTAATCCAAGGTTAG;
P5:E3 DOWN NotⅠ for AGCGGCCGCTTATTCCCTTTAACTAATA;
P6:E3 DOWN SfuⅠ reverse ATTCGAA TTATTCTTGGGCAATGTATG;
以pAdEasy-1为模板,用P3/P4通过聚合酶链式反应(PCR)扩增腺病毒E3区穿梭载体上游同源臂,聚合酶链式反应的条件为:94℃、30秒,98℃、10秒,55℃、15秒,72℃、2分钟,28个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳后回片段即获得E3 UP片段;以P5/P6为引物,用同样的方法可以获得E3 DOWN片段,将这两个片段分别与pGEM-T Easy载体连接。连接条件是:2μl PCR纯化片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,0.5μl T载体,0.5μl T4连接酶,6μl三蒸水,16℃连接过夜,将连接产物转化感受态的DH5α细胞,并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中,14~16小时后,经碱性裂解法提取质粒DNA,通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆分别命名为pGEMT/E3 UP和pGEMT/E3 DOWN。
将pGEMT/E3 UP用NdeⅠ和BamHⅠ酶切处理与经过同样酶切处理的pUC19/ENSHL连接,经过同样的转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pUC19/ENSHL/E3 UP。将pGEMT/E3DOWN用NotⅠ和SfuⅠ酶切处理,与经过同样酶切处理的pUC19/ENSHL/E3 UP连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE3 shuttle(如图2)。
在上海生工合成lacZαDNA序列:
AGGATCCctatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcATTTAAATaagcttggcgtaatcatggtcGCGGCCGCA
在该lacZα序列中引入了SwaⅠ位点。将合成的lacZα片段用BamHⅠ和NotⅠ酶切,与经过同样酶切处理的pE3 shuttle载体连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE3shuttle/lacZα。
(2)构建E3区携带SwaⅠ位点的腺病毒骨架载体
将pE3 shuttle/lacZα载体用SfuⅠ酶切使其线性化,与pAdEasy-1载体共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,将转化后的细菌涂布与氨苄抗性的培养基上,通过蓝白班筛选(挑取蓝色菌落)、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pAd5 backbone(如图3)。至此获得在缺失的E3区插入SwaⅠ位点的腺病毒骨架载体。
2.构建携带靶向AAVS1的锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体
(1)严谨型Tet-on诱导性启动子的构建
在上海生工合成引物,序列如下:
P7:BXL for AATTgGGATCCTCTAGAGAATTCCTCGAGA;
P8:BXL reverse AGCTTCTCGAGGAATTCTCTAGAGGATCCc;
将BXL for和BXL reverse在室温退火,获得BX linker片段(EcoRⅠ M-BamHⅠ-XbaⅠ-EcoRⅠ-XhoⅠ-HindⅢ),将BX Linker片段与经过EcoRⅠ和HindⅢ酶切处理的pUC19的载体连接获得pUC19/BXL。
在上海生工合成SV40pA和TKpA,其序列如下:
SV40pA(XbaⅠ/BamHⅠ):
TCTAGACACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTGGATCC
TKpA(SpeⅠ/NotⅠ):
ACTAGTGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCTAGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGCGGCCGC
载体pTet-on advanced,购自CLONTECH公司,以pTet-on advanced为模板,经过聚合酶链式反应获得反式四环素转录激活因子rtTA2S-M2,并在5’端引入EcoRⅠ位点,3’端引入SpeⅠ位点,引物序列如下:
P9:rtTA2S-M2 EcoRⅠ for GGAATTCATGTCTAGACTGGACAAG;
P10:rtTA2S-M2 SpeⅠ reverse GACTAGTTTACCCGGGGAGCATGTC;
聚合酶链式反应扩增条件是:94℃、2分钟,94℃、30秒,55℃、30秒,72℃、60秒,30个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳后回片段即获得rtTA2S-M2,将回收片段与pGEM-T Easy载体连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定及测序获得的阳性克隆称为pGEMT/rtTA2S-M2。
使用合成引物自身为模板和引物,通过聚合酶链式反应扩增tight miniCMV序列,并在5’端引入SalⅠ位点,3’端引入EcoRⅠ位点,引物序列如下:
P11:tight miniCMV SalⅠ for
GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGT;
P12:tight miniCMV EcoRⅠ reverse
GGAATTCGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGG。
聚合酶链式反应扩增条件是:94℃、2分钟,94℃、30秒,55℃、30秒,72℃、20秒,30个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为2.0%的琼脂糖电泳后回片段即获得tight miniCMV,将回收片段与pGEM-T Easy载体连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定及测序获得的阳性克隆称为pGEMT/tight miniCMV。
将SV40pA(XbaⅠ/BamHⅠ)用XbaⅠ和BamHⅠ酶切处理,通过DNA凝胶电泳回收SV40pA片段与经过同样酶切处理的pUC19/BXL载体连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得的阳性克隆称为pUC19/BXL/SV40。
pTRE2pur载体购自CLONTECH公司,经XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切后,反应产物经质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳后回收TRE-miniCMV片段(该片段中包含7个重复的TRE和位于TRE左侧的miniCMV),与经同样酶切的载体pUC19/BXL/SV40进行,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得的阳性克隆称为pUC19/BXL/TRE-miniCMV/SV40。将载体pGEMT/rtTA2S-M2经EcoRⅠ与SpeⅠ双酶切后,经1.0%的琼脂糖电泳后回收得到片段rtTA2S-M2,将其与经EcoRⅠ和XbaⅠ酶切的载体pUC19/BXL/TRE-miniCMV/SV40连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得的阳性克隆称为pUC19/BXL/TRE-miniCMV/rtTA2S-M2/SV40。将pUC19/BXL/TRE-miniCMV/rtTA2S-M2/SV40用EcoRⅠ酶切,然后用T4 DNA polymerase补平,从补平产物中取1.5μl DNA进行连接,连接条件如下::补平产物1.5μl,10×T4连接酶缓冲液1μl,T4连接酶0.5μl,三蒸水7μl,16℃连接过夜,连接产物经转化、小提、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40。
