CN110998320B - 抗癌效果的评价方法及癌症免疫疗法的有效性预测方法 - Google Patents
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
Abstract
抗癌效果的评价方法具有下述工序：在免疫细胞及抗癌药物的存在下对含有作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞和癌细胞的细胞结构体进行培养的培养工序；和以所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标，对所述抗癌药物或所述免疫细胞的抗癌效果进行评价的评价工序。
Description
技术领域
本发明涉及对于免疫细胞存在下的抗癌药物的抗癌效果、在不使用动物模型的情况下在体外(in vitro)体系中进行可靠性更高的评价的方法，及使用了该方法的癌症免疫疗法的有效性预测方法。
本申请基于在2017年8月21日于日本申请的日本特愿2017-158899号主张优先权，在此援引其内容。
背景技术
为了抗癌药物的开发或癌症治疗中的适当抗癌药物的选择，利用体外的分析体系进行抗癌药物对于癌细胞作用的评价。这种体外的分析体系也被用于新药开发中。药剂批准率极低，例如就日本国内制药企业而言为0.1％。为了提高药剂批准率的成功率，需要对药剂候补药物是否确实具有所期望的药效进行早期判断，要求可靠性高的药效评价方法。特别是，现有的动物模型的局限性也是制药企业进行新药开发不成功的理由之一，制药企业需要代替动物模型的更加再现生物体内环境的药剂评价模型。
但是，现有的在体外体系中进行的抗癌药物的评价方法中，对于在给药至生物体内时能够发挥优异抗癌作用的药剂候补物质，有时仅能获得较低评价。相反地，即便是在现有的体外的分析体系中获得了较高评价的药剂候补物质，也有时在给药至生物体内时无法获得充分的抗癌作用，产生了利用该分析体系进行的评价未必一定会与实际的临床效果相关这样的不良情况。由于该利用现有的体外的分析体系获得的评价与实际给药至生物体内时获得的药效之间的相关性较低，因此根据现有的体外的评价方法，有时无法选择在癌症治疗中适当的抗癌药物，不能实现癌症治疗的成绩提高。
另外，近年来，在癌症治疗方法中，癌症免疫疗法受到关注。免疫疗法中使用的抗PD-1抗体等免疫检查点抑制剂等由于难以进行利用动物模型的评价，因此强烈期待有效的体外分析体系。最近还报告了使用向经人源化(Humanized)的实验动物移植了PDX(PatientDerived Xenograft，病人来源异种移植物)的模型动物的免疫疗法评价。但是，将免疫体系完全地人源化是很困难的，是在生物体系统与人不同的动物的体内进行的。另外，根据肿瘤的种类不同，肿瘤的植入成功率存在偏差(25～75％)，不仅PDX的建立耗费时间，而且还具有如果无法传代则不会稳定地癌化等问题。因此，难以将使用了PDX的免疫疗法评价利用到开发的早阶段的药剂候补物质的药效评价中，需要更有用的体外的分析体系。
然而，作为在体外体系中进行的抗癌药物的评价方法，例如专利文献1中公开了在胶原凝胶的液滴中使癌细胞与免疫细胞共存地培养、进行药剂的抗癌评价的方法。该方法中，利用了专利文献2所记载的将癌细胞周边的间质积极地除去、使癌细胞以仅为癌细胞的细胞团块的方式进行增殖的方法。
但是，最近对结直肠癌患者的数据进行分析而弄清楚的是，在预后不良的患者中高表达的基因多数有在间质中进行表达的可能性。另外，使用由移植了人的癌细胞的小鼠获得的数据，对该可能性进行验证，也发现了在预后不良的患者中高表达的基因并非来自于人的癌组织，而是来自于其周围的小鼠的组织(非专利文献1)。特别是有报告指出，恶性度较高的癌中，多出现异常激活的特殊的成纤维细胞，被称作“癌症相关成纤维细胞(Cancer Associated Fibroblast：CAF)”。已经报告了这些CAF还会促进血管新生或癌细胞的增殖、浸润等(非专利文献2)。因此，在癌症微环境(生物体内的癌细胞及其周边环境)中，间质对癌细胞的影响非常地大，认为通过使间质共存，可以构建更接近生物体内的环境。
另外，作为在体外体系中进行的抗癌药物的评价方法，例如就作为抗PD-1单克隆抗体药的Nivolumab(纳武单抗)而言，在美国临床上进行了研究与作用机制有关的蛋白质(PD-L1)的表达的方法。
纳武单抗是癌症免疫疗法的治疗药的代表。利用该方法，在给药了抗PD-1单克隆抗体药时获得的效果虽然某种程度地可以预测，但其有效率为20％，无法说是充分的药效评价。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4866162号公报
