CN109072276A - 抗癌剂的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗癌剂的评价方法，其具有下述工序：将含有癌细胞和构成间质的细胞的细胞结构体在1种或2种以上的抗癌剂存在下进行培养的培养工序；和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标来评价所述抗癌剂的抗癌效果的评价工序。

Description

抗癌剂的评价方法
技术领域
本发明涉及在不使用动物模型的情况下在体外体系中对抗癌剂的抗癌效果进行可靠性更高的评价的方法，另外，本发明还涉及在不使用动物模型的情况下通过体外体系高精度地评价当将脉管生成抑制剂与抗癌剂并用时是否得到了比单独使用抗癌剂更高的抗癌效果的方法。
本申请基于2016年4月19日在日本申请的日本特愿2016-083948、2016年4月19日在日本申请的日本特愿2016-083950号、以及2016年4月19日在日本申请的日本特愿2016-083951号来主张优先权，将其内容援引至本申请。
背景技术
为了选择抗癌剂的开发或癌症治疗中合适的抗癌剂，通过体外的分析系统来评价抗癌剂对癌细胞的作用。另外，日本国内制药企业中的药剂核准率极低，为0.1％，为了提高其成功率，需要早期判断候选药剂是否具有所期望的药效，因此要求可靠性高的药效评价方法。特别是，以往的动物模型的极限也被作为制药企业难以推出新药的一个理由，制药企业需要可代替动物模型的更能再现生物体内环境的药剂评价模型。
但是，在以往的体外体系中进行的抗癌剂的评价方法中，在给药至生物体内时，有时会发生下述不利情况：能够发挥优异的抗癌作用的药剂只能得到低评价等，所得到的评价并不总与实际的临床效果相关。因此，通过以往的体外评价方法，无法选择癌症治疗中合适的抗癌剂，无法实现癌症治疗成绩的提高。
作为抗癌剂的药效评价，在临床上也进行基于基因检查的药剂有效性预测。例如，大肠癌中的KRAS基因突变是西妥昔单抗的治疗效果预测因子。另外，肺癌中的EGFR基因突变是吉非替尼的治疗效果预测因子。但是，许多分子靶向药剂仅对应一般性的基因突变。此外，还存在大量尚未鉴定的体细胞突变。因此，在基于基因检查的药剂有效性预测中，有时无法进行充分的药效评价。此外，在抗癌剂的研究开发中，在利用以往的评价方法从多个药剂中确定药剂的有效性时，得到的有效性评价也大多与实际的临床中的成绩不一致，在研究开发中成为很大的障碍。
因而，作为通过体外体系进行的抗癌剂的评价方法，例如，专利文献1中公开了，在胶原蛋白凝胶的滴块状中使癌细胞与免疫细胞共存并培养、进行药剂的抗癌评价的方法。在该方法中，利用了专利文献2中记载的主动地除去癌细胞周边的间质，作为仅癌细胞的细胞块使癌细胞增殖的方法。
但是，最近通过分析大肠癌患者的数据，明确了在预后不良的患者中高表达的基因大多在间质细胞中表达的可能性。另外，使用从移植了人的癌细胞的小鼠得到的数据，验证该可能性，还发现在预后不良的患者中高表达的基因并不是来自人的癌组织而是来自其周围的小鼠的组织。特别是报告了，在恶性程度高的癌中大量出现异常活化的特殊的成纤维细胞，被称为“癌症相关成纤维细胞(Cancer Associated Fibroblast：CAF)”。也已经报告了，这些CAF促进血管生成、癌细胞的增殖、浸润等(非专利文献2)。因此，认为在癌症微环境(生物体内的癌细胞及其周边环境)中，间质对癌细胞的影响非常大，通过使癌细胞与间质共存，能够构建更接近生物体内的环境。
近年来，作为癌症治疗药，除了目前为止使用的具有一般性的细胞毒性的抗癌剂以外，能够对癌细胞及其周边组织(固体肿瘤)发挥特异性治疗效果的分子靶向药受到关注。其中，2004年在美国被核准的Avastin(注册商标)(Genentech公司制、别名贝伐单抗(贝伐单抗))等血管生成抑制剂与以往直接发挥杀细胞效果的抗癌剂不同，其是通过阻碍固体肿瘤周边的血管生产能力而切断向癌症本身供给营养、通过降低癌增殖速度来间接地发挥抗肿瘤效果的药剂。
血管生成抑制剂是通过阻碍血管形成所必需的因子或其受体等血管形成所必需的蛋白信号通路来抑制、阻碍血管生成的药剂。作为治疗方法，血管生成抑制剂不仅可以单独使用，还常常与具有细胞毒性的现有的抗癌剂并用。血管生成抑制剂与抗癌剂的并用治疗与利用具有一般性的细胞毒性的抗癌剂单独使用的治疗相比，可获得更有效的结果。在日本国内，对于不能切除治愈的进行性和复发性结肠-直肠癌患者，血管生成抑制剂与各种药剂的并用治疗方法已得到认可。
在抗癌治疗中，期待获得比单独给药时更高的治疗效果，一般进行将作用机制不同的药剂彼此并用给药的治疗方法。在进行并用给药的情况下，优选对实际并用给药时与单独使用的情况相比能够得到怎样高的治疗效果进行评价。但是，作为评价血管生成抑制剂的并用治疗的药效的方法，在现阶段中，通常是小鼠等动物模型或人等体内的评价方法，还没有在体外进行评价的例子的报告(例如参照专利文献3、非专利文献3以及非专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2008-11797号公报
专利文献2：日本专利第3594978号公报
专利文献3：日本特表2014-501918号公报
非专利文献
非专利文献1：Isella,et al.,Nature Genetics,2015,vol.47,pp.312-319
非专利文献2：Shimoda,et al.,Seminars in细胞&Developmental Biology,2010,vol.21(1),pp.19-25
非专利文献3：Hung,Molecular Cancer Therapeutics,2007,vol.6(8),pp.2149-2157
非专利文献4：Hurwitz,The New England Journal of Medicine,2004,vol.350,pp.2335-2342
非专利文献5：Nishiguchi et al.,Macromol Bioscience,2015,vol.15(3),pp.312-317
非专利文献6：Tol,et al.,The New England Journal of Medicine,2009,vol.360(6),pp.563-572
非专利文献7：Ciardiello,et al.,Clinical Cancer Research,2000,vol.6,pp.3739-3747
发明内容
发明所要解决的课题
在体外的评价体系中进行药剂的药效评价的情况下，得到的评价的可靠性成为问题。即，重要的是该评价体系中的评价反映实际对生物体给药该药剂时得到的药效，该评价体系中的评价与对生物体给药而得到的效果一致的概率高的评价体系是可靠性高的评价体系。
专利文献1中记载的方法的特征在于，能够在实际接近给药至生物体内的药剂浓度的状况下进行评价。但是，从培养方法考虑，无法观察间质与癌细胞的相互作用。另外，由于不存在间质，因此很难说再现了实际的癌症微环境，有时得到的评价的可靠性低。
本发明是在体外体系中进行的抗癌剂的评价方法，其目的在于提供一种在不使用动物模型的情况下就能够进行可靠性更高的评价的评价方法。
另外，在药剂开发阶段或临床现场，在评价血管生成抑制剂的并用治疗的药效的情况下，优选不通过体内的评价方法而能够更简便地实施的体外的评价方法。
本发明的目的在于提供一种使用体外体系高精度地评价血管生成抑制剂与抗癌剂的并用治疗的药效的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题，对各种细胞培养方法进行了反复研究，结果发现了，当在抗癌作用的评价试验场中预先再现生物体内环境时，能够再现该评价对象在生物体内实际发挥作用的状态，能够获得反映了实际对生物体给药该药剂时得到的药效的评价。具体而言发现了，通过将药剂给药至通过使癌细胞与在生物体内环境中与癌细胞共存的间质、例如内皮细胞或成纤维细胞等共存、形成组织而得到的结构体，能够得到可靠性更高的评价，从而完成了本发明。
另外，本发明者们还发现，在抗癌作用的评价试验场，通过在接近生物体内环境的条件下使抗癌剂作用于癌细胞，具体而言，通过将药剂以用半透膜将癌细胞与在生物体内环境中与癌细胞共存的间质、例如内皮细胞或成纤维细胞等共存、形成组织而得到的结构体分离的状态给药，也能够得到可靠性更高的评价，从而完成了本发明。
本发明的第一方式的抗癌剂的评价方法具有下述工序：将含有癌细胞和构成间质的细胞的细胞结构体在1种或2种以上的抗癌剂存在下进行培养的培养工序；和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标来评价所述抗癌剂的抗癌效果的评价工序。
在上述第一方式中，所述癌细胞可以分散在所述细胞结构体内部。
在上述第一方式中，所述细胞结构体可以包含仅含有癌细胞的细胞层。
在上述第一方式中，所述细胞结构体可以被半透膜分隔为含有癌细胞的层和含有构成间质的细胞的层。
在上述第一方式中，所述半透膜的孔径可以为0.4μm～8μm。
在上述第一方式中，所述细胞结构体可以含有选自由血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞组成的组中的一种以上作为构成所述间质的细胞。
在上述第一方式中，所述细胞结构体可以进一步含有选自由成纤维细胞、神经细胞、树突细胞、巨噬细胞和肥大细胞组成的组中的一种以上作为构成所述间质的细胞。
在上述第一方式中，上述细胞结构体可以含有选自由血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞组成的组中的1种以上和成纤维细胞作为构成所述间质的细胞，上述细胞结构体中的血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞的总细胞数可以为成纤维细胞的细胞数的0.1％以上。
在上述第一方式中，所述细胞结构体的厚度可以为5μm以上。
在上述第一方式中，所述细胞结构体可以具备脉管网结构。
在上述第一方式中，在所述培养工序中，也可以将所述细胞结构体在具有细胞毒性的抗癌剂和脉管生成抑制剂存在下进行培养，并评价将所述脉管生成抑制剂和所述抗癌剂并用时的抗癌效果。
在上述第一方式中，所述癌细胞可以是从癌症患者采集的癌细胞。
在上述第一方式中，所述培养工序中的培养时间可以为24～96小时。
本发明的第二方式的抗癌剂评价用试剂盒是用于进行上述第一方式的抗癌剂的评价方法的试剂盒，其具备至少包含构成间质的细胞的细胞结构体和收纳上述细胞结构体的细胞培养容器。
在上述第二方式中，所述细胞结构体可以在顶面具备半透膜。
在上述第二方式中，所述细胞结构体可以具备脉管网结构。
在上述第二方式中，所述细胞结构体的厚度可以为5μm以上。
发明效果
本发明的上述第一方式的抗癌剂的评价方法中，将对更接近生物体内状态的包含间质的细胞结构体所含的癌细胞、或被半透膜从包含所述间质的细胞结构体分离的状态下的癌细胞的影响作为指标，评价抗癌剂的药效。因此，尽管是体外的评价体系，也能够得到可靠性高的评价。
另外，通过使用本发明的上述第二方式的抗癌剂评价用试剂盒，能够更简便地实施上述评价方法。
具体实施方式
对本发明的第一实施方式的抗癌剂的评价方法进行说明。
本发明的第一实施方式的抗癌剂的评价方法(以下有时称为“本实施方式的评价方法”)具有下述工序：将含有癌细胞和构成间质的细胞(间质细胞)的细胞结构体在1种或2种以上抗癌剂存在下进行培养的培养工序；和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标来评价所述抗癌剂的抗癌效果的评价工序。本实施方式的评价方法使用在由构成间质的细胞形成的三维结构内包含癌细胞的细胞结构体来评价抗癌效果。间质在生物体内的癌症微环境中是重要的构成。即，通过使具有构成间质的细胞所形成的三维结构的细胞结构体内含有癌细胞，能够再现生物体内的癌细胞的环境，能够恰当地评价生物体内的抗癌作用。因此，通过使用该细胞结构体，即使通过体外的评价体系，也能够进行更能反映人的临床结果的抗癌剂的评价，得到可靠性高的评价。
<细胞结构体>
本发明和本申请说明书中，“细胞结构体”是指层叠有多个细胞层的三维结构体。本实施方式中使用的细胞结构体(以下有时称为“本实施方式的细胞结构体”)由癌细胞和间质细胞构建。作为本实施方式的细胞结构体，可以是癌细胞分散在整个结构体的细胞结构体，也可以是癌细胞仅存在于特定层的细胞结构体。
本实施方式的评价方法中，也可以使用间质细胞层和癌细胞层按照能够与构建三维结构的间质细胞分泌的成分接触的方式被半透膜分隔而成的细胞结构体来评价抗癌效果。即，本实施方式的细胞结构体也可以是含有癌细胞的层和含有间质细胞的层被半透膜分隔的细胞结构体。在该细胞结构体中，含有癌细胞的层可以是单层，也可以是多层。同样地，含有间质细胞的层可以是单层，也可以是多层。另外，含有间质细胞的细胞层可以是仅由1种或2种以上的间质细胞形成的层，也可以含有除间质细胞以外的细胞。同样地，含有癌细胞的细胞层可以是仅由癌细胞形成的层，也可以含有除癌细胞以外的细胞。
通过使用使间质细胞形成为生物体内的间质组织那样的三维结构、从该间质细胞分泌的成分能够经由半透膜与癌细胞接触的细胞结构体，能够再现与处于生物体内的间质组织的影响下的癌细胞相同的环境，能够恰当地评价生物体内的抗癌作用。因此，通过使用该细胞结构体，即使通过体外的评价体系，也能够进行更能反映人的临床结果的抗癌剂的评价，得到可靠性高的评价。
在从癌症患者采集癌细胞的情况下，与癌细胞一起还采集到大量的成纤维细胞，但难以将该癌细胞和成纤维细胞分离。例如，作为从由癌症患者采集的癌组织中除去成纤维细胞的方法，有如下方法：通过将癌组织的细胞全部在无血清培养基中培养来杀灭成纤维细胞，然后用半透膜将成纤维细胞块和癌细胞分离。但是，由于一旦透过半透膜，会从癌细胞失去细胞-细胞接触，有可能无法进行正常的药剂评价。