在上海生工合成引物,序列如下:
P13:XHL for:TCGAGGAATTCATCGATACTAGTGCGGCCGCA;
P14:XHL reverse:AGCTTGCGGCCGCACTAGTATCGATGAATTCC;
将XHL for和XHL reverse在室温退火获得XH Linker片段(XhoⅠ-EcoRⅠ-ClaⅠ-SpeⅠ-NotⅠ-Hind Ⅲ)。将XHL片段与经过Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切处理的pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40载体连接,连接条件是:2μl XH Linker片段,1μl10×T4连接酶缓冲液,0.5μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,6μl三蒸水,16℃连接过夜,连接产物经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL。
将pGEMT/tight-miniCMV用SalⅠ和EcoRⅠ酶切,并通过琼脂糖凝胶电泳回收tight-miniCMV片段,与经过XhoⅠ和EcoRⅠ酶切处理的pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL载体连接,连接产物经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV。
将TKpA片段用SpeⅠ和NotⅠ酶切,并通过琼脂糖凝胶电泳回收TKpA片段,与经过同样酶切处理的pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV载体连接,连接产物经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV/TKpA。将pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV/TKpA用BamHⅠ和NotⅠ酶切处理,并通过琼脂糖凝胶电泳回收TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV/TKpA片段,与经过同样酶切处理的pE3shuttle载体连接,连接产物经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,至此获得了携带有Tet-on诱导性启动子的腺病毒E3区穿梭载体pE3/Tet on。
(2)携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体的构建
在上海生工合成引物,序列如下:
P15:EHL for AATTgATCGATACTAGTt;
P16:EHL reverse AGCTaACTAGTATCGATc;
将EHL for和EHL reverse在室温退火获得EH Linker片段(EcoR ⅠM-ClaⅠ-SpeⅠ-HindⅢ M)。将EHL片段与经过EcoRⅠ和HindⅢ酶切处理的pUC19载体连接,连接产物经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pUC19/EHL。
在上海生工合成锌指核酸酶基础结构,即NLS-Flag-FokⅠ DD-T2A-NLS-HA-FokⅠ RR,并在序列的两端引入ClaⅠ和SpeⅠ位点,在Flag和FokⅠ DD之间引入HindⅢ和XhoⅠ位点用于插入左侧的锌指蛋白,在HA和FokⅠ RR之间引入KpnⅠ和BamHⅠ位点用于插入右侧的锌指蛋白。锌指核酸酶基础结构的序列如下:
ATcGAtATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCGACTACAAAGATGACGATGATAAGAAGCTTGTCTCGAgCTGGGAGGCTCTCAGCTGGTTAAATCCGAGTTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTCCGCcATAAGTTGAAATACGTGCCTCACGAGTATATCGAACTGATCGAGATCGCCAGAAACTCAACCCAAGACAGGATTTTGGAAATGAAAGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTCTATGGCTATAGGGGAAAGCACCTCGGCGGGAGCAGGAAGCCCGACGGCGCCATTTATACAGTCGGGTCTCCAATCGACTATGGGGTCATCGTTGACACTAAGGCCTATTCCGGGGGTTACAACCTCCCAATAGGGCAGGctGACGAGATGCAGGACTACGTGGAGGAGAACCAAACAAGGAACAAGCATATAAACCCTAACGAGTGGTGGAAAGTATACCCTAGTTCTGTTACTGAGTTCAAGTTTCTCTTCGTGAGCGGACACTTCAAAGGAAATTACAAAGCTCAACTGACAAGACTGAATCATATTACTAACTGTAATGGTGccGTCCTGTCAGTGGAGGAACTGCTGATTGGCGGAGAGATGATCAAGGCAGGCACCCTTACTCTCGAAGAAGTGCGGCGAAAGTTTAATAACGGTGAAATCAACTTCTCTAGAGAGGGAAGGGGGTCTCTCCTGACCTGTGGGGATGTGGAAGAAAATCCCGGTCCGGAATTCATGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGCAGCTATCCCTATGACGTGCCCGATTATGCAGCTCACGGtACcaaGGaTCcCTGGGTGGATCTCAGTTGGTGAAATCCGAGCTGGAGGAGAAAAAGTCAGAGCTGCGCCACAAACTCAAGTACGTGCCACACGAATACATTGAGCTGATCGAGATCGCCAGGAACTCCACGCAGGACAGAATCCTgGAGATGAAGGTAATGGAATTTTTCATGAAGGTGTACGGCTACAGAGGCAAGCATCTGGGAGGGTCCCGCAAGCCTGATGGAGCAATCTACACCGTCGGAAGCCCCATaGATTACGGGGTAATCGTCGATACCAAAGCATATAGTGGCGGATACAACCTGCCAATCGGCCAAGCCCGGGAAATGCAGCGATACGTGGAAGAAAACCAGACTAGGAACAAACACATTAACCCAAACGAATGGTGGAAAGTCTATCCTAGCTCTGTGACGGAGTTCAAGTTTCTCTTTGTTTCCGGCCATTTCAAGGGGAATTACAAGGCTCAGCTGACAAGGCTGAATCATATTACTAATTGTAACGGGGCCGTTCTCTCAGTGGAAGAGCTGCTGATTGGCGGAGAGATGATTAAAGCCGGCACCCTTACCCTGGAAGAGGTTCGGCGGAAATTCAACAATGGCGAGATAAACTTTTGAACTAGT
将合成的锌指核酸酶基础结构用ClaⅠ和SpeⅠ酶切处理后与经过同样酶切处理的pUC19/EHL连接。连接条件是:2μl酶切纯化片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,0.5μl载体,0.5μlT4连接酶,6μl三蒸水,16℃连接过夜,将连接产物转化感受态的DH5α细胞,并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中,14~16小时后,经碱性裂解法提取质粒DNA,通过酶切鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pUC19/EHL/FokⅠ DD-T2A-FokⅠ RR。
根据已经报道的靶向AAVS1位点的锌指蛋白的序列,在上海生工合成靶向AAVS1位点的一对锌指蛋白基因,分别命名为AAVS1 ZFL和AAVS1 ZFR。并且在AAVS1ZFL和AAVS1 ZFR的两端分别引入了HindⅢ-SalⅠ和KpnⅠ-BglⅡ酶切位点。序列如下:
AAVS1 ZFL:
AAAGCTTATGGCCGAGAGACCCTTCCAGTGCAGGATCTGCATGCGGAACTTTAGCTACAACTGGCACCTGCAGAGACATATTAGGACCCACACCGGCGAAAAGCCCTTTGCTTGCGACATTTGCGGACGGAAATTCGCCAGGAGCGACCACCTGACCACCCACACAAAGATCCATACAGGAAGCCAGAAGCCATTTCAATGTAGAATTTGTATGAGGAATTTCTCCCACAACTACGCCAGGGACTGCCATATCCGGACACACACAGGGGAGAAACCATTCGCCTGTGATATCTGTGGCAGAAAGTTTGCCCAGAACAGCACCAGAATCGGCCACACCAAAATTCATGTCGACA;
AAVS1 ZFR:
AGGTACCATGGCCGAGAGACCCTTCCAGTGCAGGATCTGCATGCGGAACTTTAGCCAGAGCAGCAACCTGGCCAGACATATTAGGACCCACACCGGCGAAAAGCCCTTTGCTTGCGACATTTGCGGACGGAAATTCGCCAGAACCGACTACCTGGTGGACCACACAAAGATCCATACAGGAAGCCAGAAGCCATTTCAATGTAGAATTTGTATGAGGAATTTCTCCTACAACACCCACCTGACCAGACATATCCGGACACACACAGGGGAGAAACCATTCGCCTGTGATATCTGTGGCAGAAAGTTTGCCCAGGGCTACAACCTGGCCGGCCACACCAAAATTCATAGATCTA;
将AAVS1ZFL用HindⅢ和SalⅠ酶切,与经过HindⅢ和XhoⅠ酶切处理的pUC19/EHL/FokⅠ DD-T2A-FokⅠ RR载体连接,经过转化、提取质粒、酶切鉴定,获得阳性克隆命名为pUC19/EHL/AAVS1 ZFL-FokⅠ DD-T2A-FokⅠ RR。将AAVS1ZFR用KpnⅠ和BglⅡ酶切处理,与经过KpnⅠ和BamHⅠ酶切处理的pUC19/EHL/AAVS1ZFL-FokⅠ DD-T2A-FokⅠ RR载体连接,经过转化、提取质粒、酶切鉴定,获得阳性克隆命名为pUC19/EHL/AAVS1 ZFN(即pUC19/EHL/AAVS1ZFL-FokⅠ DD-T2A-AAVS1ZFR-FokⅠ RR)。靶向AAVS1的一对锌指核酸酶基因AAVS1ZFL-FokⅠ DD和AAVS1 ZFR-FokⅠ RR之间通过自剪切多肽T2A相连。
将pUC19/EHL/AAVS1 ZFN用ClaⅠ和SpeⅠ酶切并通过琼脂糖凝胶电泳回收AAVS1 ZFN片段,与经过同样酶切处理的pE3/Tet on载体连接,经过转化、质粒提取及酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE3/Tet on/AAVS1 ZFN(如图4)。至此获得携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体,该载体中锌指核酸酶基因的表达是通过Tet-on诱导性启动子调节。
在上海生工合成CMV启动子,序列如下:
GGATCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATATCGATTTACTAGT;
用BamHⅠ和SpeⅠ酶切CMV片段,用SpeⅠ和NotⅠ酶切TKpA片段,通过琼脂糖凝胶电泳回收CMV和TKpA片段,与经过BamHⅠ和NotⅠ酶切处理的pE3 shuttle载体连接,连接条件如下:4μl CMV片段,4μl TKpA片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,0.5μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,16℃连接过夜,质粒提取,酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE3/CMV-TKpA。
将pE3/CMV-TKpA用ClaⅠ和SpeⅠ酶切处理,与之前回收好的AAVS1 ZFN片段连接,经过转化、质粒提取及酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE3/CMV-AAVS1 ZFN-TKpA。至此获得了携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体,该载体中锌指核酸酶基因的表达由真核启动子CMV调节。
3.构建携带靶向AAVS1的供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体
在上海生工合成引物,序列如下:
P17:KBL for CGGATCCATCGATACTAGTGCGGCCGCGTCGACA;
P18:KBL reverse
GATCTGTCGACGCGGCCGCACTAGTATCGATGGATCCGGTAC;
将KBL for和KBL reverse在室温退火获得KB Linker片段(KpnⅠ-BamHⅠ-ClaⅠ-SpeⅠ-NotⅠ-SalⅠ-BglⅡ)。将KB Linker片段与经过KpnⅠ和BglⅡ酶切处理的pshuttle载体(购买自安捷伦科技有限公司,Agilent technologies)连接,将连接产物转化到大肠杆菌DH5α细胞,并涂布于卡那抗性的培养基上,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pE1 shuttle。
依据AAVS1位点的基因组序列设计引物用于扩增上下游同源臂,引物序列如下:
P19:AAVS1 UP KpnⅠ for AGGTACCcttcactcgctgggttcc
P20:AAVS1 UP SalⅠ reverse AGTCGACggaggggacagataaaag
P21:AAVS1 DOWN SalⅠ for AGTCGACgtgacagaaaagccccatc
P22:AAVS1 DOWN BglⅡreverse AAGATCTcagccctgccaggacggg
采用飞捷生物试剂公司的微量基因组DNA极速抽提试剂盒从HEK293细胞中提取人基因组DNA,并以此基因组DNA为模板,用引物P19/P20通过聚合酶链式反应获得上游同源臂AAVS1UP。聚合酶链式反应体系为:5μl 10×PCR buffer、1μl P19、1μl P20、0.5μl LA Taq、1μl基因组DNA、1μl 10mM dNTPs、40.5μl三蒸水。聚合酶链式反应扩增条件:94℃、5分钟,94℃、30秒,55℃、30秒,72℃、1分钟,反应循环次数为30次。用同样的方法以P21/P22为引物,可获得下游同源臂AAVS1 DOWN。将AAVS1 UP和AAVS1 DOWN分别与pGEM-T Easy载体连接,连接条件是:2μl PCR纯化片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,1μl pGEM-T Easy,0.5μl T4连接酶,5.5μl三蒸水,14.5℃连接过夜。然后将连接产物转化、提取质粒、酶切鉴定并测序获得阳性克隆,分别命名为pGEMT/AAVS1 UP和pGEMT/AAVS1 DOWN。
将pGEMT/AAVS1 UP用KpnⅠ和SalⅠ酶切处理,pGEMT/AAVS1 DOWN用SalⅠ和BglⅡ处理,通过琼脂糖凝胶电泳分别回收AAVS1 UP片段和AAVS1 DOWN片段,与经过KpnⅠ和BglⅡ酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体pE1 shuttle连接,连接条件:pE1 shuttle载体0.5μl,AAVS1 UP4μl,AAVS1 DOWN 4μl,10×T4连接酶缓冲液1μl,T4连接酶0.5μl,16℃连接过夜。经过转化、提取质粒、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pE1/AAVS1 Donor(如图5)。至此获得了携带靶向AAVS1位点的供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体,该供体DNA由500bp的上游同源臂和500bp的下游同源臂组成,在上游和下游同源臂之间引入了SalⅠ限制性内切酶位点。
4.携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体的构建
(1)携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体的构建