专利文献2：日本专利第3594978号公报
非专利文献
非专利文献1：Isella,et al.,Nature Genetics,2015,vol.47,p.312-319
非专利文献2：Shimoda,et al.,Seminars in Cell&Developmental Biology,2010,vol.21(1),p.19-25
非专利文献3：Brambilla et al.,JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY,2016,vol.34(11),p.1223-1230
非专利文献4：Nishiguchi et al.,Macromol Bioscience,2015,vol.15(3),p.312-317
非专利文献5：Sanmamed et al.,Cancer Research,2015,vol.75(17),p.3466-3478
非专利文献6：Le et al.,The New England Journal of Medicine,2015,vol.372(26),p.2509-2520
发明内容
发明要解决的技术问题
在体外的评价体系中进行药物的药效评价时，所得评价的可靠性成为问题。即，利用该评价体系的评价反映将该药物实际给药至生物体时获得的药效是重要的，利用该评价体系的评价与给药至生物体获得的效果一致的概率高的评价体系是可靠性高的评价体系。
在体外的评价体系中进行包括免疫体系的药效评价时，该免疫细胞体系实际上保持着与生物体内同样的生理活性也是很重要的。但是，专利文献1记载的方法中，由于使癌细胞固定支撑在胶原凝胶的液滴内进行培养，因此无法观察到间质与癌细胞的相互作用。该方法由于原本就不存在间质，因此难以说是再现了实际的癌症微环境，有时所得评价的可靠性低。
特别是，对于抗PD-1抗体药的效果，据说需要细胞毒性T细胞浸润至肿瘤组织的附近而存在(非专利文献3)，因此，在体外观察抗PD-1抗体药的效果时，需要考虑到这一点，但这种方法还不存在。
本发明的目的在于提供作为在包括免疫体系的体外体系中进行的抗癌药物等的抗癌效果的评价方法的、在不使用动物模型的情况下即可进行可靠性更高的评价的评价方法，以及使用了该方法的癌症免疫疗法的有效性预测方法。
用于解决技术问题的手段
本发明人们为了解决上述技术问题，对于各种细胞培养方法进行了反复研究时注意到，在包括免疫体系的抗癌作用的评价试验的分析体系中，通过尽量地使体系内接近生物体内环境，该评价对象在生物体内实际作用的状态得以再现，可获得反映了将该药物实际给药至生物体时获得的药效的评价。具体地说注意到，通过对在使癌细胞与在生物体内环境中与癌细胞共存的间质、例如内皮细胞或成纤维细胞等共存的状态下进行了组织化而得到的结构体给药免疫细胞和抗癌药物，可对该抗癌药物的药效获得可靠性更高的评价，从而完成了本发明。
[1]本发明第一方式的抗癌效果的评价方法具有以下工序：在免疫细胞及抗癌药物的存在下对含有作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞和癌细胞的细胞结构体进行培养的培养工序；和以所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标、对所述抗癌药物或所述免疫细胞的抗癌效果进行评价的评价工序。
[2]所述细胞结构体中，作为构成所述间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞，可以含有选自血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞中的1种以上。
[3]所述细胞结构体中，作为构成所述间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞，可以进一步含有成纤维细胞、神经细胞、肥大细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞及平滑肌细胞中的1种以上。
[4]所述细胞结构体的厚度可以为5μm以上。
[5]所述细胞结构体可以具备脉管网结构。
[6]所述细胞结构体中，癌细胞可以仅存在于特定的细胞层中。
[7]所述癌细胞可以散存于所述细胞结构体的内部。
[8]所述免疫细胞可以是选自白细胞及淋巴细胞中的1种以上。
[9]所述免疫细胞可以是血浆中外周血单核细胞。
[10]所述抗癌药物可以是癌症免疫检查点抑制剂。
