CN104721811B - 多肽在制备防治脑胶质瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及多肽及其在制备防治脑胶质瘤药物中的应用，该多肽为具有抑制脑胶质瘤细胞增殖，延缓脑胶质瘤生长过程的作用。该多肽为138个氨基酸的肽段(SEQ ID NO:1)，位于人TROY蛋白序列细胞内域第234到371位氨基酸。具有阻断TROY受体与下游信号分子RKIP结合，减低TROY介导的NF‑kB激活，抑制脑胶质瘤细胞增殖的作用。

Description

多肽在制备防治脑胶质瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具有抑制脑胶质瘤细胞增殖，延缓脑胶质瘤生长过程的多肽的潜在医学应用及其制备。

背景技术

目前对脑瘤缺乏有效治疗手段：手术切除不仅难度高、副作用大，而且容易复发；血脑屏障的存在使大多数化疗药物难以到达脑病变部位而发挥有效作用；脑肿瘤大多对放疗不敏感。因此，探索新的脑瘤诊疗手段、有效改善患者生命质量成为神经科学领域基础研究工作者和临床医生亟需解决的医学难题之一。

脑胶质瘤约占所有脑瘤中发病的30％-80％左右。依据恶变细胞的来源类型不同，胶质瘤可分为：星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形胶质细胞混合瘤三种。按组织学形态又可分为：核异质型、有丝分裂型、微血管富集型以及坏死型4个等级。1级通常预后较好，可通过外科手术完全切除；2级病变加重，病灶开始向周围播散，界限不清；3-4级属恶性胶质瘤，侵袭及增殖活跃，易转移，预后差。脑胶质瘤中最常见的类型是恶性星形胶质细胞瘤，包括退行性多形性星形胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)，GBM发病占50％以上。GBM为4级恶性胶质瘤，多见于老年人，在所有类型的脑胶质瘤中侵袭性最强、恶性程度最高，平均存活期仅12个月。目前，制约脑胶质瘤诊疗发展的最大瓶颈是基础研究不足。作为机体最高级指挥中枢，中枢神经系统肿瘤具有自身特点，脑胶质瘤异常基因谱有别于其他系统肿瘤，需要加以专科研究。加强脑胶质瘤的基础研究，深入阐明其发生、发展机制，寻找具有关键作用的治疗靶点对改进脑胶质瘤的治疗现状具有重要的理论和实践意义。

TROY(又称为TAJ)是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，2000年由Eby等人发现并克隆，TROY蛋白有416个氨基酸，分子质量为45kDa，(NM_001204458)。TROY的胞外域含有肿瘤坏死因子受体超家族成员的特征性序列，但是，与其他肿瘤坏死因子超家族成员不同的是，TROY的胞内域不存在“死亡域”(death domain，DD)。这提示，作为肿瘤坏死因子受体超家族中的新成员，TROY可能还介导了其他的细胞生物学效应，并有着独特的信号传导通路。有关TROY在中枢神经系统中的功能主要集中在神经元突起生长抑制方面。2005年，He ZG、Mi S等研究组报道TROY可以与少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte myelinglycoprotein，OMgp)等髓鞘相关神经突生长抑制因子(myelin-associated inhibitorfactors，MAIFs)受体NgR结合，组成NgR/TROY受体复合物，介导神经突生长抑制作用。这些主要集中在对神经元中TROY的研究。然而，TROY在星形胶质细胞、小胶质细胞等中也都有表达，有关TROY在神经胶质细胞中作用的研究现在尚处于起步阶段。近年来，通过流行病学调查和遗传学分析等手段，多个实验室研究发现，TROY是鼻咽癌、肺癌等的易感基因。

RKIP(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族，广泛存在于各种生物中。RKIP在肿瘤组织中表达低，肿瘤转移病灶中的表达又低于原发病灶。RKIP在某些细胞系中被证实具有抑制细胞生长和肿瘤转移以及促进凋亡等重要功能。RKIP可以与Raf-1结合，从而抑制MAPK信号转导通路，并参与了对G蛋白偶联受体信号通路和NF-kB信号通路的调控。已有文献表明，RKIP与肿瘤关系密切且作用很重要。因此，探讨干扰TROY/RKIP间结合对脑胶质瘤的何影响对研究它们作为脑胶质瘤治疗靶点的可能性具有重要的理论和实践意义。

目前尚无有关通过多肽抑制TROY受体活性来缓解脑胶质瘤病变过程的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制TROY受体下游信号通路活性的多肽，该多肽可以用于制备延缓脑胶质瘤发生、发展过程的药物。