将腺病毒骨架载体pAd5 backbone用SwaⅠ线性化,与经过SfuⅠ线性化的携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体pE3/Tet on/AAVS1ZFN共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5(E3)Tet on AAVS1ZFN。
将腺病毒骨架载体pAd5 backbone用SwaⅠ线性化,与经过SfuⅠ线性化的携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体pE3/CMV-AAVS1 ZFN-TKpA共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5(E3)CMV AAVS1 ZFN。
(2)携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体的构建
将pE1/AAVS1 Donor载体用PmeⅠ线性化,与pAd5(E3)Tet on AAVS1 ZFN共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,将转化后的大肠杆菌BJ5183涂布于卡那抗性的培养基上,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5(E3)Tet on AAVS1ZFN/(E1)AAVS1 donor(如图6)。
将pE1/AAVS1 Donor载体用PmeⅠ线性化,与pAd5(E3)CMV AAVS1 ZFN共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,将转化后的大肠杆菌BJ5183涂布于卡那抗性的培养基上,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5(E3)CMV AAVS1ZFN/(E1)AAVS1 donor。
至此就获得了携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体。
(3)对照腺病毒载体的构建
将pE1 shuttle载体用PmeⅠ线性化,与pAd5(E3)CMV AAVS1 ZFN共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,将转化后的大肠杆菌BJ5183涂布于卡那抗性的培养基上,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5 CMV AAVS1 ZFN。
将pE1/AAVS1 Donor载体用PmeⅠ线性化,与腺病毒骨架载体pAd5 backbone共转化BJ5183进行同源重组,将转化后的大肠杆菌BJ5183涂布于卡那抗性的培养基上,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5 AAVS1 Donor。
5、腺病毒的包装、扩增、纯化
采用磷酸钙法将PacⅠ线性化的pAd5(E3)Tet on AAVS1 ZFN/(E1)AAVS1 donor腺病毒载体转染HEK293细胞系。经过7~10天后,可见明显的细胞病变,2500转/分钟离心收获病毒原液,经2~3轮的病毒扩增后,将所获得的病毒原液感染10个150mm细胞培养皿的HEK293细胞,扩增获得的病毒原液用于后续的进一步纯化。感染的病毒的细胞经过反复冻融3次(37℃/酒精干冰)后经3500rpm离心15分钟,通过两次氯化铯密度梯度(下层1.4g/ml,上层1.2g/ml)离心(转速20000转/分钟)获得纯化的Ad5(E3)Tet on AAVS1 ZFN/(E1)AAVS1 donor腺病毒载体,至此获得纯化的携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒。用同样的方法可以获得对照腺病毒Ad5(E3)CMV AAVS1 ZFN/(E1)AAVS1 donor、Ad5CMV AAVS1 ZFN、Ad5 AAVS1 Donor。
6、携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒对U2-OS细胞中AAVS1位点的靶向修饰
以1×106的密度将U2-OS细胞接种于A、B、C、D四个60mm培养皿。次日,用100MOI的Ad5(E3)Tet on AAVS1 ZFN/(E1)AAVS1 donor感染A盘U2-OS,在感染完病毒后立即在培养基中加入2μg/ml的强力霉素(Doxycycline),每两天换一次培养基,并加入新的强力霉素;用100MOI的Ad5(E1)AAVS1 donor和100MOI的Ad5(E3)CMV AAVS1 ZFN共感染B盘U2-OS;用100MOI的Ad5(E1)AAVS1 donor感染C盘U2-OS;5μg pE3/CMV-AAVS1 ZFN-TKpA和20μg pE1/AAVS1Donor共转染(电转)D盘U2-OS细胞。在感染或转染后的第五天收集细胞,用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司,DP304-02)提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应扩增靶位点附近约1kb的DNA片段,引物序列如下:
P23:AAVS1 detection primer for tgggtcctctccgggcatctct
P24:AAVS1 detection primer back gggagttttccacacggacac
取500ng的该聚合酶链式反应的产物,用20U的SalⅠ酶处理3小时后,跑DNA凝胶电泳检测,用DNA凝胶成像系统拍照。结果如图7
由图7中可见,与其它三组样品相比,Ad5(E3)Tet on AAVS1 ZFN/(E1)AAVS1 donor感染的U2-OS细胞对AAVS1位点有较高的靶向修饰效率。
实施例2
以携带靶向AAVS1的锌指核酸酶表达元件和供体DNA(供体DNA中携带报告基因表达元件)的腺病毒载体的构建为例,该载体的结构如下:
在该腺病毒载体的缺失的E3区插入了有Tet-on诱导性启动子调控的锌指核酸酶表达元件。其中Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的TRE(rtTA2S-M2结合位点),在该重复序列两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA。在右侧tight miniCMV的下游连接有转录终止信号SV40pA,也可以是TKpA,在tight miniCMV和其下游的SV40pA之间携带有多克隆位点,在该多克隆位点间插入锌指核酸酶基因AAVS1 ZFN。靶向AAVS1位点的一对(左侧AAVS1 ZFNL和右侧AAVS1 ZFNR)锌指核酸酶之间通过自剪切多肽(T2A)连接。
在该腺病毒载体的缺失的E1区插入了靶向AAVS1位点的供体DNA。该供体DNA由距离AAVS1 ZFN识别位点563bp长度为900bp的上游同源臂和距离AAVS1位点180bp长度为929bp的下游同源臂组成,在上游同源臂和下游同源臂之间插入了CMV-eGFP-TKpA报告基因表达元件,也可以插入mcherry报告基因表达元件、荧光素酶报告基因表达元件、Neomycin筛选基因表达元件、Hygromycin筛选基因表达元件中的任意一种。
该腺病毒载体的构建方法如下:
本实施例的步骤3携带靶向AAVS1的供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体的构建过程如下:
在上海生工合成引物,序列如下:
P25:AAVS1 900UP KpnⅠfor AGGTACCcggtatcagcgccctgcaccag;
P26:AAVS1 900UP BamHⅠ reverse AGGATCCgctcagaggacatcacgtggt;
P27:AAVS1 929DOWN SalⅠ for AGTCGACggagggagagcttggcaggg;
P28:AAVS1 929DOWN BglⅡ reverse AAGATCTcccagctcccctgcttctt;