[11]本发明第二方式的抗癌药物的评价用试剂盒是进行上述方式的抗癌效果的评价方法的试剂盒，其具备1种以上的细胞结构体和分别收容所述细胞结构体的细胞培养容器，所述细胞结构体含有作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞和癌细胞，且厚度为5μm以上。
[12]本发明第三方式的癌症免疫疗法的有效性预测方法具有以下工序：在免疫细胞及抗癌药物的存在下对内部具备含有癌细胞的细胞层的细胞结构体进行培养的培养工序；以所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标，使用所述癌细胞和所述免疫细胞中的至少一者对癌症免疫疗法的有效性进行预测的预测工序，所述细胞结构体含有1种以上的作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞，所述癌细胞与所述免疫细胞中的至少一者为从癌症患者采集的细胞。
[13]所述培养工序中，可以在所述免疫细胞及所述抗癌药物的存在下对细胞结构体中含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置互不相同的2种以上的细胞结构体进行培养。
[14]所述抗癌药物可以是癌症免疫检查点抑制剂。
[15]所述免疫细胞可以是血浆中外周血单核细胞。
[16]本发明第四方式的癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒是进行上述方式的癌症免疫疗法的有效性预测方法的试剂盒，其具备细胞结构体中含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置互不相同的2种以上的细胞结构体和分别收容所述细胞结构体的细胞培养容器，所述细胞结构体含有1种以上的作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞，且所述细胞结构体中的含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置处于所述细胞结构体的从顶面至厚度方向一半高度的范围内。
发明效果
本发明上述方式的抗癌效果的评价方法及癌症免疫疗法的有效性预测方法是以对在更接近于生物体内状态下存在的癌细胞、具体地说是含有间质的细胞结构体中所含的癌细胞的影响作为指标、来对免疫体系存在下的抗癌药物的药效进行评价。因此，即使是体外的评价体系也可获得可靠性高的评价。
另外，通过使用本发明上述方式的抗癌药物评价用试剂盒或癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒，可以更为简便地实施上述抗癌效果的评价方法或癌症免疫疗法的有效性预测方法。
附图说明
图1为表示作为实施例2中的确认试验、利用Western blotting法对PD-L1蛋白表达量多的人非小细胞性肺腺癌细胞株NCI-H1975与PD-L1蛋白表达量少的人肺泡基底上皮腺癌细胞株A549中的PD-L1表达量进行比较的结果的图。
图2为作为实施例4中的确认试验，(a)是癌细胞层被接种于顶面时的细胞结构体的截面照片、(b)是癌细胞层被接种于自顶面起第10层时的细胞结构体的截面照片、(c)是癌细胞层被接种于自顶面起第20层时的细胞结构体的截面照片。
具体实施方式
本发明一个实施方式的抗癌效果的评价方法(以下有时称作“本发明一个实施方式的评价方法”)具有以下工序：在免疫细胞及抗癌药物的存在下对含有癌细胞及构成间质的细胞(但免疫细胞除外)的细胞结构体进行培养的培养工序；和以所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标、对所述抗癌药物或所述免疫细胞的抗癌效果进行评价的评价工序。本实施方式的评价方法中，使用在由作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞所形成的三维结构内含有癌细胞的细胞结构体，来评价免疫细胞存在下的抗癌药物的抗癌效果。间质和免疫细胞均是在生物体内的癌症微环境中重要的构成。通过使构成间质的细胞形成三维结构的细胞结构体内含有癌细胞、进而使其存在免疫细胞，从而模仿出了生物体内的癌细胞的环境。如此，通过在与实际的生物体内的癌细胞的环境同样地也包括免疫体系的环境下进行评价，可以也一并考虑因生物体内的免疫体系所造成的影响来适当地评价抗癌作用。即，通过本实施方式的评价方法，即便是体外的评价体系，也能够进行更加反映出动物模型或人的临床结果的抗癌效果的评价，获得可靠性高的评价。
<细胞结构体>