本发明的第一方面，是提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

CCQCRRDSVQTCGPVRLLPSMCCEEACSPNPATLGCGVHSAASLQARNAGPAGEMVPTFFGSLTQSICGEFSDAWPLMQNPMGGDNISFCDSYPELTGEDIHSLNPELESSTSLDSNSSQDLVGGAVPVQSHSENFTA(SEQ ID NO:1)

该多肽为138个氨基酸的肽段(SEQ ID NO:1)，位于人TROY蛋白序列细胞内域第234到371位氨基酸。具有阻断TROY受体与下游信号分子RKIP结合，减低TROY介导的NF-kB激活，抑制脑胶质瘤细胞增殖的作用。

申请人对TROY蛋白的416个氨基酸进行截取，分别对194-416、194-390、194-371、194-350、234-416、256-416、234-371作了与下游信号分子RKIP结合实验，结果发现234-371区域为可以与RKIP结合的最小区域，此区域可以有效阻断TROY与RKIP分子间的体内外结合。实验证实本发明的多肽为最短的可以有效阻断TROY/RKIP结合的功能域。

本发明的第二方面，是提供了上述的多肽在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用。

本发明的多肽可以按常规药剂学制备成注射剂。

本发明经裸鼠脑胶质瘤细胞种植实验检测，结果表明，如SEQ ID NO:1所示的多肽分子能延缓皮下种植的脑胶质瘤细胞的发育。

本发明的第三方面，是提供了上述的多肽在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用，所述的药物是指能够抑制、或下调上述多肽的表达量的试剂。

所述的能够抑制、或下调上述多肽的表达量的试剂是上述多肽的siRNA、shRNA或包含siRNA、shRNA的重组载体。

进一步地，本发明提供了所述的能够抑制、或下调上述多肽的表达量的shRNA，所述的shRNA序列如SEQ ID NO:7所示：

5’-TCAACGTCTTTGGATTCAActcgagTTGAATCCAAAGACGTTGA-3’(SEQ ID NO:7)

本发明还提供了一种含有上述shRNA的重组载体，所述的重组载体可采用慢病毒载体GV118。

体外实验中可采取脂质体介导法转染shRNA；体内实验中可采用直接注射复制缺陷慢病毒携带目的DNA至损伤部位等，本发明今后临床应用的给药方式可包括但不限于：直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法、蛋白微球制剂皮下注射法等(Hickman MA,Malone RW,Lehmann-Bruinsma K，etal.Gene expression following direct injection of DNA into liver.Hum GeneTher.1994；12:1477-1483；Patil SD,Rhodes DG,Burgess DJ.DNA-based therapeuticsand DNA delivery systems:A comprehensive review.AAPS J.2005；7(1):61-77；Boulikas T.Nuclear localization signal peptides for the import of plasmid DNAin gene therapy.Int J Oncol.1997；1:301-309)。

本发明提供的多肽、shRNA具有在制备防治脑胶质瘤病变过程中良好的应用前景。

附图说明

图1.TAT-TROY(231-371氨基酸)结构示意图，为了促进多肽分子进入胞浆，在TROY(234-371氨基酸)138多肽分子的N末端融合表达一段TAT穿膜肽(Schwarze SR,Ho A,Vocero-Akbani A,Dowdy SF.In vivo protein transduction:delivery of abiologically active protein into the mouse.Science.1999Sep3；285(5433):1569-72.)。

图2TAT-TROY(231-371氨基酸)干扰肽显著减弱TROY与RKIP间的结合，0.1μM的TAT-TROY干扰肽加入GST-TROYICD与His-RKIP蛋白孵育体系中，GST Pull-down检测TROY与RKIP间的结合。A图GST Pull-down结果显示TAT-TROY干扰肽显著减弱TROY与RKIP间的结合；B图为灰度扫描对A图结果进行半定量，进一步确证上述结果。

图3TAT-TROY(231-371氨基酸)干扰肽转导进入U87细胞，0.1μM的TAT-TROY干扰肽加入U87人脑胶质瘤细胞培养体系中，以PBS为对照组。TAT抗体对上述细胞免疫荧光染色显示，TAT-TROY干扰肽可以顺利转导进入U87细胞。

图4TAT-TROY(231-371氨基酸)干扰肽显著减低U87细胞中NF-kB活性，0.1μM的TAT-TROY干扰肽加入U87细胞培养体系中，以PBS为对照组。孵育12小时后裂解细胞，检测NF-kB活性，结果显示，TAT-TROY干扰肽可以显著减低U87细胞中NF-kB活性。