因此，在大多情况下，含有从癌症患者采集的癌细胞的细胞群无论细胞种类如何都同样地被标记后，用于细胞结构体的构建。但是，由于也难以将癌细胞与成纤维细胞区别地标记，因此在从癌症患者采集的细胞群中大量含有成纤维细胞时，有可能会错误地进行药效评价。特别是，本实施方式中使用的细胞结构体由于含有大量的间质细胞，因此需要准确地评价对作为药剂靶标的癌细胞的药剂效果。本实施方式的评价方法中，通过用半透膜预先将构成含有间质细胞的层的间质细胞和来自癌患者的间质细胞分离，即使在大量的间质细胞与癌细胞一起包含于细胞结构体中的情况下，也能够抑制来自癌症患者的间质细胞的影响，得到可靠性更高的评价。
作为间质细胞，可以举出例如内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞、平滑肌细胞等。本实施方式的细胞结构体中所含的间质细胞，可以是1种，也可以是2种以上。作为本实施方式的细胞结构体中所含的间质细胞的细胞种类，没有特别限定，可以考虑所含有的癌细胞的来源和种类、评价中使用的抗癌剂的种类、目标抗癌活性所起效的生物体内环境等来适当选择。
血管网结构和淋巴管网结构对于癌细胞的增殖和活性是重要的。因此，本实施方式的细胞结构体优选具备脉管网结构。即，作为本实施方式的细胞结构体，优选在未形成脉管的细胞的层叠体的内部三维构建淋巴管和血管等中的至少一个的脉管网结构，构建更接近生物体内的组织。脉管网结构可以仅形成在细胞结构体的内部，也可以形成为至少其一部分露出至细胞结构体的表面或底面。另外，本发明和本申请说明书中，“脉管网结构”是指生物体组织中的血管网或淋巴管那样的网状结构。
脉管网结构可以通过含有构成脉管的内皮细胞作为间质细胞而形成。作为本实施方式的细胞结构体中所含的内皮细胞，可以是血管内皮细胞，也可以是淋巴管内皮细胞。另外，也可以含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者。
本实施方式的细胞结构体具备脉管网结构时，作为该细胞结构体中的除内皮细胞以外的细胞，只要是不阻碍内皮细胞形成脉管网的细胞则没有特别限定。但是，由于内皮细胞容易形成保持本来的功能和形状的脉管网，因此优选是在生物体内构成脉管的周边组织的细胞。此外，由于与生物体内的癌微环境更为近似，因此更优选为至少含有成纤维细胞作为除内皮细胞以外的细胞的细胞结构体，进一步优选包含血管内皮细胞和成纤维细胞的细胞结构体、包含淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞结构体、或包含血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞结构体。另外，作为细胞结构体中所含的除内皮细胞以外的细胞，可以是来自与内皮细胞同种的生物种的细胞，也可以是来自异种的生物种的细胞。另外，细胞结构体中所含的除内皮细胞以外的细胞可以为1种，也可以为2种以上。
本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞的数量只要是足以形成脉管网结构的数量则没有特别限定，可以考虑细胞结构体的大小、内皮细胞和除内皮细胞以外的细胞的细胞种类等适当确定。例如，通过将内皮细胞相对于构成本实施方式的细胞结构体的全部细胞的存在比(细胞数比)设定为0.1％以上，可以制备形成有脉管网结构的细胞结构体。在使用成纤维细胞作为除内皮细胞以外的细胞的情况下，本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞数优选为成纤维细胞数的0.1％以上，更优选为0.1～10.0％，进一步优选为0.1～5.0％。在作为内皮细胞含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者的情况下，血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞的总细胞数优选为成纤维细胞数的0.1％以上，更优选为0.1～10.0％，进一步优选为0.1～5.0％。
作为本实施方式的细胞结构体中所含的癌细胞，可以是建系的培养细胞，也可以是从癌症患者采集的癌细胞。从癌症患者采集的癌细胞可以预先培养使其增殖。具体而言，可以举出从癌症患者采集的原代癌细胞、人工培养癌细胞、iPS癌干细胞、癌干细胞、癌症治疗的研究和用于抗癌剂开发的预先准备的癌细胞系等。另外，也可以是来自人的癌细胞，也可以是来自除人以外的动物的癌细胞。另外，在本实施方式的细胞结构体含有从癌症患者采集的癌细胞的情况下，与癌细胞一起也可以包含从癌症患者采集的除癌细胞以外的细胞。作为除癌细胞以外的细胞，可以举出例如手术摘除的固体组织内所含的1种或2种以上的细胞。
癌细胞是指从体细胞派生而获得无限增殖能力的细胞。作为癌细胞来源的癌症，可以举出例如乳腺癌(例如浸润式导管癌、非浸润性导管癌、炎症性乳腺癌等)、前列腺癌(例如激素依赖性前列腺癌、激素非依赖性前列腺癌等)、胰腺癌(例如胰管癌等)、胃癌(例如乳头状腺癌、粘液腺癌、腺鳞癌等)、肺癌(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤等)、结肠癌(例如消化道间质肿瘤等)、直肠癌(例如消化道间质肿瘤等)、大肠癌(例如家族性大肠癌、遗传性非息肉性大肠癌、消化道间质肿瘤等)、小肠癌(例如非何杰金氏淋巴瘤、消化道间质肿瘤等)、食道癌、十二指肠癌、舌癌、咽癌(例如上咽癌、中咽癌、下咽癌等)、头颈部癌、唾液腺癌、脑肿瘤(例如松果体星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤等)、神经鞘瘤、肝脏癌(liver cancer)(例如原发性肝癌、肝外胆管癌等)、肾癌(例如肾细胞癌、肾盂和输尿管的转移上皮癌等)、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、肝癌(hepatoma)、子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌(例如上皮性卵巢癌、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢性生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性度肿瘤等)、膀胱癌、尿道癌、皮肤癌(例如眼内(眼)黑色素瘤、Merkel细胞癌等)、血管瘤、恶性淋巴瘤(例如网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、何杰金氏病等)、黑色素瘤(恶性黑色素瘤)、甲状腺癌(例如甲状腺髓样癌等)、甲状旁腺癌、鼻窦癌、副鼻窦癌、骨肿瘤(例如骨肉瘤、尤文氏瘤、子宫肉瘤、软组织肉瘤等)、转移性髓母细胞瘤、血管纤维瘤、隆起性皮肤纤维肉瘤、视网膜肉瘤、阴茎癌、睾丸肿瘤、儿童实体癌(例如肾母细胞瘤、儿童肾肿瘤等)、kaposi肉瘤、AIDS引起kaposi肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性骨髓增殖性疾病、白血病(例如急性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病等)等，并不限定于这些。
构成本实施方式的细胞结构体的间质细胞、癌细胞等的细胞种类没有特别限定，可以是从动物采集的细胞，也可以是对从动物采集的细胞进行培养而得到的细胞，也可以是对从动物采集的细胞实施各种处理而得到的细胞，也可以是培养细胞株。为从动物采集的细胞的情况下，采集部位没有特别限定，可以是来自骨、肌肉、内脏、神经、脑、皮肤、血液等的体细胞，也可以是生殖细胞，也可以是胚胎性干细胞(ES细胞)。另外，构成本实施方式的细胞结构体的细胞所来源的生物种没有特别限定，例如可以使用来自人、猴子、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等动物的细胞。作为对从动物采集的细胞进行培养而得到的细胞，可以是原代培养细胞，也可以是传代培养细胞。另外，作为实施各种处理而得到的细胞，可以举出诱导多能性干细胞(iPS细胞)、分化诱导后的细胞。另外，本实施方式的细胞结构体可以仅由来自同种生物种的细胞构成，也可以由来自多种生物种的细胞构成。
本实施方式的细胞结构体中的癌细胞的数量没有特别限定，在癌细胞和间质细胞共存的细胞结构体的情况下，由于更近似于生物体内的癌微环境，因此细胞结构体中的内皮细胞数相对于癌细胞数的比率([内皮细胞数]/[癌细胞数])优选大于0且为1.5以下。另外，在使用含有内皮细胞、成纤维细胞和癌细胞的细胞结构体的情况下，细胞结构体中的成纤维细胞数相对于癌细胞数的比率([成纤维细胞数]/[癌细胞数])优选为0.6～100，更优选为50～100。
本实施方式的细胞结构体的大小和形状没有特别限定。从能够形成更接近于形成在生物体内组织内的脉管的状态的脉管网结构、且能够精度更高地进行评价的角度出发，该细胞结构体的厚度优选为5μm以上，更优选为10μm以上，进一步优选为50μm以上，更进一步优选为100μm以上。作为该细胞结构体的厚度，优选为500μm以下，更优选为400μm以下，进一步优选为300μm以下。作为本实施方式的细胞结构体的细胞层的数量，优选2～60层左右，更优选5～60层左右，进一步优选为10～60层左右。
本实施方式的细胞结构体中，在间质细胞层和癌细胞层被半透膜分隔的细胞结构体的情况下，该细胞结构体中含有间质细胞的层的厚度优选为5μm以上，更优选为10μm以上，进一步优选为50μm以上，更进一步优选为100μm以上。另外，作为该细胞结构体中含有间质细胞的层的厚度，优选为500μm以下，更优选为400μm以下，进一步优选为300μm以下。此时，作为细胞结构体的细胞层的数量，优选为2～60层左右，更优选为5～60层左右，进一步优选为10～60层左右。
需要说明的是，本发明和本申请说明书中，构成细胞结构体的细胞层数通过将构成三维结构的细胞的总数除以每1层的细胞数(构成1层所需的细胞数)来测定。每1层的细胞数可以通过在使细胞结构体构成时所使用的细胞培养容器中，预先平面地培养细胞使其达到满铺来研究。具体而言，在某个细胞培养容器中形成的细胞结构体的细胞层数可以通过测量构成该细胞结构体的总细胞数，然后除以该细胞培养容器的每1层的细胞数来计算。
分隔含有间质细胞的层和含有癌细胞的层的半透膜只要是水分、蛋白、核酸、脂质、糖质等分子量较小的成分能够自由透过但细胞不能自由移动的膜即可。如果是这样的膜，则可以形成从间质细胞分泌的成分能够自由地透过、但含有间质细胞的细胞层和含有癌细胞的细胞层以虽然部分接触但分离的状态维持的细胞结构体。在这种情况下，作为细胞结构体中所含的半透膜，例如可以使用孔径为0.4μm～8μm的半透膜。
作为细胞结构体中所含的半透膜的原材料，只要不阻碍癌细胞或间质细胞的增殖、活性，则没有特别限定。作为该半透膜，可列举出例如由再生纤维素(cellophane)、乙酰纤维素、聚丙烯腈、聚四氟乙烯、聚酯系聚合物合金、聚砜等形成的多孔质膜。
通常，本实施方式的细胞结构体构建在细胞培养容器中。作为该细胞培养容器，只要是能够构建细胞结构体并且能够培养所构建的细胞结构体的容器则没有特别限定。作为该细胞培养容器，具体而言，可以举出培养皿、插入式细胞培养器(例如Transwell(注册商标)inserts、Netwell(注册商标)inserts、Falcon(注册商标)插入式细胞培养器、Milli细胞(注册商标)插入式细胞培养器等)、试管、烧瓶、培养瓶和培养平板等。本实施方式的细胞结构体的构建中，由于能够更适当地进行使用了该细胞结构体的评价，因此优选培养皿或各种插入式细胞培养器。
本实施方式的细胞结构体只要是由含有癌细胞和间质细胞的多层细胞层形成的结构体即可，其构建方法没有特别限定。例如，可以是一层一层地构建并依次层叠进行构建的方法，也可以是一次构建2层以上的细胞层的方法，也可以是适当组合两种构建方法来构建多层的细胞层的方法。另外，本实施方式的细胞结构体可以是构成各细胞层的细胞种类在每层不同的多层结构体，也可以是构成各细胞层的细胞种类在结构体的全部层中相同的细胞结构体。例如，可以是通过每一种细胞地形成层、使该细胞层依次层叠来进行构建的方法，也可以是预先制备混合了多种细胞的细胞混合液、由该细胞混合液一次构建多层结构的细胞结构体的方法。
作为一层一层地构建并依次层叠进行构建的方法，可以举出例如日本专利第4919464号公报中记载的方法，即通过交替地重复形成细胞层的工序和使所形成的细胞层与含有ECM(细胞外基质)的成分的溶液接触的工序，由此连续地层叠细胞层的方法。例如，在进行该方法时，通过预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物，利用该细胞混合物形成各细胞层，由此能够构建在结构体整体上形成有脉管网结构且癌细胞分散在整个结构体的细胞结构体。另外，通过每一种细胞地形成各细胞层，能够构建仅在由内皮细胞形成的层中形成有脉管网结构且癌细胞仅存在于特定的层的细胞结构体。
另外，例如在进行上述方法时，也可以预先分别制备将构成含有间质细胞的层的全部细胞混合而成的细胞混合物、和将构成含有癌细胞的层的全部细胞混合而成的细胞混合物，首先，通过将含有间质细胞的层的细胞混合物依次层叠，构成由单层或多层构成的细胞层，然后在该细胞层上放置半透膜，在该半透膜上层叠包含癌细胞的细胞混合物，构成细胞层。由此，能够构建在包含间质细胞的整个细胞层上形成有脉管网结构且癌细胞分散在包含癌细胞的整个细胞层中的细胞结构体。另外，通过每一种细胞地形成含有间质细胞的细胞层，能够构建仅在由内皮细胞构成的层形成脉管网结构且癌细胞仅存在于由半透膜与间质细胞隔开的层的细胞结构体。
作为一次构建2层以上的细胞层的方法，可以举出例如日本专利第5850419号公报中记载的方法。即可以举出如下方法：预先将细胞的整个表面用含有与整合素结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的高分子、和与含有所述RGD序列的高分子发生相互作用的高分子被覆，在将被该粘接膜被覆的被覆细胞收纳到细胞培养容器中后，通过离心处理等使被覆细胞彼此聚集，由此构建具有多层细胞层的细胞结构体。