以人基因组DNA为模板,以P25/P26为引物,通过聚合酶链式反应获得长度为900bp的上游同源臂AAVS1 900UP;以P27/P28为引物,通过聚合酶链式反应获得长度为929bp的下游同源臂AAVS1 929DOWN。用KpnⅠ和BamHⅠ酶切pE1 shuttle载体,与经过同样酶切处理的AAVS1900UP片段连接,连接条件如下:4μl酶切回收片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,0.5μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,4μl三蒸水,16℃连接过夜,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE1/AAVS1 900UP。将pE1/AAVS1 900UP用SalⅠ和BglⅡ酶切作为载体,与经过同样酶切处理的AAVS1 929DOWN片段连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE1/AAVS1UP-DOWN。
将pE1/AAVS1 UP-DOWN载体用BamHⅠ和NotⅠ酶切,与实施例1中经过BamHⅠ和SpeⅠ酶切并回收的CMV启动子、SpeⅠ和NotⅠ酶切并回收的TKpA片段连接,连接条件如下:4μlCMV片段,4μl TKpA片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,0.5μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,16℃连接过夜。经过转化、提取质粒、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pE1/AAVS1UP-CMV-TKpA-DOWN。
在生海生工合成引物,序列如下:
P29:eGFP ClaⅠ for AATCGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA;
P30:eGFP SpeⅠ reverse AACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT;
以pEGFP-N1(购买至Clontech公司)为模板,通过聚合酶链式反应获得eGFP基因,将该基因片段与pGEM-T Easy载体连接后,经过转化、质粒提取、酶切鉴定,获得阳性克隆命名为pGEMT/eGFP。将pGEMT/eGFP用ClaⅠ和SpeⅠ酶切,与经过同样酶切处理的pE1/AAVS1UP-CMV-TKpA-DOWN载体连接,连接条件为:4μl酶切回收片段,1μl10×T4连接酶缓冲液,0.5μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,4μl三蒸水,16℃连接过夜,经过同样的方法转化、提取质粒、酶切鉴定,获得阳性克隆命名为pE1/AAVS1 UP-CMV-eGFP-TKpA-DOWN(如图8)。至此获得携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体,该供体DNA由900bp的上游同源臂和929bp的下游同源臂组成,在上、下游同源臂之间插入了CMV-eGFP-TKpA报告基因表达元件,也可以插入mcherry报告基因表达元件、荧光素酶报告基因表达元件、Neomycin筛选基因表达元件、Hygromycin筛选基因表达元件中的任意一种。
其它步骤与实施例1相同,可获得携带靶向AAVS1的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体,供体DNA中携带报告基因表达元件。
实施例3
以携带靶向AAVS1的锌指核酸酶表达元件和供体DNA(供体DNA包含50bp的上、下游同源臂)的腺病毒载体的构建为例,该载体的结构如下:
在该腺病毒载体的E3区插入了有Tet-on诱导性启动子调控的锌指核酸酶表达元件。其中Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的TRE(rtTA2S-M2结合位点),在该重复序列两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA。在右侧tight miniCMV的下游连接有转录终止信号SV40pA(也可以是TKpA),在tight miniCMV和其下游的SV40pA之间携带有多克隆位点,在该多克隆位点间插入锌指核酸酶基因AAVS1ZFN。靶向AAVS1位点的一对(左侧AAVS1ZFNL和右侧AAVS1 ZFNR)锌指核酸酶之间通过自剪切多肽(T2A)连接。
在该腺病毒载体的E1区插入了靶向AAVS1位点的供体DNA。该供体DNA由距离AAVS1ZFN识别位点1bp长度为50bp的上游同源臂和距离AAVS1位点3bp长度为50bp的下游同源臂组成,在上游同源臂和下游同源臂之间插入了SalⅠ酶切位点,也可以插入NotⅠ、PacⅠ、PmeⅠ酶切位点中的任意一种。
该腺病毒载体的构建方法如下:
在该实施例的步骤3携带靶向AAVS1的供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体的构建过程如下:
在上海生工合成如下引物:
P31:AAVS1 UP 50arm KpnⅠ for AGGTACCagggccggttaatgtggct;
P32:AAVS1 UP 50arm SalⅠ reverse AGTCGACggaggggacagataaaag
P33:AAVS1 DOWN50arm SalⅠ for AGTCGACgtgacagaaaagccccatc
P34:AAVS1 DOWN50arm BglⅡ reverse AAGATCTtatcaggagactaggaa
以人基因组DNA为模板,以P31/P32为引物,通过聚合酶链式反应获得50bp上游同源臂AAVS1 50UP。聚合酶链式反应体系为:5μl 10×PCR buffer、1μl P31、1μl P32、0.5μl LA Taq、1μl基因组DNA、1μl 10mM dNTPs、40.5μl三蒸水。聚合酶链式反应扩增条件:94℃、5分钟,94℃、30秒,55℃、30秒,72℃、20秒,反应循环次数为30次。用同样的方法以P33/P34为引物,可获得50bp下游同源臂AAVS1 50DOWN。将AAVS1 50UP和AAVS1 50DOWN分别与pGEM-T Easy载体连接,连接条件是:2μl PCR纯化片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,1μl T载体,0.5μl T4连接酶,5.5μl三蒸水,16℃连接过夜。然后用同样的方法转化、提取质粒、酶切鉴定并测序获得阳性克隆,分别命名为pGEMT/AAVS1 50UP和pGEMT/AAVS1 50DOWN。
将pGEMT/AAVS1 50UP用KpnⅠ和SalⅠ酶切处理,pGEMT/AAVS1 50DOWN用SalⅠ和BglⅡ处理,通过琼脂糖凝胶电泳分别回收AAVS1 50UP片段和AAVS1 50DOWN片段,与经过KpnⅠ和BglⅡ酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体pE1 shuttle连接,连接条件:pE1 shuttle载体0.5μl,AAVS1 50UP 4μl,AAVS1 50DOWN 4μl,10×连接酶缓冲液1μl,T4连接酶0.5μl,16℃连接过夜。经过转化、提取质粒、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pE1/AAVS 1Donor3。至此获得了携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体,该供体DNA由50bp的上游同源臂和50bp的下游同源臂组成,在上游和下游同源比之间引入了SalⅠ限制性内切酶位点,也可以插入NotⅠ、PacⅠ、PmeⅠ酶切位点中的任意一种。
其它步骤与实施例1相同,可获得携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体。
实施例4
以携带靶向AAVS1的锌指核酸酶和供体DNA(供体DNA包含750bp的上游同源臂、3kb下游同源臂,在上、下游同源臂间引入了SalⅠ限制性内切酶位点)的腺病毒载体的构建为例,该载体的结构如下:
在该腺病毒载体的E3区插入了有Tet-on诱导性启动子调控的锌指核酸酶表达元件。其中Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的TRE(rtTA2S-M2结合位点),在该重复序列两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA。在右侧tight miniCMV的下游连接有转录终止信号SV40pA,也可以是TKpA。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之间携带有多克隆位点,在该多克隆位点间插入锌指核酸酶基因AAVS1 ZFN。靶向AAVS1位点的一对(左侧AAVS1 ZFNL和右侧AAVS1 ZFNR)锌指核酸酶之间通过自剪切多肽(T2A)连接。