图5TAT-TROY(231-371氨基酸)干扰肽显著减弱U87细胞裸鼠皮下成瘤，将2×106个稳定表达绿色荧光蛋白的U87细胞皮下注射至裸鼠下肢背外侧皮下，每组5只老鼠。之后，隔天腹腔注射2mg/kg的TAT-TROY干扰肽，以TAT蛋白为对照。肿瘤细胞皮下种植35天后，体视荧光显微镜下拍照。A图结果显示，与对照组相比较，腹腔注射TAT-TROY干扰肽组裸鼠成瘤显著减弱。实验至少重复5次。B图，拍照完成后，处死老鼠，手术剥取病变部位团块，确证其为实体瘤组织。与对照组相比，**P<0.01。结果表明TAT-TROY干扰肽可以显著减弱U87细胞在裸鼠皮下成瘤。

图6TROY ShRNA干扰序列显著减弱U87细胞中TROY表达，A)Western blot检测稳定表达TROY ShRNA干扰序列的U87细胞中的TROY表达；B)右图为灰度扫描对A图结果进行半定量。

图7ShRNA基因敲减TROY表达显著减缓U87细胞裸鼠皮下成瘤，将2×106个稳定表达TROY ShRNA和绿色荧光蛋白的U87细胞皮下注射至裸鼠下肢皮下，每组5只老鼠。肿瘤细胞皮下种植35天后，体视荧光显微镜下拍照。A图结果显示，与对照组相比较，TROY-ShRNA干扰组裸鼠成瘤显著减弱。B图，拍照完成后，处死老鼠，手术剥取病变部位团块，确证其为实体瘤组织。统计分析瘤体积大小，与对照组相比，结果表明TROY-ShRNA干扰可以显著减弱U87细胞在裸鼠皮下成瘤。

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：多肽抑制TROY与下游信号分子RKIP结合并减低NF-kB活性的实验

一、实验材料

1.菌种

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)菌株，由本室提供。

2.质粒

pTAT载体由Dowdy SF教授实验室获得，pGEX-4T3-1载体由本室提供。

3.工具酶

限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶及其它工具酶等，购自上海华美生物工程公司、生工公司及Sigma公司等。

4.动物

10－20g裸鼠，购自上海斯莱克实验动物中心。

5.试剂盒

柱离心式胶回收提试剂盒，购自上海华顺生物试剂公司。

6.培养基

LB培养基、NZCYM培养基配制试剂购自DIFCO公司。

1)LB液体培养基：Bacto-胰蛋白胨10g，Bacto-酵母抽提物5g，NaCl 10g，加H₂O至1000ml，调整pH值为7.0，高压灭菌20min；

2)LB固体培养基：LB液体培养基加1.5％(w/v)的琼脂粉，高压灭菌20min后直接倒于LB平板中为非Amp平板，加入100mg/ml的Amp为含Amp的LB平板；

3)NZCYM培养基：NZ胺10g，NaCl 5g，Bacto-酵母抽提物5g，酪蛋氨基酸(Casamino)1g，MgSO₄2g，加H₂O至1000ml，调整pH值为7.0，高压灭菌20min。

7.其它试剂

溴化乙锭(EB)、丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺购自Fluka公司，琼脂粉及琼脂糖购自DIFCO公司，SDS购自Serva公司，氨苄青霉素购自上海第四制药厂，X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG、Hanks及Ficalls液购自Sigma公司。

8.主要实验仪器

9.常用溶液

TE溶液：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA；

RNAase：将RNAase粉剂用TE配制成20mg/ml，90℃加热10min，加等体积灭菌甘油，终浓度为10mg/ml，置-20℃保存；

苯酚：重蒸后加入0.1％8-羟基喹啉，先后用等体积1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.5MTris-HCl(pH 8.0)和0.1M Tris-HCl(pH 8.0)饱和平衡，直到pH大于7.8。二、主要实验方法

1.质粒小量抽提(碱裂解法)制备

1.1质粒抽提溶液的配制

溶液I：50mM Glucose，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，高压灭菌，4℃保存；

溶液II：0.2M NaOH，1％SDS，高压灭菌；

溶液III：3M NaAc(pH4.8)，高压灭菌；

STE溶液：10mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM NaCl，1mM EDTA。

1.2质粒小量抽提(碱裂解法)

