CN110075276A - Adm竞争性拮抗剂ama在抗胶质瘤血管生成治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑制胶质瘤血管生成的复合物及应用，以及一种抑制胶质瘤血管生成的方法。所述复合物为AMA‑CRLR复合物，通过ADM竞争性拮抗剂AMA与CRLR结合所得。该复合物能够在抑制胶质瘤微血管内皮细胞小管形成、抑制胶质瘤微血管内皮细胞迁移、抑制肿瘤相关巨噬细胞促恶性胶质瘤肿瘤血管生成以及抑制内皮细胞eNOS信号通路活化中发挥重要作用，具有重要的临床应用价值和潜在商业价值。

Description

ADM竞争性拮抗剂AMA在抗胶质瘤血管生成治疗中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种抑制胶质瘤血管生长的复合物和应用以及一种抑制胶质瘤血管生成的方法。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)对胶质瘤的分类标准，按照其恶性程度可分为I-IV级，其中胶质母细胞瘤(WHO IV级)恶性程度极高。胶质母细胞瘤最突出的病理学特征是富含新生血管，这些新生血管不仅为肿瘤快速增殖、演进提供了营养支撑，也是肿瘤复发的重要结构基础。在胶质瘤血管周微环境中，微血管内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)是其最重要的组成部分。然而，肿瘤相关巨噬细胞促进内皮细胞增殖，进而形成新生血管的机制及治疗学意义尚不明确，需要更深入的研究。因此，明确肿瘤相关巨噬细胞与内皮细胞在胶质母细胞瘤中的相互作用及机制将为靶向肿瘤血管周微环境的胶质母细胞瘤的临床治疗策略提供新思路和靶点。

肾上腺髓质素(Adrenomedullin，ADM)是52个氨基酸组成的多肽，属于降钙素基因肽超家族。既往研究表明，ADM是一种血管舒张剂，通过与其受体CRLR(calcitoninreceptor-like receptor)结合激活eNOS，增强内皮通透性；同时调控血管和支气管平滑肌松弛、胃酸分泌和炎症因子释放等多种生理行为。ADM-CRLR促肿瘤生长效应已在黑色素瘤、胰腺导管癌等研究中证实。然而，ADM-CRLR作为分子靶点在胶质瘤血管生成中的效应尚有待研究。

拮抗剂AMA(ADM22-52)是ADM蛋白第22号氨基酸至52号氨基酸的多肽片段，位于ADM的C端。AMA与ADM受体CRLR具有较强亲和力，它通过竞争性结合CRLR进而阻断ADM对eNOS信号通路的激活，发挥抑制血管内皮细胞迁移、小管形成的效应。基于拮抗剂AMA阻断ADM-CRLR通路可为研发靶向恶性胶质瘤的新治疗方案提供实验依据。

由于目前尚未有靶向胶质瘤ADM-CRLR通路的治疗方案和药品报道，因此，本发明将为研发抑制胶质瘤血管生成的治疗提供新策略，具有重要的临床应用价值和潜在商业价值。

发明内容

鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种抑制胶质瘤血管生成的复合物。

抗胶质瘤血管生成的复合物，其特征在于，所述复合物为AMA-CRLR复合物，所述AMA-CRLR复合物通过所述AMA与所述CRLR结合所得。血管生成在胶质瘤细胞癌中具有标志性，目前相关的抗血管生成治疗主要是靶向VEGF、VEGFR、VEGF/VEGFR等靶点，本发明提出的利用拮抗剂AMA竞争性的结合ADM受体CRLR，形成AMA-CRLR复合物，从而阻断ADM-CRLR细胞通路，具有突破性的临床价值与特点，同时为后续研发胶质瘤ADM-CRLR信号通路相关诊断试剂等奠定基础。

本发明目的之二在于提供一系列上述复合物的应用。

权利要求1所述的复合物在制备抑制胶质瘤微血管内皮细胞小管形成药物中的应用。

权利要求1所述的复合物在制备抑制胶质瘤微血管内皮细胞迁移药物中的应用。

权利要求1所述的复合物在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞促胶质瘤血管生成药物中的应用。