在该腺病毒载体的E1区插入了靶向AAVS1位点的供体DNA。该供体DNA由距离AAVS1ZFN识别位点5000bp长度为750bp的上游同源臂和距离AAVS1位点1bp长度为3000bp的下游同源臂组成,在上游同源臂和下游同源臂之间插入了SalⅠ酶切位点。
该腺病毒载体的构建方法如下:
在该实施例的步骤3携带靶向AAVS1的供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体的构建方法如下:
在上海生工合成如下引物:
P35:AAVS1 750bp UP KpnⅠ for AGGTACCCTGCCATCAGGAACTGAG
P36:AAVS1 750bp UP SalⅠ reverse
AGTCGACTCAATTTTATACTTTTGTG
P37:AAVS1 3000bp DOWN SalⅠ for AGTCGACtggtgacagaaaagcccca
P38:AAVS1 3000bp DOWN BglⅡ reverse AAGATCTtccaccaagaagcgcacc
以人基因组DNA为模板,用引物P35/P36通过聚合酶链式反应获得长度为750bp的上游同源臂AAVS1 750UP。聚合酶链式反应体系为:5μl 10×PCR buffer、1μl P35、1μl P36、0.5μl LA Taq、1μl基因组DNA、1μl 10mM dNTPs、40.5μl三蒸水。聚合酶链式反应扩增条件:94℃、5分钟,94℃、30秒,55℃、30秒,72℃、1分钟,反应循环次数为30次。用同样的方法以P37/P38为引物,可获得长度为3000bp的下游同源臂AAVS1 3000DOWN。将AAVS1 750UP和AAVS13000DOWN通过DNA凝胶电泳回收,分别与pGEM-T Easy载体连接,连接条件是:2μl PCR纯化片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,1μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,5.5μl三蒸水,14.5℃连接过夜。然后用同样的方法转化、提取质粒、酶切鉴定并测序获得阳性克隆,分别命名为pGEMT/AAVS1 750UP和pGEMT/AAVS1 3000DOWN。将pGEMT/AAVS1 750UP用KpnⅠ和SalⅠ酶切处理,通过琼脂糖凝胶电泳回收AAVS1 750UP片段,与经过KpnⅠ和SalⅠ酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体pE1 shuttle连接,连接条件:pE1 shuttle载体0.5μl,AAVS1 750UP 4μl,10×T4连接酶缓冲液1μl,T4连接酶0.5μl,三蒸水4μl,16℃连接过夜。经过转化、提取质粒、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pE1/AAVS1 750UP。将pGEMT/AAVS1 3000DOWN用SalⅠ和BglⅡ酶切处理,通过琼脂糖凝胶电泳回收AAVS1 3000DOWN片段,与经过SalⅠ和BglⅡ酶切处理的pE1/AAVS1 750UP连接,连接条件:pE1/AAVS1 750UP载体0.5μl,AAVS1 3000DOWN 4μl,10×T4连接酶缓冲液1μl,T4连接酶0.5μl,三蒸水4μl,16℃连接过夜。经过转化、提取质粒、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pE1/AAVS1 donor4。至此获得了携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体,该供体DNA由750bp的上游同源臂和3000bp的下游同源臂组成,在上游和下游同源比之间引入了SalⅠ限制性内切酶位点。
其它步骤与实施例1相同,可获得携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体。
实施例5
以携带靶向AAVS1的锌指核酸酶和供体DNA,同时Fiber经过RGD小肽修饰的腺病毒载体为例,该载体的结构如下:
在该腺病毒载体的缺失E3区插入了有Tet-on诱导性启动子调控的锌指核酸酶表达元件。其中Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的TRE(rtTA2S-M2结合位点),在该重复序列两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA。在右侧tight miniCMV的下游连接有转录终止信号SV40pA,也可以是TKpA。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之间携带有多克隆位点,在该多克隆位点间插入锌指核酸酶基因AAVS1ZFN。靶向AAVS1位点的一对(左侧AAVS1 ZFNL和右侧AAVS1 ZFNR)锌指核酸酶之间通过自剪切多肽(T2A)连接。
在该腺病毒载体的E1区插入了靶向AAVS1位点的供体DNA。该供体DNA由距离AAVS1ZFN识别位点1bp长度为500bp的上游同源臂和距离AAVS1位点3bp长度为500bp的下游同源臂组成,在上游同源臂和下游同源臂之间插入了SalⅠ酶切位点。
该腺病毒载体的纤维蛋白Fiber经过了RGD小肽修饰。
该腺病毒载体的构建方法如下:
1.携带供体DNA的E1区穿梭载体的构建
该步骤与实施例1相同。
2.构建携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体
在上海生工合成引物,序列如下:
P39:E3 DOWN SwaⅠ for
CGCTACAGCCATAGCCATTtaAATGCAGGAGATGGGCTTGAA;
P40:E3 DOWN SwaⅠ reverse
TTCAAGCCCATCTCCTGCATTtaAATGGCTATGGCTGTAGCG;
以pGEMT/E3 DOWN为模板,以P39/P40为引物,采用Stratagene定点突变试剂盒(货号:200518)进行定点突变,在E3 DOWN片段中产生一个SwaⅠ限制性内切酶位点,经过测序获得阳性克隆命名为pGEMT/E3 DOWN SwaⅠ,该质粒在E3 DOWN中引入了SwaⅠ酶切位点。将pGEMT/E3 DOWN SwaⅠ用NotⅠ和SfuⅠ酶切处理,与经过同样酶切处理的pUC19/EMSHL/E3 UP连接,连接条件如下:2μl酶切纯化片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,1μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,5.5μl三蒸水,14.5℃连接过夜。经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE3shuttle SwaⅠ(如图9)。
将pE3/Tet on/AAVS1 ZFN用BamHⅠ和NotⅠ酶切处理获得Tet on-AAVS1 ZFN,与经过同样酶切处理的pE3 shuttle SwaⅠ载体连接,经过转化、质粒提取及酶切鉴定获得阳性克隆命名为pE3SwaⅠ/Tet on/AAVS1 ZFN。
3.经RGD修饰的Fiber区穿梭载体的构建
在上海生工合成引物,序列如下:
P41:HSNEL for:AGCTAAGTACTCTCGAGAAGAATTCTTGCGGCCGCA;
P42:HSNEL reverse:
AATTTGCGGCCGCAAGAATTCTTCTCGAGAGTACTT;
将HSNEL for和HSNEL reverse在室温退火得到HSNE Linker片段(HindⅢM-ScaⅠ-XhoⅠ-EcoRⅠ-NotⅠ-EcoRⅠM)。将HSNE Linker片段与经过HindⅢ和EcoRⅠ酶切处理的pUC19(购买自clontech公司)载体连接,连接条件是:2μl HSNE Linker片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,1μl酶切载体,0.5μl T4连接酶,5.5μl三蒸水,14.5℃连接过夜。经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得pUC19/HSNEL。
在上海生工合成以下引物:
P43: Fiber UP Xho Ⅰ for ACTCGAGtctagttacctccaatggcatg
P44:Fiber UP EcoR Ⅰ reverse