本实施方式及本申请说明书中，“细胞结构体”是指多个细胞层层叠而成的3维结构体。“细胞层”是指在细胞结构体的厚度方向的截面的切片图像中、在以能够识别细胞核的倍率、即经染色的切片的整个厚度进入视野中的倍率进行观察时存在于正交于厚度方向的方向上、由相对于厚度方向、细胞核不重叠地存在的一群细胞及间质所构成的层。另外，“层状”是指不同的细胞层在厚度方向上重叠2层以上。本实施方式中使用的细胞结构体(以下有时称作“本实施方式的细胞结构体”)由构成间质的细胞中的免疫细胞以外的细胞和癌细胞构筑。此外，以下的说明书中只要没有特别记载，将“作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞”称作“间质细胞”。
含有构成本实施方式的细胞结构体的间质细胞或癌细胞的细胞并无特别限定，可以是从动物采集的细胞，也可以是对从动物采集的细胞进行了培养而得到的细胞，还可以是对从动物采集的细胞实施了各种处理而得到的细胞，还可以是培养细胞株。在为从动物采集的细胞时，采集部位并无特别限定，可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等来源的体细胞，还可以是生殖细胞，还可以胚性干细胞(ES细胞)。另外，构成本实施方式的细胞结构体的细胞来源的生物种类并无特别限定，例如可以使用人、猴、狗、猫、兔子、猪、牛、小鼠、大鼠等动物来源的细胞。作为对从动物采集的细胞进行了培养而得到的细胞，可以是原代培养细胞、也可以是传代培养细胞。另外，作为实施了各种处理而得到的细胞，可举出诱导多能干细胞(iPS细胞)或分化诱导后的细胞。另外，本实施方式的细胞结构体可以仅由同种生物种来源的细胞构成，还可以由多种生物种来源的细胞构成。
作为间质细胞，例如可举出内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、肥大细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞、平滑肌细胞等。本实施方式的细胞结构体中所含的间质细胞可以是1种，也可以是2种以上。作为本实施方式的细胞结构体中所含间质细胞的细胞种类，并无特别限定，可以考虑待含有的癌细胞的来源或种类、评价中要使用的免疫细胞的种类、评价中要使用的抗癌药物的种类、待发挥目标抗癌活性的生物体内的环境等来适当地选择。
血管网结构或淋巴管网结构对于癌细胞的增殖或活性是重要的。因此，本实施方式的细胞结构体优选具备脉管网结构。即，作为本实施方式的细胞结构体，优选是在未形成脉管的细胞的层叠体的内部三维地构筑淋巴管及/或血管等的脉管网结构，从而构筑更接近生物体内的组织。脉管网结构可以仅形成在细胞结构体的内部，也可以是按照至少脉管网结构的一部分露出至细胞结构体的表面或底面的方式来形成。此外，本实施方式及本申请说明书中，“脉管网结构”是指生物体组织中的血管网或淋巴管网那样的网状结构。
脉管网结构可以通过含有构成脉管的内皮细胞作为间质细胞来形成。作为本实施方式的细胞结构体中所含的内皮细胞，可以是血管内皮细胞，也可以是淋巴管内皮细胞。另外，还可以含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者。
本实施方式的细胞结构体具备脉管网结构时，作为该细胞结构体中的内皮细胞以外的细胞，出于内皮细胞易于形成保持原本功能及形状的脉管网的理由，优选是在生物体内构成脉管周边组织的细胞，出于使得更接近于生物体内的癌症微环境的理由，作为内皮细胞以外的细胞，更优选是至少含有成纤维细胞的细胞，进一步优选是含有血管内皮细胞和成纤维细胞的细胞、含有淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞、或者含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞。此外，作为细胞结构体中所含的内皮细胞以外的细胞，可以是与内皮细胞同种的生物种来源的细胞，还可以是不同的生物种来源的细胞。
本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞的数量只要是足以形成脉管网结构的数量则无特别限定，可以考虑细胞结构体的大小、内皮细胞或内皮细胞以外的细胞的细胞种类等来适当决定。例如，通过使构成本实施方式的细胞结构体的内皮细胞与全部细胞的存在比(细胞数比)为0.1％以上，可以制备形成有脉管网结构的细胞结构体。作为内皮细胞以外的细胞使用成纤维细胞时，本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞数优选是成纤维细胞数的0.1％以上、更优选是0.1～5.0％。作为内皮细胞含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者时，血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞的总细胞数优选是成纤维细胞数的0.1％以上、更优选是0.1～5.0％。