例如，在进行该方法时，可以使用通过预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物、在该细胞混合物中添加粘接性成分而制备的被覆细胞。由此，通过一次离心处理，能够构建在结构体整体形成有脉管网结构的细胞结构体。同样地，预先制备将构成细胞结构体的全部细胞混合而成的细胞混合物，通过使用通过向该细胞混合物中添加粘接性成分而制备的被覆细胞，可以构建通过1次离心处理在整个结构体上形成有脉管网结构的细胞结构体。另外，例如分别单独地制备被覆了内皮细胞的被覆细胞、被覆了成纤维细胞的被覆细胞和被覆了从癌症患者采集的细胞群的被覆细胞，形成由成纤维细胞的被覆细胞构成的多层，然后在其上层叠由内皮细胞的被覆细胞形成的一层，再在其上层叠由成纤维细胞的被覆细胞形成的多层，再在其上层叠由含有癌细胞的细胞的被覆细胞形成的一层。由此，能够构建具备被具有厚度的成纤维细胞层夹持的脉管网结构、且顶面具备含有从癌症患者采集的癌细胞的层的细胞结构体。
本实施方式的细胞结构体也可以通过具有下述(a)～(c)工序的方法构建。
(a)在阳离子性缓冲液中将细胞和细胞外基质成分混合而得到混合物的工序，
(b)将通过所述工序(a)得到的混合物接种到细胞培养容器中的工序，和
(c)在所述工序(b)之后，从所述细胞培养容器中的细胞混合物中除去液体成分，得到在该细胞培养容器中多层层叠细胞而成的细胞结构体的工序。
本发明中，在工序(a)中，通过将细胞与含有阳离子性物质的缓冲液和细胞外基质成分混合，由该细胞混合物形成细胞集合体，从而可以得到内部大的空隙少的立体细胞组织。另外，得到的立体细胞组织比较稳定，因此能够进行至少数天的培养，并且在培养基更换时组织也不易崩解。
另外，本发明中，在工序(b)中，可以包含使接种于细胞培养容器内的细胞混合物在该细胞培养容器内沉降的工序。细胞混合物的沉降可以通过离心分离等主动地使细胞沉降，也可以使其自然沉降。
在工序(a)中，优选将细胞进一步与强电解质高分子混合。通过将细胞与阳离子性物质、强质解质高分子以及细胞外基质成分混合，即使在工序(b)中不需要离心分离等主动地使细胞集合的处理而使其自然沉降的情况下，也能够得到空隙少、具有厚度的立体性细胞组织。
作为上述阳离子性缓冲液，可以举出例如Tris-盐酸缓冲液、Tris-马来酸缓冲液、双-Tris-缓冲液或HEPES等。该阳离子性缓冲液中的阳离子性物质(例如Tris-盐酸缓冲液中的Tris)的浓度和pH只要不对细胞的生长和细胞结构体的构建带来不良影响，则没有特别限定。例如，阳离子性缓冲液中的阳离子性物质的浓度可以设为10～100mM，优选为40～70mM，更优选为50mM。另外，该阳离子性缓冲液的pH可以设为6.0～8.0，优选为6.8～7.8，更优选为7.2～7.6。
作为上述强电解质高分子，可以举出例如肝素、硫酸软骨素(例如4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素)、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸等糖胺聚糖；硫酸葡聚糖、硫酸鼠李聚糖、褐藻糖胶、卡拉胶、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、及聚丙烯酸、或它们的衍生物等。工序(a)中制备的混合物中，可以仅混合1种强电解质高分子，也可以组合使用2种以上。本实施方式的细胞结构体的构建中，高分子电解质优选为糖胺聚糖。另外，更优选使用肝素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素和硫酸皮肤素中的至少一种。本实施方式中使用的强电解质高分子进一步优选为肝素。与上述阳离子性缓冲液混合的强电解质高分子的量只要不对细胞的生长及细胞结构体的构建带来不良影响，则没有特别限定。例如，阳离子性缓冲液中的强电解质高分子的浓度可以设为大于0mg/mL且小于1.0mg/mL，优选为0.025～0.1mg/mL，更优选为0.05～0.1mg/mL。只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，也可以使用上述高分子电解质的衍生物。另外，作为本实施方式的一个方式，也可以不混合上述强电解质地制备上述混合物，进行细胞结构体的构建。
作为上述细胞外基质成分，可以举出例如胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、巢蛋白、原纤蛋白、蛋白聚糖或它们的修饰体或变体等。在蛋白聚糖中，可以举出硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖等。本实施方式中使用的细胞外基质成分为胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白，其中优选为胶原。只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，也可以使用上述的细胞外基质成分的修饰体和变体。在工序(a)中制备的混合物中，可以仅混合1种细胞外基质成分，也可以组合混合2种以上。本实施方式的细胞结构体的构建中，优选使用胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白，其中更优选使用胶原。与上述阳离子性缓冲液混合的细胞外基质成分的量只要不对细胞的生长及细胞结构体的构建带来不良影响，则没有特别限定。例如，阳离子性缓冲液中的细胞外基质成分的浓度可以设为大于0mg/mL且小于1.0mg/mL，优选为0.025～0.1mg/mL，更优选为0.05～0.1mg/mL。
与上述阳离子性缓冲液混合的强电解质高分子与细胞外基质成分的配合比为1：2～2：1。本实施方式的细胞结构体的构建中，强电解质高分子与细胞外基质成分的配合比优选为1：1.5～1.5：1，更优选为1：1。
重复工序(a)～(c)，具体而言，在工序(c)中得到的细胞结构体上，作为工序(b)，接种工序(a)中制备的混合物，然后进行工序(c)，重复上述工序，由此可以构建充分厚度的细胞结构体。在工序(c)中得到的细胞结构体上新接种的混合物的细胞组成可以与构成已构建的细胞结构体的细胞组成相同，也可以不同。
例如，首先，在工序(a)中制备作为细胞仅含成纤维细胞的混合物，进行工序(b)及(c)，得到在细胞培养容器中由10层成纤维细胞层形成的细胞结构体。接着，作为工序(a)，制备作为细胞仅含有血管内皮细胞的混合物，进行工序(b)和(c)，在细胞培养容器内的10层成纤维细胞层上层叠1层血管内皮细胞层。进而，作为工序(a)，制备作为细胞仅含成纤维细胞的混合物，进行工序(b)及(c)，在细胞培养容器内的血管内皮细胞层上层叠10层成纤维细胞层。此外，作为工序(a)，制备含有从癌症患者采集的癌细胞的混合物，进行工序(b)和(c)，在细胞培养容器内的成纤维细胞层上层叠1层的癌细胞层。由此，能够构建成纤维细胞层10层-血管内皮细胞层1层-成纤维细胞层10层-癌细胞层1层这样每一种细胞依次层叠成层状的细胞结构体。通过调节在工序(b)中接种的细胞数，可以调整工序(c)中层叠的细胞层的厚度。工序(b)中接种的细胞数越多，工序(c)中层叠的细胞层的数量就越多。另外，在工序(a)中，制备将成纤维细胞层20层量的成纤维细胞和血管内皮细胞层1层量的血管内皮细胞全部混合而成的混合物，进行工序(b)及(c)，通过在所形成的多层结构体上，层叠同样地制备的含有从癌症患者采集的癌细胞的混合物，由此能够构建在具有21层量的厚度、血管网结构分散在结构体内部的结构体上层叠有癌细胞层的细胞结构体。此外，在工序(a)中，制备将成纤维细胞层20层量的成纤维细胞和血管内皮细胞层1层量的血管内皮细胞和癌细胞层1层量的来自癌症患者的细胞全部混合而得到的混合物，进行工序(b)及(c)，由此可以构建具有22层量的厚度、癌细胞和血管网结构这两者分别独立地分散在结构体内部的细胞结构体。
在构建由半透膜分隔了间质细胞层和癌细胞层的细胞结构体的情况下，例如，首先，在工序(a)中，制备作为细胞仅含成纤维细胞的混合物，进行工序(b)及(c)，在细胞培养容器中得到由10层成纤维细胞层构成的细胞结构体。接着，作为工序(a)，制备作为细胞仅含血管内皮细胞的混合物，进行工序(b)和(c)，在细胞培养容器内的成纤维细胞层上层叠1层血管内皮细胞层。进而，作为工序(a)，制备作为细胞仅含成纤维细胞的混合物，进行工序(b)及(c)，在细胞培养容器内的血管内皮细胞层上层叠10层成纤维细胞层，然后载置半透膜。进而，作为工序(a)，制备含有从癌症患者采集的癌细胞的混合物，进行工序(b)和(c)，在细胞培养容器内的半透膜上层叠1层癌细胞层。由此，能够构建成纤维细胞层10层-血管内皮细胞层1层-成纤维细胞层10层-半透膜-癌细胞层1层这样每一种细胞依次层叠成层状的细胞结构体。通过调节在工序(b)中接种的细胞数，可以调整工序(c)中层叠的细胞层的厚度和数量。工序(b)中接种的细胞数越多，工序(c)中层叠的细胞层的数量就越多。另外，在工序(a)中，制备将成纤维细胞层20层量的成纤维细胞及血管内皮细胞层1层量的血管内皮细胞全部混合而成的混合物，进行工序(b)及(c)，在所形成的多层结构体上放置半透膜，在该半透膜上层叠同样地制备的含有从癌症患者采集的癌细胞的混合物，由此能够构建在具有21层量的厚度、血管网结构分散在结构体内部的结构体上隔着半透膜层叠有癌细胞层的细胞结构体。
重复工序(a)～工序(c)时，可以在进行工序(c)之后、工序(b)之前，对得到的细胞结构体进行培养。培养中使用的培养基的组成、培养温度、培养时间、培养时的大气组成等培养条件以适于构成该细胞结构体的细胞的培养的条件进行。作为培养基，可以举出例如D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。
工序(a)之后，进行(a’-1)从得到的混合物中除去液体部分、得到细胞集合体的工序，和(a’-2)将细胞集合体悬浮在溶液中的工序，也可以进入到工序(b)。
另外，工序(a)之后，代替所述工序(b)，也可以进行下述工序(b’-1)和(b’-2)。本发明和本申请说明书中，“细胞粘稠体”是指如非专利文献5中记载那样的凝胶样的细胞集合体。
(b’-1)将工序(a)中得到的混合物接种到细胞培养容器内后，从混合物中除去液体成分，得到细胞粘稠体的工序，
(b’-2)在细胞培养容器内将细胞粘稠体悬浮于溶剂中的工序。通过实施上述工序(a)～(c)，可以得到所期望的组织体，但通过在工序(a)之后实施(a’-1)和(a’-2)、实施工序(b)，能够得到更均匀的组织体。
作为用于制备细胞悬浮液的溶剂，只要对细胞没有毒性、不损害增殖性和功能则没有特别限定，可以使用水、缓冲液、细胞的培养基等。作为该缓冲液，可以举出例如磷酸生理盐水(PBS)、HEPES、Hanks缓冲液等。作为培养基，可以举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。
代替上述工序(c)，也可以进行下述工序(c’)。
(c’)从所接种的混合物中除去液体成分，在基材上形成细胞层的工序。
工序(c)和(c’)中的液体成分的除去处理的方法只要不对细胞的生长和细胞结构体的构建带来不良影响，则没有特别限定，作为从液体成分和固体成分的悬浮液中除去液体成分的方法，可以通过本领域技术人员公知的方法适当进行。作为该方法，可以举出例如离心分离处理、磁性分离处理、或过滤处理等。
例如，在使用插入式细胞培养器作为细胞培养容器的情况下，通过将接种有混合物的插入式细胞培养器以10℃、400×g供于1分钟的离心分离处理，由此能够除去液体成分。
<抗癌剂>
本实施方式的评价方法中使用的抗癌剂只要是用于癌症治疗的药剂即可，不仅包括像具有细胞毒性的药剂那样直接作用于癌细胞的药剂，还包括不具有细胞毒性但抑制癌细胞的增殖等的药剂。作为不具有细胞毒性的抗癌剂，可以举出不直接攻击癌细胞而通过与生物体内的免疫细胞或其他药剂的协同作用来发挥抑制癌细胞的增殖、或减缓癌细胞的活动、或使癌细胞死亡的功能的药剂，或通过阻碍癌细胞以外的细胞、组织而抑制癌细胞的增殖的药剂。本实施方式中使用的抗癌剂可以是已知具有抗癌作用的药剂，也可以是新型抗癌剂的候补化合物。
作为具有细胞毒性的抗癌剂，没有特别限定，可以举出例如分子靶向药、烷化剂、5以-FU系抗癌剂所代表的抗代谢剂、植物生物碱、抗癌性抗生素、铂衍生物、激素剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制剂、被分类为生物反应调节剂的化合物等。
作为不具有细胞毒性的抗癌剂，没有特别限定，可以举出例如脉管生成抑制剂、抗癌剂的前药、调节与抗癌剂或其前药的代谢相关的细胞内代谢酶活性的药剂(以下在说明书中称为“细胞内酶调节剂”)、免疫疗法剂等。除此之外，还可以举出通过提高抗癌剂的功能、或提高生物体内的免疫功能而最终参与抗癌作用的药剂。
脉管生成抑制剂只要是期待具有脉管生成抑制活性的化合物即可，可以是已知的脉管生成抑制剂，也可以是新的脉管生成抑制剂的候补化合物。作为已知的脉管生成抑制剂，可以举出Avastin、EYLEA、Suchibaga、CYRAMZA(注册商标)(Eli Lilly公司制，别名雷莫芦单抗(Ramucirumab))、BMS-275291(Bristol-Myers公司制)、Celecoxib(Pharmacia/Pfizer公司制)、EMD 121974(Merck公司制)、Endostatin(EntreMed公司制)、Erbitaux(ImCloneSystems公司制)、Interferon-α(Roche公司制)、LY317615(Eli Lilly公司制)、Neovastat(Aeterna Laboratories公司制)、PTK787(Abbott公司制)、SU6688(Sugen公司制)、Thalidomide(Celgene公司制)、VEGF-Trap(Regeneron公司制)、Iressa(注册商标)(Astrazeneca公司制，别名吉非替尼(Gefitinib))、Caplerusa(注册商标)(Astrazeneca公司制，别名凡德他尼(Vandetanib))、Recentin(注册商标)(Astrazeneca公司制，别名西地尼布(cediranib))、VGX-100(Circadian Technologies公司制)、VD1andcVE199、VGX-300(Circadian Technologies公司制)、sVEGFR2、hF4-3C5、Nexavar(注册商标)(BayerYakuhin公司制，别名索拉非尼(Sorafenib))、Vortrient(注册商标)(GlaxoSmithKline公司制，别名帕唑帕尼(Pazopanib))、Sutent(注册商标)(Pfizer公司制，别名舒尼替尼(Sunitinib))、Inlyta(注册商标)(Pfizer公司制，别名阿西替尼(axitinib))、CEP-11981(Teva Pharmaceutical Industries公司制造)、AMG-386(TakedaYakuhin公司制，别名trebananib)、anti-NRP2B(Genentech公司制)、Ofev(注册商标)(boehringer-ingelheim公司制，别名尼达尼布(Nintedanib))、AMG706(TakedaYakuhin公司制，别名莫特塞尼(Motesanib))等。