权利要求1所述的复合物在制备抑制内皮细胞eNOS信号通路活化药物中的应用。

一种抑制胶质瘤血管生成的药物，所述药物包括权利要求1所述复合物和药学上可接受的载体或助剂。

进一步，所述药物通过AMA竞争性的结合ADM受体CRLR，从而阻断ADM对胶质瘤微血管内皮细胞的作用，达到抑制胶质瘤血管生成的作用。目前治疗胶质瘤的方法只有手术切除和替莫唑胺(TMZ)辅助化疗联合放疗，是标准方式，然而其治疗过程痛苦，复发率高，治疗效果不乐观是该方式现存的问题。而分子靶向治疗作为一种癌症治疗的新方案，在其他类型癌症，如非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤和慢性粒细胞性白血病的治疗成功，对胶质瘤的靶向治疗具有重要的指导意义。本发明提供的AMA-CRLR复合物目前尚未有任何报道，可以为研发靶向胶质瘤的新治疗方案，包括药物及诊断试剂提供重要的临床依据和和试验数据。

本发明的目的之三在于提供一种抑制胶质瘤血管生成的方法，具体方案如下。

抑制胶质瘤血管生成的方法，所述方法通过AMA与CRLR结合形成所述AMA-CRLR复合物，抑制TAM分泌的ADM对胶质瘤微血管内皮细胞迁移和内皮细胞小管形成的促进作用。拮抗剂是与受体有较强的亲和力而无内在活性的药物，通过竞争性结合受体阻断激动剂与受体的结合，从而对抗或取消激动剂的作用，因此使用拮抗剂一般能达到特异、高效、安全的效果。

进一步，所述方法通过AMA与CRLR结合形成所述AMA-CRLR复合物，抑制肿瘤相关巨噬细胞促胶质瘤血管生成。

进一步，所述方法通过AMA与CRLR结合形成所述AMA-CRLR复合物，抑制TAM-ADM激活eNOS信号通路。

目前国际上治疗胶质母细胞瘤(GBM)效果较好的是美国FDA在2009年批准的靶向血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体药贝伐单抗。然而贝伐单抗作为抗体类大分子药物，难以通过血脑屏障，药物渗透性低。药效上看，贝伐单抗虽能部分抑制胶质瘤血管生成，延长疾病无进展生存期(PFS)，但在患者总生存期(OS)上并未获益，且贝伐单抗治疗患者的胶质瘤侵袭性增加，促进了肿瘤复发。

综上，胶质瘤是癌症治疗中最具挑战性的疾病之一，其原因就在于患者生存期短、复发率高、治疗困难，患者预后极差，平均生存期仅为15个月，因此医学界迫切的需要可以更有效治疗胶质瘤的新方案。本发明提供的复合物及治疗思路目前尚未有任何报道，具体突出的创造性。

本发明的有益效果在于：

1)AMA-CRLR复合物能够在抑制胶质瘤微血管内皮细胞小管形成、抑制胶质瘤微血管内皮细胞迁移、抑制肿瘤相关巨噬细胞促恶性胶质瘤肿瘤血管生成以及抑制内皮细胞eNOS信号通路磷酸化中发挥重要作用，具有重要的临床应用价值和潜在商业价值。

2)TAM分泌的ADM(TAM-ADM)刺激显著促进内皮细胞迁移和小管形成能力；采用拮抗剂AMA阻断ADM与受体CRLR的结合显著抑制TAM-ADM促内皮细胞迁移和小管形成能力。