本实施方式的细胞结构体进一步含有癌细胞。本实施方式的细胞结构体中所含的癌细胞可以是1种，还可以是2种以上。此外，癌细胞是指由体细胞衍生、获得了无限增殖能力的细胞。作为本实施方式的细胞结构体中所含的癌细胞，可以是经细胞株化的培养细胞、还可以是从癌症患者采集的癌细胞。从癌症患者采集的癌细胞可以是预先进行培养而使其增殖了的细胞。具体地可以举出从癌症患者采集的原代癌细胞、人工培养癌细胞、iPS癌症干细胞、癌症干细胞、为了利用于癌症治疗的研究或抗癌药物的开发而预先准备的细胞株化癌细胞等。另外，可以是人来源的癌细胞，还可以是人以外的动物来源的癌细胞。此外，本实施方式的细胞结构体含有从癌症患者采集的癌细胞时，还可以与癌细胞一起含有除从癌症患者采集的癌细胞以外的细胞。作为除癌细胞以外的细胞，例如可举出术后摘除的固形组织内所含的1种以上的细胞。
作为成为本实施方式的细胞结构体中所含的癌细胞的来源的癌，例如可举出乳腺癌(例如浸润性乳腺导管癌、乳腺导管内原位癌、炎症性乳腺癌等)、前列腺癌(例如激素依赖性前列腺癌、激素非依赖性前列腺癌等)、胰腺癌(例如胰腺管癌等)、胃癌(例如乳头状腺癌、粘液腺癌、腺鳞癌等)、肺癌(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤等)、结肠癌(例如胃肠道间质肿瘤等)、直肠癌(例如胃肠道间质肿瘤等)、结直肠癌(例如家族性结直肠癌、遗传性非息肉病性结直肠癌、胃肠道间质肿瘤等)、小肠癌(例如非霍奇金淋巴瘤、胃肠道间质肿瘤等)、食道癌、十二指肠癌、舌癌、咽癌(例如鼻咽癌、口咽癌、喉咽癌等)、头颈癌、唾液腺癌、脑肿瘤(例如松果体星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤等)、神经鞘瘤、肝癌(例如原发性肝癌、肝外胆管癌等)、肾癌(例如肾细胞癌、肾盂及输尿管移行上皮癌等)、胆囊癌、胆管癌、胰脏癌、肝癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌(例如上皮性卵巢癌、性腺外生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、低恶性卵巢癌等)、膀胱癌、尿道癌、皮肤癌(例如眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌等)、血管瘤、恶性淋巴瘤(例如网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病等)、黑色素瘤(恶性黑色素瘤)、甲状腺癌(例如甲状腺髓样癌等)、甲状旁腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨肿瘤(例如骨肉瘤、尤文肉瘤、子宫肉瘤、软组织肉瘤等)、转移性成神经管细胞瘤、血管纤维瘤、隆突性皮纤维肉瘤、网膜肉瘤、阴茎癌、睾丸肿瘤、小儿实体肿瘤(例如肾母细胞瘤、小儿肾肿瘤等)、卡波西氏肉瘤、AIDS引起的卡波西氏肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维性组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性骨髓增生性疾病、白血病(例如急性骨髄性白血病、急性淋巴细胞性白血病等)等，但并非限定于这些。
本实施方式的细胞结构体中的癌细胞的数量并无特别限定，出于使得更接近于生物体内的癌症微环境的理由，细胞结构体中的内皮细胞数与癌细胞数的比率([内皮细胞数]/[癌细胞数])优选超过0(大于0)且为1.5以下。另外，使用含有内皮细胞和成纤维细胞和癌细胞的细胞结构体时，细胞结构体中的成纤维细胞数与癌细胞数的比率([成纤维细胞数]/[癌细胞数])优选为0.6～100、更优选为50～100。