抗癌剂的前药是在肝脏等脏器或癌细胞的细胞内酶作用下可转换成具有抗癌作用的活性体的药剂。细胞因子网络通过使其酶活性上升，使活性体的量增加，从而带来抗肿瘤效果的增强，因此作为参与抗肿瘤作用的药剂而被列举。
作为细胞内酶调节剂，可以举出例如单剂时不具有直接的抗肿瘤效果，但通过抑制5-FU系抗癌剂的分解酶(二氢嘧啶脱氢酶，dihydropyrimidine dehydrogenase：DPD)而参与抗癌作用的吉莫斯特(Gimeracil)等。
作为免疫疗法剂，可以举出云芝多糖(krestin)、香菇多糖(Lentinan)、OK-432等生物反应调节疗法中使用的药剂(以下简记为“BRM制剂”)、白介素类、干扰素类等细胞因子系制剂等。
本实施方式的评价方法中，可以使用1种抗癌剂，也可以组合使用2种以上的抗癌剂。另外，也可以将抗癌剂与抗癌剂以外的药剂组合使用。例如，即使是单独给药时也发挥抗癌效果的抗癌剂，在实际的临床现场与其他药剂并用给药的情况下，本实施方式的评价方法也可以将该抗癌剂与该其他药剂并用。
另外，本实施方式的评价方法中，作为细胞结构体，使用由形成有脉管网结构的多层细胞构成且其构成细胞的一部分为癌细胞的细胞结构体，作为抗癌剂，通过使用具有细胞毒性的抗癌剂和脉管生成抑制剂，也能够评价具有细胞毒性的抗癌剂与脉管生成抑制剂的并用效果。
通过该方法，由于使用在更接近生物体内状态的三维结构内包含脉管网结构的细胞结构体，因此能够在不使用动物模型的情况下通过将脉管生成抑制剂和抗癌剂并用而高精度地对得到的药效进行评价。
作为具有细胞毒性的抗癌剂，只要是期待具有细胞毒性的化合物即可，可以是已知的抗癌剂，也可以是新的抗癌剂的候补化合物。
具体而言，具有如下评价工序：将含有癌细胞且具备脉管网结构的细胞结构体在脉管生成抑制剂和具有细胞毒性的抗癌剂存在下进行培养的培养工序；和将所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标、对将所述脉管生成抑制剂和所述抗癌剂并用时的抗癌效果进行评价的评价工序。
该细胞结构体具备脉管网结构，由构成脉管的内皮细胞和未构成脉管的细胞(除内皮细胞以外的细胞)构成。
作为该细胞结构体中所含的除内皮细胞以外的细胞的细胞种类，只要不阻碍内皮细胞形成脉管网则没有特别限定，可以考虑所含的癌细胞的来源和种类、评价中使用的脉管生成抑制剂和抗癌剂的种类、目标抗癌活性所起效的生物体内环境等来适当选择。
<培养工序>
本实施方式的评价方法中，首先，作为培养工序，将包含癌细胞和间质细胞的细胞结构体在抗癌剂存在下进行培养。具体而言，在混合有1种或2种以上抗癌剂的培养基中培养细胞结构体。在评价具有细胞毒性的抗癌剂与脉管生成抑制剂的并用效果的情况下，作为培养工序，将具备脉管网结构的细胞结构体在脉管生成抑制剂和抗癌剂存在下进行培养。具体而言，在混合有脉管生成抑制剂和抗癌剂的培养基中培养细胞结构体。
与培养基混合的抗癌剂的量可以考虑构成细胞结构体的细胞的种类、数量、所含的癌细胞的种类和数量、培养基的种类、培养温度、培养时间等培养条件而实验确定。培养时间没有特别限定，例如可以为24～96小时，优选为48～96小时，更优选为48～72小时。另外，在不使培养环境发生显著变化的限度内，也可以根据需要加入回流等流体力学的载荷。
<评价工序>
以上述培养工序后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数为指标，评价抗癌剂的抗癌效果。具体而言，与在抗癌剂未存在下进行培养的情况相比，癌细胞的活细胞数多时，评价为该抗癌剂对该细胞结构体所含的癌细胞具有抗癌效果。另一方面，与在抗癌剂未存在下进行培养的情况相比，在癌细胞的活细胞数为同等程度或显著性地多时，评价为该抗癌剂对该细胞结构体所含的癌细胞没有抗癌作用。
评价具有细胞毒性的抗癌剂与脉管生成抑制剂的并用效果时，以培养工序后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数为指标，评价将脉管生成抑制剂和抗癌剂并用时的抗癌效果。具体而言，与在仅抗癌剂存在下进行培养的情况相比，癌细胞的活细胞数多时，评价为该抗癌剂通过与该脉管生成抑制剂并用，得到了比单独使用该抗癌剂时更高的抗癌效果，即得到了并用效果。另一方面，与在仅抗癌剂存在下进行培养的情况相比，癌细胞的活细胞数为同等程度时，评价为该抗癌剂即使与该脉管生成抑制剂并用，也无法得到比单独使用该抗癌剂时更高的抗癌效果，即没有得到并用效果。此外，与在仅抗癌剂存在下进行培养的情况相比，癌细胞的活细胞数显著性地多时，评价为该抗癌剂通过与该脉管生成抑制剂并用，抗癌效果反而减弱。
癌细胞的活细胞数可以使用与癌细胞的活细胞或其存在量相关的信号进行评价。只要能够测定评价时间点的癌细胞的活细胞数即可，并不一定需要在存活的状态下进行测定。例如，可以对癌细胞进行标记以与其他细胞区别，将来自该标记的信号作为指标进行研究。例如，在对癌细胞进行荧光标记后，通过进行细胞的存活性判定，能够直接对细胞结构体中存活的癌细胞进行计数。此时，也可以利用图像分析技术。细胞的存活性判定可以通过台盼蓝染色或PI(碘化吡啶，Propidium Iodide)染色等公知的细胞的存活性判定方法来进行。另外，癌细胞的荧光标记例如可以通过将针对特异性表达在癌细胞的细胞表面上的物质的抗体作为一次抗体、使用与该一次抗体特异性结合的荧光标记二次抗体的免疫染色法等公知的方法进行。细胞的存活性判定和活细胞数的测定可以在细胞结构体的状态下进行，也可以在将细胞结构体破坏成单细胞水平的状态下进行。例如，也可以在破坏对癌细胞和死亡细胞进行了标记后的细胞结构体的立体结构后，通过以标记为指标的FACS(荧光激活细胞分选术，fluorescence activated cell sorting)等仅对评价时间点存活的癌细胞进行直接计数。
通过在使细胞结构体中的癌细胞存活的状态下进行标记，经时地检测来自该标记的信号，也可以经时地测定该细胞结构体中的癌细胞的活细胞数。可以在构建细胞结构体之后对该细胞结构体中的癌细胞进行标记，也可以在构建细胞结构体之前预先对癌细胞进行标记。例如，在使用包含来自癌症患者的癌细胞的细胞群的细胞结构体的情况下，也可以在构建细胞结构体之前预先对癌细胞进行标记。另外，来自癌症患者的其他细胞也可以与癌细胞一起被标记。此外，在使用恒定表达荧光色素的癌细胞的情况下，通过用酶标仪等对溶解细胞结构体而得到的裂解物的荧光强度进行测定，也能够评价癌细胞的活细胞数。
另外，在癌细胞层和间质细胞层被半透膜分隔的细胞结构体的情况下，能够容易地从间质细胞分离回收癌细胞。可以通过MTT法等该技术领域中公知的活细胞数测定方法来测定该回收的癌细胞中的活细胞数。
通过本实施方式的评价方法，可以使用具备与实际的生物体内的癌细胞的周边组织结构接近的间质、且间质所分泌的成分对癌细胞产生影响的细胞结构体，此外也可以使用除了间质以外，还具备与实际的生物体内的脉管结构接近的脉管网结构的细胞结构体。这样，本实施方式的评价方法中，能够以体外再现更接近体内环境的状态进行评价，因此能够对药效得到可靠性高的评价。通过本实施方式的评价方法评价为具有抗癌效果的抗癌剂，在实际对癌症患者给药的情况下，也可期待获得充分的抗癌效果。同样地，通过本实施方式的评价方法评价为具有并用效果的脉管生成抑制剂和具有细胞毒性的抗癌剂的组合，在实际对癌症患者给药的情况下，也可期待获得比抗癌剂单独给药时更高的抗癌效果。因此，本实施方式的评价方法在药物研发现场的抗癌剂候选化合物的筛选、药物重新定位筛选、临床现场中的抗癌剂治疗方法(单用、并用)的选择、确定(抗癌剂敏感性试验)等中，可以用作迄今为止还没有的体外药剂评价工具。特别是，使用含有从癌症患者采集的癌细胞的细胞结构体进行本实施方式的评价方法、并由此评价为具有抗癌效果的抗癌剂可期待实际给药给该癌症患者时发挥恰当的抗癌效果。
本发明的第二实施方式的抗癌剂评价用试剂盒(以下有时称为“本实施方式的试剂盒”)具有包含至少含有间质的细胞的细胞结构体和收纳该细胞结构体的细胞培养容器。通过使用将上述第一实施方式的评价方法中使用的试剂等试剂盒化而成的抗癌剂评价用试剂盒，能够更简便地实施上述第一实施方式的评价方法。例如，本实施方式的试剂盒中所含的细胞结构体可以是不含癌细胞的具备脉管网结构的细胞结构体。该试剂盒中所含的细胞结构体的厚度优选为5μm以上。
作为本实施方式的试剂盒中所含的细胞结构体，可以是含有癌细胞的细胞结构体，也可以在试剂盒中不含有癌细胞而含有构成间质的细胞的细胞结构体，在即将实际进行评价方法之前，在该细胞结构体的表面形成癌细胞层。另外，在该试剂盒中，也可以代替细胞结构体而具备构成细胞结构体的细胞中的除癌细胞以外的细胞。
本实施方式的试剂盒中所含的细胞结构体可以至少包含间质且在顶面具备半透膜。作为该试剂盒中所含的细胞结构体，可以是在半透膜上层叠有癌细胞层的结构体，也可以在试剂盒中具备在不含有癌细胞而含有间质细胞的细胞层上载有半透膜的细胞结构体，在即将实际进行评价方法之前，在该细胞结构体的半透膜上形成癌细胞层。
该试剂盒还可以具备在该评价方法中使用的其他物质。作为该其他物质，可以举出例如抗癌剂、细胞结构体的培养基、用于标记癌细胞的标记物质、细胞的存活性判定用试剂、构建细胞结构体时使用的物质(例如阳离子性缓冲液、强电解高分子、细胞外基质成分等)等。
另外，作为抗癌剂，通过组合具有细胞毒性的抗癌剂和血管生成抑制剂，能够更简便地实施具有细胞毒性的抗癌剂与脉管生成抑制剂的并用效果的评价。
实施例
以下示出实施例并具体地说明本发明的实施例，但本发明并不限于下述实施例。
[实施例1]具有脉管结构的细胞结构体的制作
制作由成纤维细胞和血管内皮细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，观察血管网结构。
作为包含血管网结构的细胞结构体，使用由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Lonza公司制、CC-2509、Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)、人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、Human Umbilical Vein Endothelial Cell：HUVEC)这2种的2个种类的细胞形成的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(SystemBiosciences公司制，EXO-FBS-50A-1)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的血管生成抑制剂使用贝伐单抗(R&D Systems公司制，产品编号：MAB293)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和NHDF细胞数为0.05、0.1、0.25、0.5，1.0、1.5、5.0％的HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mMTris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数与NHDF数的比例：5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，在适量的培养基中进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，将该Transwell插入式细胞培养器在室温、400×g下离心处理1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养96小时(工序(c))。
<构成血管的细胞的荧光标记及评价>
对培养后的细胞结构体进行使用了anti-CD31抗体(DAKO公司制，产品编号：JC70AM082329)和二次抗体(Invitrogen公司制，产品编号：A-11001)的荧光免疫染色，将该结构体中的血管进行绿色荧光标记。直接观察该经荧光标记的细胞结构体，确认有无血管网形成。
[表1]
HUVEC含有率(％) 有无血管网形成
0.05 ×
0.1 ○
0.25 ○
0.5 ○
1.0 ○
1.5 ○
5.0 ○
根据表1，除了含有NHDF数的0.05％的HUVEC的情况以外，在所有条件下都确认到血管网结构的形成。
[实施例2]
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价抗癌剂阿霉素的抗癌效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，在由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制、CC-2509)及人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、HUVEC)(Lonza公司制、CC-2517)这2种细胞形成的细胞结构体的顶面层叠有由人结肠直肠腺癌细胞株HT29(ATCC编号：HTB-38TM)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的抗癌剂使用阿霉素(和光纯药公司制，产品编号：046-21523)。