3)采用拮抗剂AMA阻断ADM与受体CRLR的结合，显著抑制胶质瘤血管生成，表明采用拮抗剂AMA阻断ADM-CRLR通路是胶质瘤血管生成的有效方式。

4)TAM-ADM刺激诱导HUVEC细胞中eNOS信号通路激活；采用拮抗剂AMA阻断ADM与受体CRLR的结合显著抑制TAM-ADM激活eNOS信号通路。

附图说明

图1细胞迁移实验结果图(细胞迁移实验(A)和定量统计(B)；标尺＝50μm。**,P<0.01)。

图2细胞小管形成实验结果图(细胞小管形成实验(A)和定量统计(B)；标尺＝50μm。**,P<0.01)。

图3免疫组化试验结果图(免疫组化实验(A)和定量统计(B)；标尺＝50μm。**,P<0.01)。

图4 Western blot实验条带图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

细胞迁移实验检测TAM分泌的ADM刺激和/或阻断ADM与CRLR结合对内皮细胞迁移能力的影响。

1.细胞培养

人胶质母细胞瘤及U937单核细胞从美国菌种保藏中心(ATCC)购买。人脐静脉内皮细胞及内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium，ECM，包括血清、双抗、因子)购自(Sciencell公司)。U937用RPMI-1640培养基(Gibco公司)加10％胎牛血清(Gibco公司)培养。所有细胞均置于5％CO₂孵箱(温度为37℃、相对湿度为95％)中培养。

2.肿瘤相关巨噬细胞上清收集

人源U937单核细胞加入M-CSF(PeproTech公司，20ng/mL)诱导3天，加入M-CSF、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β(PeproTech公司，20ng/mL)诱导3天。弃除上清培养基，PBS(中杉金桥公司)洗涤TAM细胞两遍，加入5mL无血清内皮细胞培养基培养48小时后，离心2000rpm/5分钟，收集上清，储存于-80℃备用。

3.细胞迁移试验

1)实验分组：对照组、TAM上清处理组、AMA处理组、TAM上清与AMA联合处理组。

2)将状态良好的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)消化离心，细胞计数并调整细胞浓度至2.5×10⁵个/mL，按实验分组在24孔板中transwell上室加入细胞悬液200μL，在24孔板中transwell下室分别加入1％FBS ECM、TAM上清、1μM AMA，TAM上清+1μM AMA。将24孔板置于CO₂培养箱，18小时后进行多聚甲醛固定、结晶紫染色，正置显微镜在200倍放大倍数下采图。实验结果见图1。

实验结果：TAM分泌ADM促进内皮细胞迁移。拮抗剂AMA阻断TAM分泌的ADM与CRLR结合，进而抑制内皮细胞迁移能力。由图1可知：TAM上清处理HUVEC后，HUVEC的迁移数目较对照组迁移数目显著增多，而TAM上清中加入ADM拮抗剂AMA显著抑制HUVEC的细胞迁移数目(图1A)。定量分析显示对照组细胞迁移数为110.16±8.39个/HPF,TAM上清处理组细胞迁移数为185.68±11.93个/HPF,AMA单独处理组细胞迁移数目为112.48±12.41个/HPF,TAM上清和AMA处理组细胞迁移数为111.90±8.60个/HPF(图1B)。

表1细胞迁移实验结果列表

实施例2

细胞小管形成实验检测TAM分泌的ADM刺激和/或阻断ADM与CRLR结合对内皮细胞小管形成能力的影响。

1.细胞培养和TAM上清处理同实施例1。

2.细胞小管形成实验。

1)实验分组：对照组、TAM上清处理组、AMA处理组、TAM上清与AMA联合处理组。

2)将状态良好的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)消化离心，细胞计数并调整细胞浓度至3.1×10⁵个/mL，按实验分组在48孔板已凝固Matrigel胶上加入细胞悬液100μL。对照组培养基分别为1％FBS ECM、TAM上清、1μM AMA、TAM上清+1μM AMA。将48孔板置于CO₂培养箱，4小时后,倒置显微镜在100倍放大倍数下采图。实验结果见图2。

实验结果：TAM分泌ADM促进内皮细胞小管形成能力。拮抗剂AMA阻断TAM分泌的ADM与CRLR结合，进而抑制内皮细胞小管形成能力。

由图2可知：TAM上清处理HUVEC后，HUVEC小管形成数目显著多于对照组小管形成数目；TAM上清中加入ADM拮抗剂AMA显著抑制HUVEC小管形成数目(图2A)。定量结果表明对照组细胞形成小管数为8.83±2.23个/HPF；TAM上清处理组细胞形成小管数为21.00±5.20个/HPF；AMA单独处理组细胞形成小管数为9.25±3.36个/HPF；TAM上清和AMA处理组细胞迁移数为8.15±2.08个/HPF(图2B)。