本实施方式的细胞结构体可以是癌细胞在结构体内部整体中散存的细胞结构体，还可以是癌细胞仅存在于特定细胞层的细胞结构体。本实施方式的细胞结构体中，当癌细胞仅存在于特定的细胞层时，含有该癌细胞的细胞层(癌细胞层)在细胞结构体中的位置并无特别限定。出于免疫细胞及/或抗癌药物的影响能够充分地到达的理由，细胞结构体中的癌细胞层的厚度方向上的位置优选处于该结构体的从顶面(上面)至厚度方向一半高度的范围内。特别是，在免疫细胞的存在下培养细胞结构体时，通过并非在细胞结构体的顶面、而是在细胞结构体的内部具备癌细胞层，可以将免疫细胞浸润、到达至细胞结构体中的癌细胞的能力也包括在内地对抗癌效果进行评价。此外，本说明书中，细胞结构体的厚度是指组织的自重方向上的长度。自重方向是指重力所施加的方向，也可以称为厚度方向。
本实施方式的细胞结构体还可以含有除癌细胞和间质细胞以外的细胞。作为其它细胞，可举出免疫细胞、神经细胞、肝细胞、胰脏细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、肺泡上皮细胞、脾细胞等。
本实施方式的细胞结构体的大小或形状并无特别限定。出于能够形成更接近于形成于生物体内组织的脉管的状态的脉管网结构、能够进行更高精度的评价的理由，该细胞结构体的厚度优选为5μm以上、更优选为10μm以上、进一步优选为50μm以上、更进一步优选为100μm以上。作为该细胞结构体的厚度，还优选为500μm以下、更优选为400μm以下、进一步优选为300μm以下。作为本实施方式的细胞结构体的细胞层的数量，优选为2～60层左右、更优选为5～60层左右、进一步优选为10～60层左右。
此外，构成细胞结构体的细胞层数通过将构成三维结构的细胞的总数除以每1层的细胞数(用于构成1层所需的细胞数)来测定。每1层的细胞数可以通过在构成细胞结构体时所使用的细胞培养容器中预先将细胞按照铺满的方式平面地进行培养来研究。具体地说，形成于某个细胞培养容器中的细胞结构体的细胞层数可以通过计测构成该细胞结构体的全部细胞数、然后除以该细胞培养容器的每1层的细胞数来算出。
一般来说，将本实施方式的细胞结构体构筑在细胞培养容器中。作为该细胞培养容器，只要是能够构筑细胞结构体且能够进行所构筑的细胞结构体的培养的容器，则无特别限定。作为该细胞培养容器，具体地可举出盘子、细胞培养池(例如Transwell(注册商标)小室、Netwell(注册商标)小室、Falcon(注册商标)细胞培养池、Millicell(注册商标)细胞培养池等)、管、烧瓶、瓶、板等。就本实施方式的细胞结构体的构筑而言，出于能够更为恰当地进行使用了该细胞结构体的评价的理由，优选盘子或各种细胞培养池。
本实施方式的细胞结构体只要是由含有癌细胞和间质细胞的多层的细胞层所形成的结构体即可，细胞结构体的构筑方法并无特别限定。例如可以是每一层地进行构筑、然后依次地层叠地进行构筑的方法，还可以是一次性地构筑2层以上的细胞层的方法，还可以是适当组合两构筑方法来构筑多层的细胞层的方法。另外，本实施方式的细胞结构体可以是构成各细胞层的细胞种类各层不同的多层结构体，还可以构成各细胞层的细胞种类是在结构体的所有层中相同的细胞种类。例如可以是每个细胞种类地形成层、然后将各细胞种类的细胞层依次地层叠来进行构筑的方法，还可以是预先制备混合有多种细胞的细胞混合液、由预先制备的混合有多种细胞的细胞混合液一次性地构筑多层结构的细胞结构体的方法。
作为每一层地进行构筑、然后依次地层叠地进行构筑的方法，例如可举出日本专利第4919464号公报所记载的方法，即交替地反复进行以下工序、从而连续地层叠细胞层的方法：形成细胞层的工序；和使所形成的细胞层接触于含有ECM(细胞外间质)的成分的溶液的工序。例如在进行该方法时，预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物，通过利用该细胞混合物形成各细胞层，从而可以构筑在结构体整体中形成了脉管网结构、且癌细胞散存于结构体整体的细胞结构体。另外，通过各细胞种类地形成各细胞层，可以构筑仅在由内皮细胞形成的层中形成了脉管网结构、癌细胞仅存在于特定的细胞层的细胞结构体。
作为一次性地构筑2层以上的细胞层的方法，例如可举出日本专利第5850419号公报所记载的方法。该方法是如下的方法：预先利用含有整联蛋白所键合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的高分子以及与含有所述RGD序列的高分子发生相互作用的高分子将细胞的表面整体覆盖，在将被该粘接膜覆盖了的覆盖细胞收容在细胞培养容器中之后，通过离心处理等使覆盖细胞彼此聚集，从而构筑由多层细胞层形成的细胞结构体。例如在进行该方法时，使用通过预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物、在该细胞混合物中添加粘接性成分而制备的覆盖细胞。由此，通过1次的离心处理，可以构筑癌细胞散存于结构体整体的细胞结构体。另外，例如分别单独地制备覆盖了内皮细胞的覆盖细胞、覆盖了成纤维细胞的覆盖细胞、覆盖了从癌症患者采集的细胞群的覆盖细胞，在形成由成纤维细胞的覆盖细胞构成的多层之后，在其上层叠由内皮细胞的覆盖细胞形成的一层，进而在其上层叠由成纤维细胞的覆盖细胞形成的多层，进而在其上层叠由含有癌细胞的细胞的覆盖细胞形成的一层。由此，可以构筑具备被具有厚度的成纤维细胞层夹持的脉管网结构、且顶面具备含有从患者采集的癌细胞的层的细胞结构体。