<细胞结构体的构建>
首先，将仅NHDF、或NHDF和HUVEC悬浮在含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟，除去液体成分。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟，除去液体成分。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养96小时。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体。癌细胞使用预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH67GL)的癌细胞。
<阿霉素存在下的培养>
将得到的细胞结构体在阿霉素的最终浓度为10μM的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加阿霉素以外，同样地进行培养(在药剂未存在下的培养)。
另外，为了进行比较，代替上述细胞结构体，构建将癌细胞以单层的方式培养于普通的培养容器而得到的结构体(2D法)，将该2D培养物也同样地在阿霉素存在下进行培养。另外，即使使癌细胞和血管内皮细胞共存，在得到的2D培养物中也没有形成脉管网。
<细胞结构体的分散>
接着，将Tris缓冲溶液(50mM，pH为7.4)适量添加到Transwell插入式细胞培养器中，然后除去液体成分。重复进行该一系列的工序3次。接着，将0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen制)300μL添加至该Transwell插入式细胞培养器中，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)孵育15分钟。然后，回收全部溶液量，预先移至添加有0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen公司制)300μL的回收用1.5mL试管中。接着，将0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen制)100μL添加至该Transwell插入式细胞培养器中，与回收用1.5mL试管一起用CO2培养箱(37℃、5％CO2)孵育5分钟。然后，回收全部溶液量，移至回收用1.5mL试管，再添加0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen公司制)300μL，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)孵育5分钟，得到细胞结构体分散液。
<活细胞数分析及评价>
将所得的细胞结构体的分散液浸渍于台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且未被台盼蓝染色的细胞作为存活的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(LifeTechnologies公司制)的荧光模式进行。
另外，对2D培养物也同样地进行台盼蓝染色后，作为存活的癌细胞进行计数。对于各培养条件，各重复进行3次测定。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留活细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
将各培养物的算出的CNT的结果与构成细胞的数量一起示于表2。表中，“2D”栏表示2D培养物的结果，“3D”栏表示所构建的细胞结构体(本实施例的细胞结构体)的结果。
[表2]
在所构建的细胞结构体中，在仅由NHDF及HT29形成的结构(NHDF(20层)-HT29(1层))中，未形成血管网结构，但在包含HUVEC的结构中，形成了血管网结构。这些细胞结构体无论有无形成血管网，CNT为同等程度，表明在阿霉素等细胞毒性抗癌剂的抗癌效果的评价中，有无血管网的形成没有影响。
另一方面，与本实施例的细胞结构体相比，2D培养物的CNT显著小、阿霉素敏感性高。特别是，关于CNT，与仅癌细胞的2D培养物或仅癌细胞和成纤维细胞的2D培养物相比，本实施例的细胞结构体约为5倍以上，启示了本实施例的细胞结构体构建了与2D培养物相比约5倍以上的药剂不易发挥药效的环境。有趣的是，2D培养物中，与成纤维细胞共培养时抗癌剂容易起作用，与使血管内皮细胞共培养时相比为约2倍左右。通常，作为利用2D培养法的抗癌剂评价不优选的理由，最大的理由是药剂过于起效，但在使用本实施例的细胞结构体的本实施例的评价方法中，药剂的过度影响得到抑制，能够进行可靠性更高的稳定的评价。
[实施例3]
使用血管网结构形成为层状的细胞结构体和血管网结构同样地分散在整个结构体上的细胞结构体，评价抗癌剂阿霉素的抗癌效果。
细胞培养容器、培养基、以及阿霉素与实施例2中所使用的相同。
<血管网结构分散在整个结构体的细胞结构体的构建>
将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液中，除此以外，与实施例2同样地构建细胞结构体。得到的细胞结构体是在血管网结构分散于整个结构体的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-HT29(1层))。
<血管网结构形成为层状的细胞结构体的构建>
首先，将1×106个NHDF悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(工序(a))。将这些细胞悬浮液分别以室温、400×g离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。另外，将3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(工序(a))。将这些细胞悬浮液分别以室温、400×g离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。
接着，将NHDF(1×106个)接种于Transwell插入式细胞培养器中，以室温、400×g离心处理1分钟除去液体成分，接着接种HUVEC(3×104个)，在室温、400×g下离心处理1分钟，除去液体成分，最后接种NHDF(1×106个)(工序(b))，在室温、400×g下离心处理1分钟，除去液体成分。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
然后，与实施例2同样地操作，在所形成的结构体上层叠2×104个HT29细胞进行培养。培养结束后，得到在血管网结构形成为层状的结构体上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(10层)-HUVEC(1层)-NHDF(10层)-HT29(1层))。
<阿霉素存在下的培养>
将得到的细胞结构体在阿霉素的最终浓度为10μM的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加阿霉素以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，对得到的分散液进行台盼蓝染色后，对存活的癌细胞进行计数，算出CNT(％)。对于各培养条件，各重复进行3次测定。将结果示于表3。
[表3]
在使用任一种细胞结构体的情况下，CNT均为同等程度，血管网结构是否分散在层状结构体内对阿霉素的药剂效果没有特别影响。
[实施例4]
使用由成纤维细胞(NHDF)、血管内皮细胞(HUVEC)和癌细胞(HT29)形成、且具备血管网结构的细胞结构体，评价抗癌剂中血管生成抑制剂贝伐单抗和具有细胞毒性的分子靶向药西妥昔单抗的并用效果。
细胞培养容器和培养基使用与实施例2中所使用的相同者。作为评价对象的抗癌剂，使用了贝伐单抗(R&D Systems公司制，产品编号：MAB293)和西妥昔单抗(Merck Serono公司制，无型号)。
<细胞结构体的构建>
细胞结构体与实施例3中的“血管网结构分散在整个结构体的细胞结构体”同样地构建。
<贝伐单抗和/或西妥昔单抗存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的贝伐单抗添加量为0或2μg、西妥昔单抗的最终浓度为0或1mg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了未添加贝伐单抗和西妥昔单抗中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
另外，为了进行比较，代替上述细胞结构体，构建将癌细胞以单层的方式培养于普通的培养容器而得到的结构体(2D法)、和将2×106个NHDF、3×104个HUVEC和2×104个HT29的混合物进行球状体培养而得到的球状体(球状体法)，对于它们也同样地在贝伐单抗和西妥昔单抗存在下进行培养。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，对得到的分散液进行台盼蓝染色后，对存活的癌细胞进行计数，算出CNT(％)。对于各培养条件，各重复进行3次测定。将结果示于表4。
表中，“2D”栏表示2D培养物的结果，“球状体”栏表示球状体的结果，“3D”栏表示所构建的细胞结构体的结果。
[表4]
其结果是，在2D培养物及球状体中，单独给药贝伐单抗时，CNT大致为100％，没有抗癌效果，但在单独给药西妥昔单抗和将西妥昔单抗和贝伐单抗并用给药时，CNT小至60％左右，观察到抗癌效果。另一方面，本实施例的细胞结构体中，单独给药西妥昔单抗时，CNT小，观察到抗癌效果，但在单独给药贝伐单抗和将西妥昔单抗和贝伐单抗并用给药时，CNT为大致100％，没有抗癌效果。
非专利文献6中报告了将使贝伐单抗(Avastin)和西妥昔单抗(Erbitux)与化学疗法并用时、和仅并用了贝伐单抗的化学疗法进行比较得到的随机化临床试验的结果，即通过追加西妥昔单抗，在实际的临床试验中缩短了患者的无再发生存期间和全生存期间中位数。但是，非专利文献7中报告了在PDX(人源异种移植，Patient Derived Xenograft)动物模型中，与单剂疗法相比，贝伐单抗与西妥昔单抗的并用效果更为有效。即，该并用例是在使用动物模型的药效评价中无法预测人的临床试验结果的例子。但是，如表3所示，在使用了本实施例的细胞结构体的情况下，虽然西妥昔单抗单剂给药时起效，但与贝伐单抗并用时完全不起效，这与非专利文献6中记载的人临床试验的结果相同。即，启示通过使用具备三维结构的间质组织的细胞结构体的本发明的评价方法，与动物模型相比，能够进一步预测人临床结果的可能性。
[实施例5]
使用由成纤维细胞(NHDF)、血管内皮细胞(HUVEC)和癌细胞(HT29或HCT116)形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价血管生成抑制剂贝伐单抗及抗癌剂5-FU的并用效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在由NHDF和HUVEC这两种细胞形成的多层结构体的顶面层叠有由HT29或HCT116(ATCC编号：CCL-247)形成的癌细胞层的细胞结构体。细胞培养容器和培养基使用与实施例2中所使用的相同者。
使用作为评价对象的血管生成抑制剂贝伐单抗(R&D Systems公司制，产品编号：MAB293)，并使用普通的细胞毒性抗癌剂使用5-FU(和光纯药公司制，产品编号：064-01403)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数相对于NHDF数的比例：1.5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟，除去液体成分。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟，除去液体成分。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养96小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH67GL)。
<贝伐单抗和5-FU存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔中的贝伐单抗添加量为0或2μg、5-FU的最终浓度为100μM或1mM的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了未添加贝伐单抗和5-FU中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
另外，为了进行比较，代替上述细胞结构体，构建将癌细胞以单层的方式培养于普通的培养容器而得到的结构体(2D法)、和对2×106个NHDF、3×104个HUVEC和2×104个癌细胞的混合物进行球状体培养而得到的球状体(球状体法)，对于它们也同样地在贝伐单抗和5-FU存在下培养。其中，通过2D法得到的2D培养物中未确认到血管网结构。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，对得到的分散液进行台盼蓝染色后，对存活的癌细胞进行计数，算出CNT(％)。
另外，对2D培养物及球状体也同样地进行台盼蓝染色后，作为存活的癌细胞进行计数。对于各培养条件，各重复进行3次测定。