从LB琼脂平板上挑取单个菌落，接种于3ml含Amp的LB培养基内，37℃振摇培养过夜；12000rpm离心2min收集菌体沉淀，用STE溶液洗涤一次，同上离心2min；沉淀用碱裂解法制备质粒之溶液I 100μl悬浮，混匀后剧烈振荡，室温放置5min；加新配制溶液II 200μl，轻轻摇匀，冰浴5min；再加预冷的溶液III 150μl，摇匀后冰浴5min，4℃12000rpm离心5min；取上清，用等体积酚抽提一次，氯仿：异戊醇(24:1)抽提一次；然后加入二倍体积的无水乙醇，室温放置2min后4℃12000rpm离心15min；沉淀用75％乙醇洗涤，离心去上清，室温干燥10min，加30μl TE重新溶解DNA，加少量RNAase以降解RNA。置于-20℃备用。

2.抽提总RNA

2.1抽提总RNA准备

用已消毒的0.1％DEPC水浸泡手术器械(包括匀浆棒及其配套试管等)2h以上，然后用无菌去离子水浅淋冲洗干净，尽量不残留DEPC，再对手术器械、第一次使用的tip头和Eppendorf管以及无菌去离子水消毒。

2.2组织中抽提总RNA全程

戴好手套，在匀浆管内加入1ml Trizol溶液/100mg组织，手术剪取组织，迅速置入匀浆管，匀浆至组织全部破碎，室温静置2－3min，每毫升匀浆组织液加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec充分混匀进行分层，室温静置5min，2－8℃12000rpm离心15min，取上清，每毫升Trizol Reagent加入0.5ml异丙醇沉淀RNA，颠倒混匀，室温静置10min，然后2－8℃12000rpm离心10min，弃上清，每毫升Trizol Reagent加入1ml75％乙醇洗涤RNA，2－8℃7500rpm离心5min，弃上清，空气中自然干燥5－10min，加入50μl不含RNA酶的无菌去离子水溶解RNA。整个过程须勤换手套，谨防RNA酶污染。

2.3细胞中抽提总RNA全程

戴好手套，室温3000rpm离心细胞5min，弃上清，在Eppendorf管内加入1ml Trizol溶液/2×10⁵细胞，悬浮细胞混匀，每毫升悬浮液加入200μl氯仿，余下步骤同组织中抽提总RNA过程。

3.逆转录制备cDNA

对抽提出来的总RNA进行逆转录反应：

在Eppendorf管中按以下次序加入试剂

5μl总RNA(1μg/1μl)，1μl oligo dT，0.5μl RNA酶抑制蛋白，

2.5μl 10×RT buffer，5.5μl经DEPC处理的无菌去离子水，

以上共14.5μl置于80℃水浴5min，再置于50℃水浴10min，

在Eppendorf管中按以下次序再加入以下试剂

5μl 25mM MgCl₂，2.5μl 10mM dNTP，0.5μl RNA酶抑制蛋白，

2.5μl AMV(25U逆转录酶)，

以上共25μl置于42℃至少水浴1h，反应结束后99℃5min使AMV失活并使DNA：RNA杂合分子变性而解离，加入等体积酚混匀，12000rpm离心5min，取上清，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)混匀，12000rpm离心5min，取上清，加入2.5μl 3M NaAC及62.5μl无水乙醇，于－20℃放置2h，12000rpm离心10min，75％乙醇洗涤、沉淀2次，冷冻抽干，沉淀溶于20μl无菌去离子水中。

4.PCR获取目的片段基因

4.1引物设计原则

按照引物设计的基本原则，设计相应引物，尽量在PCR反应的扩增特异性和扩增效率之间取得平衡。按Suggs等(1981年)的公式Tm＝2(A+T)+4(C+G)计算退火温度，引物长度控制在18至30之间，保持GC合理含量比例在40－60％之间，最后利用PCGENE计算机程序加以检验。

构建到pGEX-4T1载体上的小鼠TROY(196-416氨基酸)引物序列为：

5’AAAGAATTCAAGAGGCAGTTCATGGAGAAGAAAC 3’(SEQ ID NO:8)

5’TTACTCGAGTCAGGCATCCTGGAAGGCTGTG 3’(SEQ ID NO:9)

构建到pTAT-HA载体上的人TROY(234-416氨基酸)引物序列为：

5’CAACTCGAGATGTGCTGTCAGTATCACCGGGAC 3’(SEQ ID NO:10)

5’CTTGAATTCTCAGTCAGTAGATTCTGAAACATTC 3’(SEQ ID NO:11)

4.2准备PCR反应溶液

在0.5ml已消毒的Eppendorf管中按以下次序加入试剂：

10μl 10×PCR buffer，4μl 4×dNTP(2mM)，1μl引物一，1μl引物二，1μl DNA或cDNA模板(10ng)，1μl Taq酶(5U)，加82μl无菌去离子水至100μl总反应体积，混匀，加石蜡油50μl封住溶液液面。