本实施方式的细胞结构体还可以通过具有下述(a)～(c)的工序的方法进行构筑。
(a)在阳离子性缓冲液中混合细胞和细胞外间质成分从而获得混合物的工序；(b)将通过所述工序(a)获得的混合物接种于细胞培养容器中的工序；以及(c)在所述工序(b)之后获得在所述细胞培养容器中多层地层叠细胞而成的细胞结构体的工序。
工序(a)中，将细胞与含有阳离子性物质的缓冲液(阳离子性缓冲液)及细胞外间质成分混合，由该细胞混合物形成细胞集合体，从而可以获得内部少有较大空隙的立体细胞组织。另外，所得的立体细胞组织由于较为稳定，因此至少能够培养数日，且在培养基更换时、组织难以破坏。另外，本实施方式中，工序(b)中可以包含使接种于细胞培养容器内的细胞混合物在该细胞培养容器内沉降的步骤。细胞混合物的沉降可以通过离心分离等积极地使细胞沉降，也可使其自然沉降。
工序(a)中，优选将细胞进一步与强电解质高分子混合。通过将细胞与阳离子性物质、强电解质高分子及细胞外间质成分混合，无需在工序(b)中进行离心分离等使细胞积极地集合的处理，即便是在使其自然沉降时，也可获得空隙少且具有厚度的立体细胞组织。
作为所述阳离子性缓冲液，例如可举出Tris-盐酸缓冲液、Tris-马来酸缓冲液、Bis-Tris缓冲液或HEPES等。该阳离子性缓冲液中的阳离子性物质(例如Tris-盐酸缓冲液中的Tris)的浓度及pH只要是不会对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定。例如，阳离子性缓冲液中的阳离子性物质的浓度可以为10～100mM、优选为40～70mM、更优选为50mM。另外，该阳离子性缓冲液的pH可以为6.0～8.0、优选为6.8～7.8、更优选为7.2～7.6。
作为上述强电解质高分子，例如可举出肝素或者硫酸软骨素(例如软骨素4-硫酸、软骨素6-硫酸)、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸等粘多糖；硫酸葡聚糖或硫酸鼠李糖、岩藻多糖、卡拉胶、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸及聚丙烯酸、或它们的衍生物等，但并非限定于这些。可以在工序(a)中制备的混合物中仅混合1种强电解质高分子、还可以组合2种以上进行混合。本实施方式的细胞结构体的构筑中，优选强电解质高分子为粘多糖。另外，更优选使用肝素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素及硫酸皮肤素中的至少1个。本实施方式中使用的强电解质高分子进一步优选是肝素。混合在所述阳离子性缓冲液中的强电解质高分子的量只要不会对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定。
例如阳离子性缓冲液中的强电解质高分子的浓度可以是超过0mg/mL(高于0mg/mL)且低于1.0mg/mL，优选是0.025～0.1mg/mL，更优选是0.05～0.1mg/mL。另外，本实施方式中，也可以在不混合所述强电解质高分子的情况下制备所述混合物来进行细胞结构体的构筑。
作为所述细胞外间质成分，例如可举出胶原、层粘蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白、腱生蛋白、巢蛋白、原纤蛋白、蛋白聚糖或它们的改性体或变异体等。蛋白聚糖可举出硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖等。工序(a)中制备的混合物中可以仅混合1种细胞外间质成分，还可以组合2种以上进行混合。本实施方式的细胞结构体的构筑中，优选使用胶原、层粘蛋白、纤连蛋白，更优选使用胶原。只要不会对细胞的生长及细胞结构体的形成造成不良影响，则也可以使用上述细胞外间质成分的改性体及变异体。混合在所述阳离子性缓冲液中的细胞外间质成分的量只要是不会对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定。例如阳离子性缓冲液中的细胞外间质成分的浓度可以为超过0mg/mL(高于0mg/mL)且低于1.0mg/mL、优选为0.025～0.1mg/mL、更优选为0.05～0.1mg/mL。