[表5]
[表6]
将作为癌细胞使用HT29细胞时算出的CNT的结果示于表5，将使用HCT116细胞时算出的CNT的结果示于表6。表中，“2D”栏表示2D培养物的结果，“球状体”栏表示球状体的结果，“3D”栏表示所构建的细胞结构体的结果。
对于2种癌细胞，在2D培养物及球状体中，在5-FU单剂条件(5-FU单剂存在下的培养条件)和贝伐单抗并用条件(5-FU及贝伐单抗两者存在下的培养条件)中，CNT均为大致同等程度的值，在药剂敏感性(抗癌效果)方面未发现显著性差异。与此相对，在使用了本实施例的细胞结构体的情况下(本实施例的评价方法)，在任一癌细胞中，无论5-FU的浓度如何，与5-FU单剂条件相比，贝伐单抗并用条件下的CNT显著地变小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性显著性地提高，即确认到并用效果。
[实施例6]
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价血管生成抑制剂贝伐单抗和抗癌剂奥沙利铂的并用效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用实施例5中构建的细胞结构体，细胞培养容器、培养基、以及贝伐单抗也使用与实施例5中所使用的相同者。
<贝伐单抗和奥沙利铂存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的贝伐单抗添加量为0或2μg、奥沙利铂(Pfizer公司制)的最终浓度为10或100μg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了未添加贝伐单抗和奥沙利铂中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，对得到的分散液进行台盼蓝染色后，对存活的癌细胞进行计数，算出CNT(％)。
另外，为了进行比较，与实施例5同样地操作，将2D培养物和球状体也同样地在贝伐单抗和奥沙利铂存在下进行培养，算出CNT(％)。
[表7]
[表8]
将作为癌细胞使用HT29细胞时算出的CNT的结果示于表7，将使用HCT116细胞时算出的CNT的结果示于表8。
对于2种癌细胞，在2D培养物及球状体中，在奥沙利铂单剂条件(奥沙利铂单剂存在下的培养条件)和贝伐单抗并用条件(奥沙利铂及贝伐单抗两者存在下的培养条件)中，CNT均为大致同等程度的值，在药剂敏感性方面未发现显著性差异。与此相对，在使用了本实施例的细胞结构体的情况下，在任一癌细胞中，无论奥沙利铂的浓度如何，与奥沙利铂单剂条件相比，贝伐单抗并用条件下的CNT显著地变小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性显著性地提高，即确认到并用效果。
[实施例7]
使用通过改变血管网结构的形成条件而构建的细胞结构体，评价血管生成抑制剂贝伐单抗和抗癌剂奥沙利铂的并用效果。
细胞培养容器、培养基、以及贝伐单抗使用与实施例5中使用的物质相同者，奥沙利铂使用与实施例6中使用的物质相同者。另外，作为癌细胞，使用HT29细胞。
<细胞结构体的构建>
除了使HUVEC数相对于NHDF数的比例(HUVEC含有率)变更为0.05、0.25、0.5或1.5％以外，与实施例5同样地构建细胞结构体。
其结果，在将HUVEC含有率设为0.25、0.5％或1.5％时构建的细胞结构体中形成有血管网结构，与此相对，在将HUVEC含有率设为0.05％时构建的细胞结构体中未形成血管网结构。
<贝伐单抗和奥沙利铂存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的贝伐单抗添加量为0或2μg、奥沙利铂的最终浓度为100μg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了未添加贝伐单抗和奥沙利铂中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，对得到的分散液进行台盼蓝染色后，对存活的癌细胞进行计数，算出CNT(％)。对于各培养条件，各重复进行3次测定。
[表9]
将算出的CNT的结果与所使用的细胞结构体有无形成血管网一起示于表9。
表中，“单剂”表示在奥沙利铂单剂存在下进行培养时的结果，“并用”表示在奥沙利铂和贝伐单抗两者存在下进行培养时的结果。另外，“有无血管网形成”栏中，“×”表示未形成血管网结构，“○”表示形成了血管网结构。
其结果，除了未观察到血管网形成的HUVEC含有率为0.05％的细胞结构体之外，在观察到血管网形成的全部的细胞结构体中，与奥沙利铂单剂条件相比，贝伐单抗并用条件下的CNT显著地小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性显著性地提高，确认到并用效果。另外，确认了HUVEC含有率越高的细胞结构体的该并用效果越高，脉管生成抑制剂与抗癌剂的并用效果与细胞结构体中的内皮细胞数目成比例地上升。
[实施例8]
使用通过改变血管网结构的形成条件而构建的细胞结构体，评价血管生成抑制剂贝伐单抗和抗癌剂奥沙利铂的并用效果。
细胞培养容器、培养基、以及贝伐单抗使用与实施例5中使用的物质相同者，奥沙利铂使用与实施例6中使用的物质相同者。另外，作为癌细胞，使用HT29细胞。
<细胞结构体的构建>
将HT29细胞接种到形成有由NHDF和HUVEC形成的结构体的Transwell插入式细胞培养器内，进行离心处理，除去液体成分后，使用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养的培养时间变更为24、48、72或96小时，除此以外与实施例5同样地构建细胞结构体。其结果，在全部培养时间内构建了具备血管网结构的细胞结构体。
<贝伐单抗和奥沙利铂存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的贝伐单抗添加量为0或2μg、奥沙利铂的最终浓度为100μg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了未添加贝伐单抗和奥沙利铂中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，对得到的分散液进行台盼蓝染色后，对存活的癌细胞进行计数，算出CNT(％)。对于各培养条件，各重复进行3次测定。
[表10]
将算出的CNT的结果与所使用的细胞结构体有无形成血管网一起示于表10。
表中，“单剂”及“并用”、以及“有无血管网形成”栏的“×”及“○”与表9相同。
其结果是，在全部的细胞结构体中，与奥沙利铂单剂条件相比，贝伐单抗并用条件的CNT显著更小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性显著性地提高，确认到并用效果。另外，确认了对于该并用效果，直至细胞结构体构建时的癌细胞层层叠后的培养时间为72小时，该培养时间越长并用效果越高。
[实施例9]
使用包含含有癌细胞的细胞层、和由成纤维细胞和血管内皮细胞形成且具备血管网结构的细胞层的细胞结构体，评价抗癌剂阿霉素的抗癌效果。
作为具备含有癌细胞的细胞层和含有血管网结构的细胞层的细胞结构体，使用具备NHDF和HUVEC这两种细胞构成多层的细胞层和由HT29形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，细胞培养容器、培养基、作为评价对象的抗癌剂阿霉素使用与实施例2中使用的物质相同者。
<细胞悬浮液的制备>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮，制备间质细胞悬浮液(工序(a’-1)(a’-2))。
另一方面，将2×104个HT29在适量的培养基中悬浮，制备癌细胞悬浮液(工序(a))。HT29使用预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH67GL)的细胞。
<细胞结构体1的构建>
将间质细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟，除去液体成分。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将癌细胞悬浮液接种到形成有含有间质细胞的结构体的Transwell插入式细胞培养器内(工序(b))，然后在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟，除去液体成分。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养96小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的间质细胞层上层叠有癌细胞层的细胞结构体1(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-HT29(1层))。
<细胞结构体2的构建>
在包含间质细胞的结构体上载置孔径为0.4μm的半透膜后，在该半透膜上接种癌细胞悬浮液，形成癌细胞层，除此以外，与细胞结构体1同样地得到细胞结构体2。即，得到在具备血管网结构的间质细胞层上隔着孔径为0.4μm的半透膜层叠有癌细胞层的细胞结构体2(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-半透膜-HT29(1层))。在细胞结构体2中，构成癌细胞层的细胞和构成间质细胞层的细胞完全分离。
<细胞结构体3的构建>
首先，通过将癌细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内，使其形成癌细胞层，在该癌细胞层上载置孔径为0.4μm的半透膜，然后在该半透膜上接种间质细胞悬浮液，使其形成间质细胞层，除此以外，与细胞结构体1同样地得到细胞结构体3。即，得到在癌细胞层上隔着孔径为0.4μm的半透膜层叠有具备血管网结构的间质细胞层的细胞结构体3(HT29(1层)-半透膜-NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层))。在细胞结构体3中，构成癌细胞层的细胞和构成间质细胞层的细胞完全分离。
<细胞结构体4的构建>
除了使用孔径为8μm的半透膜以外，与细胞结构体2同样地得到细胞结构体4。即，得到在具备血管网结构的间质细胞层上隔着孔径为8μm的半透膜层叠有癌细胞层的细胞结构体4(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-半透膜-HT29(1层))。在细胞结构体4中，构成癌细胞层的细胞和构成间质细胞层的细胞在半透膜中的贯通部分相互伸展而接触。
<细胞结构体5的构建>
除了使用孔径为8μm的半透膜以外，与细胞结构体3同样地得到细胞结构体5。即，得到在癌细胞层上隔着孔径为8μm的半透膜层叠有具备血管网结构的间质细胞层的细胞结构体5(HT29(1层)-半透膜-NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层))。在细胞结构体5中，构成癌细胞层的细胞和构成间质细胞层的细胞在半透膜中的贯通部分相互伸展而接触。
<阿霉素存在下的培养>
将得到的细胞结构体在阿霉素的最终浓度为10μM的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加阿霉素以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，将得到的分散液浸渍于台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且未被台盼蓝染色的细胞作为存活的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(LifeTechnologies公司制)的荧光模式进行。
对于各细胞结构体，基于下述式算出CNT(残留活细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
将各细胞结构体算出的CNT的结果与构成细胞的数量一起示于表11。
对于各培养条件，各重复进行3次测定。
[表11]
无论使用哪种细胞结构体，CNT均为30～33％左右，阿霉素敏感性高。由这些结果可知，即使在将间质细胞层和癌细胞层用半透膜分离的情况下，也与未分离的情况同样地，能够评价阿霉素的抗癌效果。另外，确认了所使用的半透膜的孔径也不影响评价，癌细胞或癌组织的表面即使不与间质组织表面的细胞接触，也能够进行药剂评价。
[实施例10]使用由来自肺的间质细胞构成的细胞结构体的情况
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价了血管生成抑制剂贝伐单抗和抗癌剂5-FU的并用效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在由人肺成纤维细胞(NormalHuman Lung Fibroblasts：NHLF)(Lonza公司制，产品编号：CC-2512)、人肺微小血管内皮细胞(Human Dermal Microvascular Endothelial Cell：HMVEC-L)(Lonza公司制、产品编号：CC-2527)这两种细胞形成的多层结构体的顶面层叠有由人肺腺癌细胞株A549(ATCC编号：CCL-185)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的血管生成抑制剂，使用贝伐单抗(R&D Systems公司制，产品编号：MAB293)，普通的细胞毒性抗癌剂使用5-FU(和光纯药公司制，产品编号：064-01403)。