AGAATTCGTCTCCGCGagttgtgtctcctgtttcctgtg
P45:Fiber DOWN EcoR Ⅰ for AGAATTCccaagtgcatactctatgtcat
P46:Fiber DOWN Not Ⅰ reverse AGCGGCCGCcggttccctgcagtgtatag
以pAdeasy-1为模板,通过聚合酶链式反应扩增腺病毒Fiber区穿梭载体上、下游同源臂,用P43/P44扩增上游同源臂Fiber UP;用P45/P46扩增下游同源臂Fiber DOWN。聚合酶链式反应的条件为:94℃、5分钟,94℃、30秒,55℃、30秒,72℃、2分钟,28个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0%的琼脂糖电泳后回片段即获得Fiber UP和Fiber DOWN片段,将这两个片段分别与pGEM-T Easy载体连接。连接条件是:2μl PCR纯化片段,1μl 10×T4连接酶缓冲液,0.5μl pGEM-T Easy载体,0.5μl T4连接酶,6μl三蒸水,16℃连接过夜,将连接产物转化感受态的DH5α细胞,并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中,14~16小时后,经碱性裂解法提取质粒DNA,通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆分别命名为pGEMT/Fiber UP和pGEMT/Fiber DOWN。将pGEMT/Fiber UP用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切处理与经过同样酶切处理的pUC19/HSNEL连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pUC19/HSNEL/Fiber UP。将pGEMT/Fiber DOWN用EcoRⅠ和NotⅠ酶切处理,与经过同样酶切处理的pUC19/HSNEL / Fiber UP连接,经过转化、质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆命名为pFiber-RGD。至此获得了RGD修饰的腺病毒Fiber区穿梭载体。
4.携带靶向AAVS1的锌指核酸酶表达元件和供体DNA,且Fiber经过RGD修饰的腺病毒载体的构建
1)携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体的构建
将腺病毒骨架载体pAd5 backbone用SwaⅠ线性化,与经过SfuⅠ线性化的腺病毒E3区穿梭载体pE3 SwaⅠ/Tet on/AAVS ZFN共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5(E3)Tet on AAVS1 ZFN SwaⅠ。
2)携带锌指核酸酶表达元件同时Fiber经RGD修饰的腺病毒载体的构建
将Ad5(E3)Tet on AAVS1 ZFN SwaⅠ用SwaⅠ线性化与经过ScaⅠ线性化的pFiber-RGD共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5(E3)Tet onAAVS1 ZFN RGD。
3)携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA,且Fiber经过RGD修饰的腺病毒载体的构建
将pE1/AAVS1 Donor载体用PmeⅠ线性化,与pAd5(E3)Tet on AAVS1 ZFN-RGD共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经过质粒提取、酶切鉴定获得阳性克隆,命名为pAd5(E3)Tet on AAVS1ZFN-RGD/(E1)AAVS1 donor。
至此就获得了携带靶向AAVS1位点的锌指核酸酶表达元件和供体DNA,且Fiber经过RGD修饰的腺病毒载体。
采用与实施例1相同的方法可以包装、扩增、纯化获得Ad5(E3)Tet on AAVS1ZFN-RGD/(E1)AAVS1 donor腺病毒。
实施例6
以构建携带靶向B型血友病致病基因Factor Ⅸ的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒的构建为例。
该载体的结构如下:
在该腺病毒载体的缺失E3区插入了有Tet-on诱导性启动子调控的锌指核酸酶表达元件。其中Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的TRE(rtTA2S-M2结合位点),在该重复序列两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA。在右侧tight miniCMV的下游连接有转录终止信号SV40pA,也可以是TKpA。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之间携带有多克隆位点,在该多克隆位点间插入锌指核酸酶基因FIX ZFN。靶向Factor IX位点的一对(左侧FIX ZFNL和右侧FIX ZFNR)锌指核酸酶之间通过自剪切多肽(T2A)连接。
在该腺病毒载体的E1区插入了靶向Factor IX位点的供体DNA。该供体DNA由距离FIX ZFN识别位点1bp长度为500bp的上游同源臂和距离FIX ZFN识别位点3bp长度为500bp的下游同源臂组成,在上游同源臂和下游同源臂之间依次插入了Factor IX基因和转录终止信号SV40pA。
该载体的构建过程如下:
在该实施例的步骤2(2)携带靶向FactorⅨ位点的锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体的构建中,
在上海生工合成靶向Factor Ⅸ的一对锌指蛋白Factor Ⅸ ZFL和Factor Ⅸ ZFR,序列如下:
Factor Ⅸ ZFL:
AAGCTTAtggcggaacgcccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatgtgctgagcgcgcatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcggatcgcagcaaccgcattaaacataccaaaattcataccggcagccagaaaccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatcatctgagcgaacatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcgcagagcgcgagccgcaaaaaccataccaaaattcatGTCGAC
Factor Ⅸ ZFR:
GGTACCatggcggaacgcccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatctgagcctggtgcatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcgaccagcggccatctgagccgccataccaaaattcataccggcagccagaaaccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatcatctgagccagcatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcggcgagcagcacccgcattacccataccaaaattcatAGATCT
将Factor Ⅸ ZFL和Factor Ⅸ ZFR按照实施例1中相同的方法克隆到pUC19/EHL/FokⅠDD-T2A-FokⅠ RR载体中,获得pUC19/EHL/Factor Ⅸ ZFN。
在步骤3携带靶向Factor Ⅸ的供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体的构建中,在上海生工合成如下引物:
P47 Factor Ⅸ up KpnⅠ for:agactggattaagaaaatgtggcac
P48 Factor Ⅸ up BamHⅠ reverse:aacctttgctagcagattgtgaaa
P49 Factor Ⅸ down SalⅠ for:gggataaaccagactccctctt
P50 Factor Ⅸ down BglⅡ reverse:atctatctcacaggtgttggcag