4.3利用PCR仪进行PCR反应

设置程序为94℃1min30sec，55℃1min，72℃1min，共35个循环。

5.酶切反应

5.1酶切鉴定或筛选

取DNA 8μl，限制性内切酶高盐10×缓冲液2μl，限制性内切酶1μl(双酶切反应时各加入1μl)，加水至总反应体积20μl，37℃水浴1h，取2－3μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，检查酶切反应是否完全。

.25酶切后待胶回收连接

取DNA 40μl，限制性内切酶高盐10×缓冲液或10×Multi缓冲液10μl，限制性内切酶5μl(双酶切反应时各加入5μl)，加水至总反应体积100μl，37℃水浴1.5h，取10μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，检查酶切反应是否完全。

6.胶回收目的DNA

6.1琼脂糖凝胶电泳

根据DNA或RNA的大小确定所需琼脂糖凝胶的浓度，称取适量琼脂糖，加入1×TAE(0.04MTris-HAc，0.002MEDTA，pH8.0)电泳缓冲液，加热至琼脂糖完全溶解，待溶液冷却至50℃左右，加入溴化乙锭至终浓度0.5μg/ml，混匀后倒入胶板至凝胶凝固。将胶板放入电泳槽，覆以1×TAE电泳缓冲液，将DNA样品与6×上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖)混合，加样，80－100V电压下电泳。电泳结束后，取出凝胶，在紫外灯下观察。

6.2溶液中DNA定量

取DNA样品10μl，用TE稀释60倍后，在紫外分光光度计上测定260nm和280nm的O.D.值。OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA。OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8至1.9之间。

6.3回收目的DNA

在长波紫外灯下，酶切后的目的DNA电泳结束后，用干净手术刀片将其相应条带切割下来，把电泳胶分别放入1.5mlEppendorf管中，以下步骤按购自上海华顺生物公司的胶回收试剂盒操作手册进行：按每100mg琼脂糖加入300μl的比例加入S1液，置50℃水浴10分钟(每2分钟颠倒混匀一次，务必确保琼脂糖块完全溶化)，加入1/3S1液体积的异丙醇，混匀，置50℃水浴1分钟，将溶化后的Agarose液移入吸附柱，高速离心1分钟，取出吸附柱，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，在吸附柱中加入500μlW1液，高速离心30秒钟，取出吸附柱，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，高速离心1分钟，将吸附柱移至一个干净的1.5mlEppendorf管中，在吸附柱中加入30μlT1液，静置1分钟，高速离心1分钟，将DNA贮存于－20℃。经此回收的DNA可直接用于连接反应。

7.连接反应

将经胶回收所得的目的基因片断和相应载体(pGEX-4T-1载体)(含量比为10:1)混匀，加入2μl 5×T4DNA ligase buffer和1U T4DNA ligase至总反应体积为10μl，14-16℃保温水浴过夜，所得反应液可用于进行转化。

8.大肠杆菌转化

8.1感受态细胞制备

大肠杆菌37℃培养过夜，将1ml过夜菌接种到50mlLB培养基中，37℃振摇培养2～3h至O.D.值为0.3，4℃3000rpm离心5min收集菌体，加入10ml用冰预冷的0.1M CaCl₂悬浮菌体，冰浴20min，4℃3000rpm离心5min后加入0.1M CaCl₂，冰浴30min后即可用于转化。

8.2转化

取100μl感受态细胞和10μl连接反应液或1μl质粒置于1.5mlEppendorf管中，轻轻混匀，冰浴20min后，42℃热冲击2min，加入LB培养液至1ml，37℃缓慢振摇45min，然后取100μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，对照组直接涂布感受态细胞，置37℃孵育14－16h，挑取单菌落，过夜培养后抽提质粒，进行酶切筛选鉴定。

8.3筛选

转化产物涂布于含X-gal的LB氨苄平板上，挑取白色单个菌落进行质粒抽提、酶切鉴定，最后进行脱氧核糖核苷酸序列测序，得到pGEX-4T-1-TROY质粒。

9.大肠杆菌培养表达

平板上挑菌37℃培养过夜，按1％菌量即1ml加至100mlLB或NZCYM培养基中振摇至O.D.值为0.4-0.8，加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导(对照不加)，继续振摇3h，处理样品准备蛋白电泳。