首先，将2×106个NHLF和1×105个HMVEC-L悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HMVEC-L数相对NHLF数的比例：5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHLF(20层量)和HMVEC-L(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH67GL)。
<贝伐单抗和5-FU存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的贝伐单抗添加量为0或2μg、5-FU的最终浓度为100μM的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加贝伐单抗和5-FU中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<固定及癌细胞的染色>
与实施例2同样地分散培养后的细胞结构体，将经分散的悬浮液在室温、1120×g下离心处理5分钟。然后，加入Fixation/Permilization solution(BD bioscience公司制，554722)400μL，在4℃下固定30分钟，除去液体成分。然后，添加试剂盒附带的Perm/Washbuffer 400μL，在室温、1120×g下离心处理5分钟。然后，添加用含有5％FBS的PBS稀释的一次抗体Monoclonal Mouse Anti-human Cytokeratin7(DAKO公司制、M7018)，在4℃下使其反应30分钟。然后，除去液体成分，用试剂盒附带的Perm/Wash buffer洗涤2次，添加用含有5％FBS的PBS稀释的二次抗体Goat anti-Mouse IgG1Cross-Adsorbed SecondaryAntibody，Alexa Fluor 546(ThermoFischer Scientific公司制，A-11030)，在4℃下使其反应30分钟。然后，除去液体成分，用试剂盒附带的Perm/Wash buffer洗涤2次，用含有5％FBS的PBS 350μL进行再悬浮。
<活细胞数测量及评价>
对在固定及染色后的悬浮液中发出荧光的细胞，计数存活的癌细胞。细胞的计数使用流式细胞仪(索尼公司制)进行。
对于各培养条件，各重复进行3次测定。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留性细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
[表12]
将算出的CNT的结果示于表12。其结果是，在2D培养物中，在5-FU单剂条件和贝伐单抗并用条件下，CNT大致相等，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性无显著变化，未确认到并用效果。
与此相对，在使用来自肺的成纤维细胞、血管内皮细胞并使用本实施例的细胞结构体的情况下，与5-FU单剂条件相比，贝伐单抗并用条件下的CNT显著地小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性显著性地提高，确认到并用效果。
[实施例11]使用市售的肺癌细胞株时的并用效果
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价血管生成抑制剂贝伐单抗和抗癌剂5-FU的并用效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制，产品编号：CC-2509)和人脐带静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC)(Lonza公司制，产品编号：CC-2517A)这两种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠有由作为人肺腺癌细胞株A549(ATCC编号：CCL-185)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的血管生成抑制剂，使用贝伐单抗(R&D Systems公司制，产品编号：MAB293)，普通的细胞毒性抗癌剂使用5-FU(和光纯药公司制，产品编号：064-01403)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数相对于NHDF数的比例：1.5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH26GL)。
<贝伐单抗和在5-FU存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的贝伐单抗添加量为0或2μg、5-FU的最终浓度为100μM或1mM的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加贝伐单抗和5-FU中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<固定及癌细胞的染色>
与实施例2同样地分散培养后的细胞结构体，将经分散的悬浮液在室温、1120×g下离心处理5分钟。然后，加入Fixation/Permilization solution(BD bioscience公司制，554722)400μL，在4℃下固定30分钟，除去液体成分。然后，添加试剂盒附带的Perm/Washbuffer 400μL，在室温、1120×g下离心处理5分钟。然后，添加用含有5％FBS的PBS稀释的一次抗体Monoclonal Mouse Anti-human Cytokeratin7(DAKO公司制、M7018)，在4℃下使其反应30分钟。然后，除去液体成分，用试剂盒附带的Perm/Wash buffer洗涤2次，添加用含有5％FBS的PBS稀释的二次抗体Goat anti-Mouse IgG1Cross-Adsorbed SecondaryAntibody，Alexa Fluor 546(ThermoFischer Scientific公司制，A-11030)，在4℃下使其反应30分钟。然后，除去液体成分，用试剂盒附带的Perm/Wash buffer洗涤2次，用含有5％FBS的PBS 350μL进行再悬浮。
<活细胞数测量及评价>
对在固定及染色后的悬浮液中发出荧光的细胞，计数存活的癌细胞。细胞的计数使用流式细胞仪(索尼公司制)进行。
对于各培养条件，各重复进行3次测定。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留性细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
[表13]
将算出的CNT的结果示于表13。其结果是，在A549细胞中，无论5-FU的浓度如何，与5-FU单剂条件相比，贝伐单抗并用条件下的CNT更小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性变高，确认到并用效果。5当-FU的浓度为1mM时，CNT更显著地小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性变高。
[实施例12]使用市售的肺癌细胞株的情况
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价抗癌剂奥沙利铂的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制，产品编号：CC-2509)和人脐带静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC)(Lonza公司制，产品编号：CC-2517A)这两种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠有由市售的肺癌细胞株NCI-H820(ATCC编号：HTB-181)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的普通的细胞毒性抗癌剂使用奥沙利铂(Pfizer公司制)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.05mg/mL肝素、0.05mg/mL胶原、25mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数相对于NHDF数的比例：1.5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟(工序(b’-1)及(b’-2))。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH26GL)。
<奥沙利铂存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的奥沙利铂的最终浓度为1μg/mL或10μg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加奥沙利铂以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，将得到的分散液浸渍于台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且未被台盼蓝染色的细胞作为存活的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(LifeTechnologies公司制)的荧光模式进行。
对于各培养条件，各测定1次。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留性细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
将各培养物算出的CNT的结果示于表14。表中，“2D”栏表示2D培养物的结果，“3D”栏表示所构建的细胞结构体(本实施例的细胞结构体)的结果。
[表14]
该结果确认了，与2D培养物相比，在使用本实施例的细胞结构体的情况下，无论奥沙利铂浓度如何，药剂敏感性都低，即耐药性都高。
[实施例13]使用市售的胃癌细胞株的情况
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价抗癌剂奥沙利铂的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制，产品编号：CC-2509)和人脐带静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC)(Lonza公司制，产品编号：CC-2517A)这两种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠有由市售的胃癌细胞株NCI-N87(ATCC编号：CRL-5822)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的普通的细胞毒性抗癌剂使用奥沙利铂(Pfizer公司制)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.05mg/mL肝素、0.05mg/mL胶原、25mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数相对于NHDF数的比例：1.5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH26GL)。
<奥沙利铂存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的奥沙利铂的最终浓度为10μg/mL或100μg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加奥沙利铂以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，将得到的分散液浸渍于台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且未被台盼蓝染色的细胞作为存活的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(LifeTechnologies公司制)的荧光模式进行。
对于各培养条件，各测定1次。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留性细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
将各培养物的算出的CNT的结果示于表15。表中，“2D”栏表示2D培养物的结果，“3D”栏表示所构建的细胞结构体(本实施例的细胞结构体)的结果。
[表15]
该结果确认了，与2D培养物相比，在使用本实施例的细胞结构体的情况下，无论奥沙利铂浓度如何，药剂敏感性都低，即耐药性都高。
[实施例14]使用市售的乳腺癌细胞株的情况
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价抗癌剂阿霉素的抗癌效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，在由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制、CC-2509)及人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、HUVEC)(Lonza公司制、CC-2517)这2种细胞形成的细胞结构体的顶面层叠有由市售乳腺癌细胞株MCF-7(ATCC编号：HTB-22)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的抗癌剂使用阿霉素(和光纯药公司制，产品编号：046-21523)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数相对于NHDF数的比例：1.5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH26GL)。