人基因组DNA为模板,以P47/P48为引物,扩增Factor Ⅸ UP;以P49/P50为引物扩增FactorⅨ DOWN。将Factor Ⅸ UP和Factor Ⅸ DOWN分别克隆入pE1 shuttle载体,获得pE1/FIXUP-DOWN。
从NCBI数据库中获取Factor Ⅸ基因序列(NM_000133),在上海生工合成该基因。并在两端分别加入酶切位点BamHⅠ和SpeⅠ。将Factor Ⅸ基因和TKpA片段分别通过BamHⅠ/SpeⅠ和SpeⅠ/NotⅠ酶切位点依次克隆入pE1/FIX UP-DOWN载体,获得阳性克隆命名为pE1/FIXUP-FactorⅨ-TKpA-DOWN。
其它步骤与实施例1相同,可获得携带靶向B型血友病致病基因FactorⅨ的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒Ad5(E3)Tet on FIX ZFN/(E1)FIX donor。
将pE1/FIX UP-Factor Ⅸ-TKpA-DOWN与腺病毒骨架载体pAd5 backbone同源重组获得携带靶向Factor IX的供体DNA的腺病毒载体pAd5(E1)FIX donor,经过包装、扩增、纯化获得pAd5(E1)FIX donor腺病毒,作为对照腺病毒。
实施例7
以携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒在制备治疗B型血友病的药物中的应用为例。
制备治疗B型血友病的药物以注射剂来使用,制备该药物1000支用原料及其配比如下:
携带靶向B型血友病致病基因Factor Ⅸ的锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒 5×1017vp
注射用水 加至500ml
制备方法按药剂学注射剂的常规方法进行。每支500μl,每mL含活性成分携带靶向B型血友病致病基因Factor Ⅸ的锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒1×1015vp。
使用是只需要通过静脉注射一次,按照每公斤体重注射1×1013vp的剂量使用。静脉注射药物后按照2mg/ml的剂量口服强力霉素。
为了验证本发明应用于B型血友病治疗的效果,发明人采用本发明实施例6中纯化好的携带靶向血友病致病基因Factor Ⅸ的锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒来进行B型血友病小鼠模型治疗实验,B型血友病小鼠模型购于美国杰克逊实验室(Jackson laboratory)。实验情况如下:
准备15只4-6周龄的人源化的Balb/c血友病小鼠模型,分成A、B、C3组,每组5只待用。将纯化好的腺病毒用PBS稀释至2.5×108vp/μl待用。将实施例6中纯化好的携带靶向血友病致病基因FactorⅨ的锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒Ad5(E3)Tet on FIX ZFN/(E1)FIX donor以5×1010vp/只的剂量通过尾静脉注射A组小鼠。注射完病毒后立即通过饮水给小鼠提供强力霉素药物(Dox2mg/ml),持续给药1周。在注射完病毒两周后,检测小鼠部分活化凝血酶原激酶时间。同时用Ad5(E1)FIX donor以相同剂量通过尾静脉注射B组小鼠为阴性对照。用200μl PBS通过尾静脉注射C组小鼠作为空白对照。B组、C组小鼠在尾静脉注射后用和A组同样的剂量和方法提供强力霉素。准备5只正常的4-6周龄的Balb/c小鼠作为阳性对照D组。用结果如图10,在图10中,WT代表阳性对照组、Ad5(E3)Tet on FIX ZFN/(E1)FIX donor代表实验组、Ad5(E1)FIX donor代表阴性对照组、Mock代表空白对照组,同对空白对照组和阴性对照组相比经携带靶向血友病致病基因FactorⅨ的锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒治疗的B型血友病小鼠模型的凝血能力得到恢复。统计学分析结果:图中相同相同字母代表无显著性差异,不同字母代表有显著性差异,P<0.05。
Claims (6)
1.一种携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒,其特征在于:缺失E1和E3区,在缺失区插入了锌指核酸酶表达元件和供体DNA;所述的锌指核酸酶表达元件是由Tet-on诱导性启动子、锌指核酸酶基因以及转录终止信号组成;Tet-on诱导性启动子由以下结构组成:7个重复的四环素反应元件,在该重复序列两端连接有启动子核心元件,包括左侧的miniCMV和右侧的tight miniCMV,在左侧miniCMV的下游连接有rtTA2S-M2转录因子和SV40pA,在右侧tight miniCMV的下游插入一对锌指核酸酶基因,在锌指核酸酶基因的3'端连接有转录终止信号;
miniCMV的序列如下:
GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC
tight miniCMV的序列如下:
GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。
2.根据权利要求1所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒,其特征在于:在缺失的E1区插入供体DNA、在缺失的E3区插入锌指核酸酶表达元件,或在缺失的E1区插入锌指核酸酶表达元件、在缺失的E3区插入供体DNA。
3.根据权利要求1或2所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒,其特征在于:所述的供体DNA是靶向该腺病毒所携带的锌指核酸酶的识别位点,它由上、下游同源臂组成,上、下游同源臂分别是由距离该腺病毒载体携带的锌指核酸酶的识别位点1bp到5000bp碱基数的DNA序列组成,每条同源臂的长度为50bp到3000bp。
4.根据权利要求1或2所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒,其特征在于:所述的供体DNA在上、下游同源臂之间插入了限制性内切酶位点、报告基因表达元件、筛选基因表达元件、功能基因表达元件中的任意一种。
5.一种权利要求1所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒的构建方法,其特征在于由以下步骤组成:
(1)构建腺病毒骨架载体
以商业化的pAdEasy-1载体为基础进行改造,构建腺病毒E3区穿梭载体,在E3区穿梭载体中插入lacZα筛选基因和Swa Ⅰ酶切位点,通过同源重组和蓝白斑筛选将SwaⅠ酶切位点引入到腺病毒缺失的E3区,获得可以在缺失的E3区插入外源基因的腺病毒骨架载体;
(2)构建携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体
将真核启动子、锌指核酸酶基因、转录终止信号依次插入到腺病毒E3区穿梭载体中;
(3)构建携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体
将供体DNA的上、下游同源臂依次插入到腺病毒E1区穿梭载体,在上、下游同源臂之间插入限制性内切酶位点、筛选基因表达元件、功能基因表达元件中的任意一种;
(4)将携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒E3区穿梭载体与Swa Ⅰ线性化的腺病毒骨架载体同源重组获得携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体,将携带供体DNA的腺病毒E1区穿梭载体与携带锌指核酸酶表达元件的腺病毒载体同源重组获得携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体;
(5)将构建好的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒载体通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞进行包装、扩增、纯化获得纯化的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒。
6.权利要求1所述的携带锌指核酸酶表达元件和供体DNA的腺病毒在制备治疗遗传性疾病药物中的用途。
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