10.SDS－PAGE蛋白电泳

10.1溶液配制

30％Acr/Bis：29.2％Acr，0.8％Bis，过滤后于4℃保存；

4×分离胶buffer：36.3g Tris，10％SDS4ml，加H₂O约180ml，用浓HCl调整pH至8.8，定容至200ml；

4×浓缩胶buffer：6.55g Tris，10％SDS4ml，加H₂O约80ml，用浓HCl调整pH至6.8，定容至100ml；

电泳buffer：3.03g Tris，14.41g Gly，1g SDS，定容至1000ml；

Loading buffer：1M Tris-HCl(pH6.8)1.2ml，10％SDS4ml，巯基乙醇1ml，甘油2ml，溴酚蓝0.2mg，加H₂O至20ml；

低分子量标准marker：购自华美生物工程公司；

SDS－PAGE浓缩胶(上层胶)：2.4ml水，1.0ml4×浓缩胶缓冲液，0.6ml30％丙烯酰胺－Bis母液，50μl10％过硫酸铵溶液，10μlTEMED；

SDS－PAGE分离胶(12％下层胶)：4.2ml水，3.0ml4×分离胶缓冲液，4.8ml丙烯酰胺－Bis母液，100μl10％过硫酸铵溶液，10μlTEMED；

染色液：50％乙醇，10％乙酸，0.4％考马斯亮兰G－250；

脱色液：20％乙醇，10％乙酸。

10.2聚丙烯酰胺凝胶板的制备

加入2ml分离胶溶液，在胶面上加分离胶缓冲液饱和的正丁醇覆盖，待胶凝固后倒去表面覆盖液，用水洗一次，擦干后加入浓缩胶，插上梳子，室温下凝固。

10.3样品处理

全菌蛋白：取1ml菌液12000rpm离心30sec收集菌体，加入100μl去离子水和100μl2×loading buffer，煮沸5min裂解菌体蛋白，取混合液进行SDS－PAGE电泳。

包涵体蛋白：取100ml菌液12000rpm离心30sec收集菌体，弃上清，加入50ml50mM的Tris-HCl(pH7.4)复悬，12000rpm离心30sec，弃上清，加入2.5ml去离子水复悬，同时立即加入2.5ml2×SDS(配制为：100mM pH值为7.4的Tris-HCl，4％SDS，20％甘油，200mM DTT现用现加)，振荡20sec，煮沸5min，超声波切割，12000rpm离心10min，弃沉淀，取上清进行SDS－PAGE电泳。

10.4聚丙烯酰胺凝胶电泳

灌注电泳胶，将样品及蛋白Marker加入上样孔，80－100V/cm电压下电泳至溴酚蓝到分离胶低端，停止电泳，取出凝胶，切去浓缩胶，先进行考马斯亮兰染色1h，然后经脱色至本底透清后观察蛋白条带。

TAT-TROY(234-371aa)蛋白序列为SEQ ID NO:2+SEQ ID NO:1

其中TROY(234-371氨基酸)138肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

CCQCRRDSVQTCGPVRLLPSMCCEEACSPNPATLGCGVHSAASLQARNAGPAGEMVPTFFGSLTQSICGEFSDAWPLMQNPMGGDNISFCDSYPELTGEDIHSLNPELESSTSLDSNSSQDLVGGAVPVQSHSENFTA(SEQ ID NO:1)

TAT穿膜肽氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：

YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)

为了促进多肽分子进入胞浆，在TROY(234-371氨基酸)138多肽分子的N末端融合表达一段TAT穿膜肽，已有报道(Schwarze SR,Ho A,Vocero-Akbani A,Dowdy SF.In vivoprotein transduction:delivery of a biologically active protein into themouse.Science.1999Sep3；285(5433):1569-72.)表明，TAT可以引导肽段段穿透细胞膜进入细胞内部。

11.构建pGEX-4T1-TROY^IC表达质粒，用BL21原核表达GST-TROY^IC融合蛋白，采用GST亲和存活纯化GST-TROY^IC融合蛋白：

11.1GST以及GST融合蛋白的诱导表达与鉴定

将重组质粒pGEX-4T-1-TROY和pGEX-4T-1空载体等转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化有表达质粒的BL21(DE3)菌株370C250rpm培养至O.D6oo值为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.5mol/L(留1m1不加IPTG的菌液作为对照)，30℃150rpm继续培养3-3.5h。离心收集菌体，悬浮于预冷PBS中，冰浴超声破碎菌体后，进行SDS-PAGE电泳，观察诱导表达产物。