<阿霉素存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的奥沙利铂的最终浓度为1μM或10μM的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加阿霉素以外，同样地进行培养(在药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，将得到的分散液浸渍于台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且未被台盼蓝染色的细胞作为存活的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(LifeTechnologies公司制)的荧光模式进行。
对于各培养条件，各重复进行3次测定。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留性细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
将各培养物的算出的CNT的结果示于表16。表中，“2D”栏表示2D培养物的结果，“3D”栏表示所构建的细胞结构体(本实施例的细胞结构体)的结果。
[表16]
该结果确认了，与2D培养物相比，在使用本实施例的细胞结构体的情况下，无论阿霉素浓度如何，药剂敏感性都低，即耐药性都高。
[实施例15]使用临床乳腺癌细胞的情况
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价血管生成抑制剂贝伐单抗和抗癌剂5-FU的并用效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制，产品编号：CC-2509)和人脐带静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC)(Lonza公司制，产品编号：CC-2517A)这两种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠有由来自患者的乳腺癌细胞CLTH/BC(由Celther公司制，型号：CL04002-CLTH)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。作为评价对象的血管生成抑制剂，使用贝伐单抗(R&D Systems公司制，产品编号：MAB293)，普通的细胞毒性抗癌剂使用奥沙利铂(Pfizer公司制)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数相对于NHDF数的比例：1.5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的1×105个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养5小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH26GL)。
<贝伐单抗和奥沙利铂存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的贝伐单抗添加量为0或2μg、奥沙利铂的最终浓度为10μg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了未添加贝伐单抗和奥沙利铂中的任一种以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，将得到的分散液浸渍于台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且未被台盼蓝染色的细胞作为存活的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(LifeTechnologies公司制)的荧光模式进行。
对于各培养条件，各重复进行3次测定。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留性细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
[表17]
将算出的CNT的结果示于表17。其结果是，与奥沙利铂单剂条件相比，贝伐单抗并用条件下的CNT显著更小，通过贝伐单抗并用，药剂敏感性显著性地提高，确认到并用效果。
[实施例16]KRAS基因突变的市售癌细胞株
使用由成纤维细胞、血管内皮细胞和癌细胞形成且具备血管网结构的细胞结构体，评价表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂西妥昔单抗。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，在由来自人新生儿的皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制、CC-2509)及人脐带静脉内皮细胞(Lonza公司制、CC-2517A、HUVEC)(Lonza公司制、CC-2517)这2种细胞形成的细胞结构体的顶面层叠有KRAS密码子13基因突变型细胞株HCT116(ATCC编号：CCL-247)、KRAS密码子12基因突变型细胞株A549(ATCC编号：CCL-185)形成的癌细胞层的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell插入式细胞培养器(Corning公司制，产品编号：#3470)，作为培养基，使用含10容量％牛血清(Corning公司制，产品编号：#35-010-CV)和1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制，168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制，产品编号：043-30085)。使用作为评价对象的西妥昔单抗(Merck Serono公司制，无型号)。
<细胞结构体的构建>
首先，将2×106个NHDF和3×104个HUVEC悬浮于含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(HUVEC数相对于NHDF数的比例：1.5％)(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温、400×g下离心处理1分钟，除去上清液后，用适量的培养基进行再悬浮(工序(a’-1)(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种到Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。
将悬浮于适量的培养基中的2×104个癌细胞接种到形成有结构体的Transwell插入式细胞培养器内后(工序(b))，在室温、400×g下离心处理该Transwell插入式细胞培养器1分钟。然后，将适量的培养基追加到该Transwell插入式细胞培养器中后，用CO2培养箱(37℃、5％CO2)培养24小时(工序(c))。培养结束后，得到在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体(NHDF(20层量)和HUVEC(1层量)的混合层(21层)-癌细胞(1层))。癌细胞预先进行了荧光标记(SIGMA公司制，产品编号：PKH26GL)。
<西妥昔单抗存在下的培养>
将得到的细胞结构体在Transwell插入式细胞培养器的每1孔的西妥昔单抗的最终浓度为10μg/mL的培养基中、在37℃、5％CO2的条件下培养72小时，作为对照，除了不添加西妥昔单抗以外，同样地进行培养(药剂未存在下的培养)。
另外，为了进行比较，对于代替上述细胞结构体的将癌细胞以单层的方式培养于普通的培养容器而得到的结构(2D法)也同样地在西妥昔单抗存在下培养。另外，在通过2D法得到的2D培养物中，未确认到血管网结构。
<细胞结构体的分散、活细胞数分析及评价>
与实施例2同样地分散细胞结构体，将得到的分散液浸渍于台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且未被台盼蓝染色的细胞作为存活的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(LifeTechnologies公司制)的荧光模式进行。
对于各培养条件，各重复进行3次测定。
对于各培养物，基于下述式算出CNT(残留性细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药剂未存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
将各培养物算出的CNT的结果示于表中。表中，“2D”栏表示2D培养物的结果，“3D”栏表示所构建的细胞结构体(本实施例的细胞结构体)的结果。
[表18]
[表19]
将算出的CNT的结果示于表18及表19。其结果是，对于任一癌细胞株均在使用2D培养物及本实施例的细胞结构体的两种情况下，CNT为100％左右，未确认到药剂敏感性。另外，KRAS密码子13突变型HCT116细胞、KRAS密码子12突变型A549细胞是对西妥昔单抗具有耐药性的细胞。
由此启示，使用了本发明的细胞结构体时，能够确认正确反映所使用的2种细胞株的特性的药剂敏感性。

Claims (17)

1.一种抗癌剂的评价方法，其具有下述工序：
将含有癌细胞和构成间质的细胞的细胞结构体在1种或2种以上的抗癌剂存在下进行培养的培养工序；和
将所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标来评价所述抗癌剂的抗癌效果的评价工序。
2.根据权利要求1～4中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述癌细胞分散在所述细胞结构体内部。
3.根据权利要求1～4中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述细胞结构体包含仅含有癌细胞的细胞层。
4.根据权利要求1所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述细胞结构体被半透膜分隔为含有癌细胞的层和含有构成间质的细胞的层。
5.根据权利要求4中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述半透膜的孔径为0.4μm～8μm。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述细胞结构体含有选自由血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞组成的组中的一种以上作为构成所述间质的细胞。
7.根据权利要求6所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述细胞结构体还含有选自由成纤维细胞、神经细胞、树突细胞、巨噬细胞和肥大细胞组成的组中的一种以上作为构成所述间质的细胞。
8.根据权利要求1～5中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述细胞结构体含有选自由血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞组成的组中的1种以上和成纤维细胞作为构成所述间质的细胞，
所述细胞结构体中的血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞的总细胞数为成纤维细胞的细胞数的0.1％以上。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述细胞结构体的厚度为5μm以上。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述细胞结构体具备脉管网结构。
11.根据权利要求10所述的抗癌剂的评价方法，其中，
在所述培养工序中，将所述细胞结构体在具有细胞毒性的抗癌剂和脉管生成抑制剂存在下进行培养，
评价将所述脉管生成抑制剂和所述抗癌剂并用时的抗癌效果。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述癌细胞是从癌症患者采集的癌细胞。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的抗癌剂的评价方法，其中，
所述培养工序中的培养时间为24～96小时。
14.一种抗癌剂评价用试剂盒，
其是用于进行权利要求1～13中任一项所述的抗癌剂的评价方法的试剂盒，
其具备至少包含构成间质的细胞的细胞结构体和收纳所述细胞结构体的细胞培养容器。
15.根据权利要求14所述的抗癌剂评价用试剂盒，其中，
所述细胞结构体在顶面具备半透膜。
16.根据权利要求14或15所述的抗癌剂评价用试剂盒，其中，
所述细胞结构体具备脉管网结构。
17.根据权利要求14～16中任一项所述的抗癌剂评价用试剂盒，其中，
所述细胞结构体的厚度为5μm以上。
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