表2细胞小管形成实验结果列表

实施例3

采用胶质瘤颅内移植瘤动物模型，采用拮抗剂AMA阻断肿瘤相关巨噬细胞中ADM与受体CRLR的结合，免疫组化实验检测其对胶质瘤血管生成的影响。

1.细胞培养和TAM诱导处理同实施例1。

2.构建原位移植瘤荷瘤鼠模型：

1)将状态良好的胶质瘤细胞进行消化离心，细胞计数并调整细胞浓度至4×10⁵个/1mL。

2)将状态良好的TAM进行收集离心，PBS洗涤两遍，加入1mL新鲜干细胞培养基轻轻重悬细胞，细胞计数并调整细胞浓度至4×10⁷个/1mL。

3)取4-6周龄雌性NOD/SCID小鼠(购自上海南方模式生物科技股份有限公司，采用标准无菌条件饲养于第三军医大学第一附属医院动物中心)用水合氯醛麻醉剂麻醉，用10μL蛋白微量注射器(宁波镇海三爱仪器厂)将5μL细胞悬液(TAM细胞的细胞量为2×10⁵个/只、胶质瘤细胞注射量为2×10³个/只)注射入小鼠颅内，进针位点在小鼠颅骨前正中线与双眼外眦连线交接点后右侧旁开0.5cm处，进针深度为0.5cm。

4)对荷瘤鼠实验组进行ADM拮抗剂AMA给药，对照组进行同样剂量的PBS给药。

3.免疫组化检测移植瘤中CD31表达情况

CD31为血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesionmolecule-1，PECAM-1/CD31)，是血管内皮的标志物。使用CD31标记血管，可根据CD31的阳性信号反映血管的大小、密度、形态等。本实验采用免疫组化检测肿瘤组织中CD31表达反映肿瘤组织中血管生成情况。用显微镜观察、采集图像；ImageJ软件对视野中CD31阳性信号进行微血管密度分析及定量统计。具体如下。

1)脱蜡：将移植瘤石蜡切片在65℃烤箱中烘烤30分钟，迅速移入二甲苯缸中，脱蜡20分钟；重复1次；

2)水化：100％-75％梯度乙醇过缸，依次为：无水乙醇，5分钟×2次；90％乙醇，5分钟；80％乙醇，5分钟；75％乙醇，5分钟；去离子水，5分钟×2次；

3)阻断内源性过氧化物酶：采用3％H₂O₂阻断液，常温封闭40分钟；PBS漂洗3次，每次5分钟；

4)抗原修复：取9mL柠檬酸缓冲溶液+41mL柠檬酸三钠缓冲溶液，双蒸水定容至500ml。将500mL柠檬酸混合缓冲液倒入高压锅内，进行1300W修复2min30s；修复结束后，将组织切片置于修复液中，室温自然冷却。

5)PBS洗涤3次，每次5分钟；孵育CD31抗体(Abcam公司,货号ab28364，稀释比例1:100)，4℃孵育过夜；

6)次日，将切片盒取出于37℃敷箱中放置30分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟；

7)用DAB通用型二抗(DAKO公司)37℃孵育1小时；PBS洗涤3次，每次5分钟；

8)显色：按比例配制好DAB显色液(DAKO公司)，40μL/片，镜下显色，用自来水漂洗终止显色；

9)苏木素复染、盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗反蓝20分钟；

10)脱水封片：将切片分别置于75％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇、无水乙醇各5分钟；二甲苯，10分钟。脱水结束后风干切片，用树脂溶液小心地进行封片。实验结果见图3。

实验结果：TAM分泌ADM促进原位移植瘤荷瘤鼠肿瘤血管生成。拮抗剂AMA阻断TAM分泌的ADM与CRLR结合对原位移植瘤荷瘤鼠肿瘤血管生成能力的影响。

由图3可知：对荷瘤鼠进行ADM拮抗剂AMA给药处理后，实验组荷瘤鼠肿瘤组织中血管标志物CD31标记的微血管密度显著低于对照组(图3A)。定量结果显示，将对照组微血管密度标准化为1，AMA实验组中微血管密度显著低于对照组，为对照组的0.46倍(图3B)。