11.2GST以及GST融合蛋白的纯化

大规模培养转化有pGEX-4T-1空质粒和pGEX-4T-1-TROY质粒的BL21菌:将测序鉴定阳性的转化菌37℃过夜培养，按l:50稀释过夜培养菌，37℃剧烈振荡培养至OD值为0.8左右，加入IPTG至终浓度为0.5mM，在16℃振荡培养16小时诱导表达。将500ml诱导表达菌液移入离心管，4℃5000rpm离心10min，收集细菌，用30ml冰冷PBS彻底重悬菌液，超声破碎。超声破碎菌液变得清亮后，在4℃15000g离心15min，将细菌碎片及包涵体沉入管底:将上清转移至一干净的离心管中,与2mlAmersham Pharmacia的GlutathioneSepharose 4B的beads在4℃振荡孵育3小时。用冰冷的PBS10ml冲洗beads3次。GSH洗脱后透析即得纯化的蛋白。

12.表达、纯化His-RKIP融合蛋白，构建PET-28a-RKIP表达质粒，用BL21原核表达His-RKIP融合蛋白，采用Ni柱亲和纯化His-RKIP融合蛋白：

12.1pET-28a-RKIP质粒的表达

从LB的抗生素筛选琼脂糖平板上挑取转化有测序鉴定过的pET-28a-RKIP质粒的BL21单克隆菌株，37℃培养过夜，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，离心收集菌体，加入100μl蒸馏水与等体积的上样缓冲液(loading buffer)，振匀，煮沸5min使蛋白变性，然后进行SDS－PAGE蛋白电泳，电泳染色后确认可以表达His-RKIP。

12.2His-RKIP纯化

按l:50转接上述过夜培养菌，37℃剧烈振荡培养至OD值为0.8左右，加入IPTG至终浓度为1mM，在16℃振荡培养16小时诱导表达。将500ml诱导表达菌液移入离心管，4℃5000rpm离心10min，收集细菌，用30ml冰冷PBS彻底重悬菌液，超声破碎。超声破碎菌液变得清亮后，在4℃15000g离心15min，将细菌碎片及包涵体沉入管底:将上清转移至一干净的离心管中,与2ml Amersham Pharmacia的Ni beads在4℃振荡孵育3小时。用预冷的PBS10ml冲洗beads 3次。GSH洗脱后透析即得纯化的蛋白。

13.构建PET-TAT-TROY干扰肽段(TROY(234-371氨基酸)138肽)表达质粒，用BL21原核表达TAT-TROY干扰肽段融合蛋白，亲和纯化获得足够数量的TAT-TROY干扰肽段，pET-TAT-TROY的表达、纯化方法同上述12中His-RKIP类同。

14.以GST为对照，进行GST-TROY^IC与His-RKIP间蛋白分子的GSTpull-down沉淀实验，检测TAT-TROY干扰肽段对TROY/RKIP间结合的影响。

将结合有GST或GST-TROY-ICD(194-416)蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠分别与His-RKIP及TAT-TROY干扰肽段或TAT空对照在4℃NP-40裂解液中孵育3小时，4℃500rpm离心使谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠沉淀下来,用预冷的NP-40裂解液清洗谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠共3次,每次5个珠体积。将洗后的谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠加入SDS-PAGE上样缓冲液,煮沸后取样品进行12％SDS-PAGE电泳,Western blot。

15.按1×10⁶密度将U87细胞种入6孔板，细胞生长至50-60％对数生长期密度时，加入上述TAT-TROY干扰肽段进行转导12小时后，将上述细胞进行裂解，检测NF-kB活性。对照组：给予PBS孵育；TROY干扰肽组：给予10μM TAT-TROY干扰肽段孵育。方法见参考文献(Kojima T,Morikawa Y,Copeland NG,Gilbert DJ,Jenkins NA,Senba E,et al.TROY,anewly identified member of the tumor necrosis factor receptor superfamily,exhibits a homology with Edar and is expressed in embryonic skin and hairfollicles.J Biol Chem 2000；275:20742-7.[PubMed:10764796])。

三、实验结果

0.1μM的TAT-TROY干扰肽加入GST-TROY^ICD与His-RKIP蛋白孵育体系中，GST Pull-down检测TROY与RKIP间的结合。左图GST Pull-down结果显示TAT-TROY干扰肽显著减弱TROY与RKIP间的结合；右图为灰度扫描对左图结果进行半定量，进一步确证上述结果。(见图2)

0.1μM的TAT-TROY干扰肽加入U87人脑胶质瘤细胞培养体系中，以PBS为对照组。TAT抗体对上述细胞免疫荧光染色显示，TAT-TROY干扰肽可以顺利转导进入U87细胞。(见图3)

0.1μM的TAT-TROY干扰肽加入U87细胞培养体系中，以PBS为对照组。孵育12小时后裂解细胞，检测NF-kB活性，结果显示，TAT-TROY干扰肽可以显著减低U87细胞中NF-kB活性。(见图4)