实施例4

Western blot检测ADM刺激和/或阻断ADM与CRLR结合对内皮细胞中eNOS信号通路活化的影响。

1.细胞培养和TAM上清处理同实施例1。

2.Western blot检测移植瘤中CD31的表达情况。

1)实验分组：对照组、TAM上清处理组、AMA单处理组、TAM上清与AMA联合处理组。

2)收集状态良好的HUVEC，消化离心后，用无菌PBS洗3遍，计数，以每组1×10⁵细胞接种于培养皿中培养1-2天后，再用不含FBS的内皮细胞培养基饥饿过夜。

3)除对照组以外，其余三组分别进行相应处理，活化60分钟后收取细胞进行Western blot检测。

4)细胞用RIPA裂解液(Thermo Fisher公司)在冰上裂解30分钟，每隔10分钟涡旋10秒。

5)细胞裂解液于高速离心机中离心，15000rpm/分钟，离心15分钟。小心吸取上清，使用BCA法进行蛋白浓度检测，再用4×loading buffer(Bio-Rad公司)稀释蛋白裂解液，于95℃变性10分钟。

6)将四组蛋白样品胶中上样，蛋白总量为20μg，进行SDS-PAGE电泳，电泳参数为120V。电泳结束后将胶转移到PVDF膜上，以200mA湿转1.5小时。

7)转膜结束后，将PVDF膜置于5％脱脂牛奶中封闭1小时，然后孵育一抗，4℃孵育过夜。一抗分别是：p-eNOS(BD公司，货号612392，稀释比例1:1000)、eNOS(BD公司，货号610298，稀释比例1:1000)、GAPDH(碧云天公司，货号AG019-1，稀释比例1：1000)。

8)次日将条带置于PBS中洗涤半小时，室温下孵育二抗1小时。洗涤半小时后使用化学发光成像仪(Bio-Rad公司)进行显影。实验结果见图4。

实验结果：肿瘤相关巨噬细胞分泌ADM诱导内皮细胞中eNOS的磷酸化激活。拮抗剂AMA阻断TAM分泌的ADM与CRLR结合进而抑制内皮细胞中eNOS信号通路磷酸化的激活作用。

由图4可知：TAM上清处理HUVEC细胞后上调HUVEC细胞中eNOS磷酸化水平；于TAM上清中加入ADM拮抗剂AMA后下调HUVEC细胞中eNOS磷酸化水平。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.抗胶质瘤血管生成的复合物，其特征在于，所述复合物为AMA-CRLR复合物，所述AMA-CRLR复合物通过所述AMA与所述CRLR结合所得。

2.权利要求1所述的复合物在制备抑制胶质瘤微血管内皮细胞小管形成药物中的应用。

3.权利要求1所述的复合物在制备抑制胶质瘤微血管内皮细胞迁移药物中的应用。

4.权利要求1所述的复合物在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞促胶质瘤血管生成药物中的应用。

5.权利要求1所述的复合物在制备抑制内皮细胞eNOS信号通路活化药物中的应用。

6.抑制胶质瘤血管生成的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述复合物和药学上可接受的载体或助剂。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物通过AMA竞争性的结合ADM受体CRLR，从而阻断ADM对胶质瘤微血管内皮细胞的作用，达到抑制胶质瘤血管生成的作用。

8.抑制胶质瘤血管生成的方法，其特征在于，所述方法通过AMA与CRLR结合形成所述AMA-CRLR复合物，抑制TAM-ADM促胶质瘤微血管内皮细胞迁移和内皮细胞小管形成。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法通过AMA与CRLR结合形成所述AMA-CRLR复合物，抑制肿瘤相关巨噬细胞促胶质瘤血管生成。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法通过AMA与CRLR结合形成所述AMA-CRLR复合物，抑制TAM-ADM激活eNOS信号通路。