实施例2：多肽用于治疗脑胶质瘤的动物实验

裸鼠成瘤实验种植实验是研究肿瘤病变过程的常用动物模型。我们首先培养U87脑胶质瘤细胞株，细胞消化、离心后以无血清DMEM悬浮细胞，制成1×10⁷/ml左右密度的U87细胞悬液。

将上述实验方法13中纯化获得的TAT-TROY干扰肽段注射入小鼠腹腔，按时程观测瘤块生长状况并测量长、宽数据进行统计学分析。通过上述研究，进一步明确TROY/RKIP相互作用在脑胶质瘤中的作用。

一、实验材料

裸鼠，雄性，体重10～20g，5只/笼群养。购于上海西普尔—毕凯实验动物有限公司(生产许可证号：SCXK(沪)2008-0016)。饲养于清洁级动物房。本室表达、纯化的TAT-TROY干扰肽段。

二、实验方法

将2×10⁶个U87悬浮细胞皮下注射至裸鼠下肢背外侧或腹股沟下，每组5-10只老鼠。之后，每5天观察、拍照注射部位。如有显著肿瘤团块生长时定时测量肿瘤长、宽，按照肿瘤体积＝长×宽²/2计算，并做统计学分析。将实验小鼠进行分组，对照组给予腹腔内注射TAT肽20mg/kg；TROY干扰肽组给予腹腔内注射TAT-138肽20mg/kg，隔天注射，多肽用生理盐水溶解。肿瘤细胞皮下种植35天后，体视荧光显微镜下拍照。拍照时以1％水合氯醛200μl/只麻醉裸鼠，在体视荧光显微镜下拍照。最后一次拍照完成后，处死老鼠，手术剥取病变部位团块，确证其为实体瘤组织。

三、实验结果

如图5显示，与对照组相比较，腹腔注射TAT-TROY干扰肽组裸鼠成瘤显著减弱(见图5)。

实施例3：shRNA的实验

一、实验方法

1)接种1×10⁵个U87细胞至6孔培养板中，每孔加培养基体积为5ml，病毒感染时细胞的融合度为50％。

2)感染前为细胞换液，吸去细胞上清，按不同的分组情况加入所需的培养基。

3)将对照及针对TROY的慢病毒液加到培养孔中，针对人源TROY(NM_018647)序列设计的shRNA序列分别为:

1#,5-ATCAACTCAGGATGCACTA-3(SEQ ID NO:3),

2#,5-TCAACGTCTTTGGATTCAA-3(SEQ ID NO:4),

3#5-AGGCTATTTGTCATGTAAA-3(SEQ ID NO:5),

对照为5-TTCTCCGAACGTGTCAC-GT-3(SEQ ID NO:6)。

4)把细胞放回培养箱孵育8-12小时以后观察细胞状态。继续培养，24小时后更换为新鲜培养基。

5)感染72-96小时后，观察荧光表达情况。感染一周后裂解细胞，Western blot检测TROY表达水平，获得基因敲减效果明显的ShRNA序列。

6)上述感染了ShRNA慢病毒的U87细胞中加入Puromycin进行筛选，分选有荧光表达的单细胞克隆并扩种生长。鉴定为稳定株后-80℃冻存。

7)将2×10⁶个U87悬浮细胞皮下注射至裸鼠下肢背外侧或腹股沟下，每组5-10只老鼠。之后，每5天观察、拍照注射部位。如有显著肿瘤团块生长时定时测量肿瘤长、宽，按照肿瘤体积＝长×宽²/2计算，并做统计学分析。

二、实验结果

1)经Western Blot检测发现，和对照相比较，上述1#、2#、3#RNAi干扰序列中2#序列基因敲减效果最显著，因此最终确定以2#序列为基础，构建可以稳定表达其shRNA发夹结构的载体，按照SEQ ID NO:4设计的ShRNA序列如下所示：

5’-TCAACGTCTTTGGATTCAActcgagTTGAATCCAAAGACGTTGA-3’(SEQ ID NO:7)

此ShRNA序列采用慢病毒载体GV118，本发明提供了一种能够有效下调人TROY蛋白表达量的含有上述shRNA的重组载体(图6)。

2)以上述有效ShRNA慢病毒序列筛选构建的U87细胞稳定株进行成瘤实验检测表明，TROY蛋白敲减可显著减缓脑胶质瘤发病过程(图7)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (3)

1.多肽在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的多肽在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述多肽为按常规药剂学制备成注射剂。

3.如SEQ ID NO:7所示的shRNA序列在制备预防或治疗脑胶质瘤药物中的应用。