混合在所述阳离子性缓冲液中的强电解质高分子与细胞外间质成分的配比为1：2～2：1。本实施方式的细胞结构体的构筑中，强电解质高分子与细胞外间质成分的配比优选为1：1.5～1.5：1、更优选为1：1。
通过反复进行工序(a)～(c)，具体地说反复地进行在工序(c)中获得的细胞结构体上、作为工序(b)接种工序(a)中制备的混合物之后再进行工序(c)，可以构筑足够厚度的细胞结构体。在工序(c)中获得的细胞结构体上新接种的混合物的细胞组成可以与构成已经构筑的细胞结构体的细胞组成相同，也可不同。
例如，首先在工序(a)中制备作为细胞仅含有成纤维细胞的混合物，然后进行工序(b)及(c)，在细胞培养容器中获得由10层的成纤维细胞层形成的细胞结构体。接着，作为工序(a)，制备作为细胞仅含血管内皮细胞的混合物，然后进行工序(b)及(c)，在细胞培养容器内的成纤维细胞层上层叠1层的血管内皮细胞层。然后，作为工序(a)，制备作为细胞仅含成纤维细胞的混合物，然后进行工序(b)及(c)，在细胞培养容器内的血管内皮细胞层上层叠10层的成纤维细胞层。然后，作为工序(a)，制备含有从癌症患者采集的癌细胞的混合物，然后进行工序(b)及(c)，在细胞培养容器内的成纤维细胞层上层叠1层的癌细胞层。由此，可以构筑成纤维细胞层10层-血管内皮细胞层1层-成纤维细胞层10层-癌细胞层1层按每个细胞种类地依次层叠为层状的细胞结构体。通过调节工序(b)中接种的细胞数，可以调整工序(c)中所层叠的细胞层的厚度。工序(b)中接种的细胞数越多，则工序(c)中层叠的细胞层的数量越多。另外，通过在工序(a)中制备将成纤维细胞层20层份的成纤维细胞和血管内皮细胞层1层份的血管内皮细胞全部混合而成的混合物，然后进行工序(b)及(c)，在所形成的多层的结构体上层叠同样制备的含有从癌症患者采集的癌细胞的混合物，从而可以构筑具有21层份的厚度、在血管网结构散存于结构体内部的结构体上层叠有癌细胞层的细胞结构体。进而，通过在工序(a)中制备将成纤维细胞层20层份的成纤维细胞和血管内皮细胞层1层份的血管内皮细胞和癌细胞层1层份的癌症患者来源细胞全部混合的混合物，然后进行工序(b)及(c)，从而可以构筑具有22层份的厚度、癌细胞和血管网结构这两者分别独立地散存于结构体内部的细胞结构体。
反复进行工序(a)～(c)时，还可以在工序(c)之后、工序(b)之前、对所得细胞结构体进行培养。培养中使用的培养基的组成、培养温度、培养时间、培养时的大气组成等培养条件以适于构成该细胞结构体的细胞的培养的条件进行。作为培养基，例如可举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。
在工序(a)后，还可以进行(a’-1)将液体部分从所得的混合物中除去、获得细胞集合体的工序，以及(a’-2)将细胞集合体悬浮在溶液中的工序，然后进入到工序(b)。通过实施上述工序(a)～(c)，可以获得所希望的组织体，但也可以在工序(a)之后实施(a’-1)及(a’-2)，然后实施工序(b)，由此可以获得更为均质的组织体。
另外，工序(a)之后，还可代替所述工序(b)进行下述工序(b’-1)及(b’-2)。通过进行工序(b’-1)及工序(b’-2)，也可获得更为均质的组织体。工序(b’-2)中，与工序(b)同样，可以包含使接种于细胞培养容器内的细胞混合物在该细胞培养容器内沉降的步骤。细胞混合物的沉降可以通过离心分离等积极地使细胞沉降，也可使其自然沉降。本实施方式及本申请说明书中，“细胞粘稠体”是指非专利文献4所记载的凝胶样的细胞集合体。
(b’-1)将工序(a)中获得的混合物接种于细胞培养容器内之后，将液体成分从混合物中除去，获得细胞粘稠体的工序；
(b’-2)在细胞培养容器内将细胞粘稠体悬浮在溶剂中的工序。
作为用于制备细胞悬浮液的溶剂，只要是对细胞没有毒性、不损害增殖性或功能的溶剂，则无特别限定，可以使用水、缓冲液、细胞的培养基等。作为该缓冲液，例如可举出磷酸生理盐水(PBS)、HEPES、Hank缓冲液等。作为培养基，可举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。作为用于制备细胞悬浮液的溶剂，在使用细胞的培养基时，在后述的工序(c)中，可以在不除去液体成分的情况下培养细胞。
还可以代替所述工序(c)进行下述工序(c’)。
(c’)：在基材上形成细胞的层的工序。
工序(c)及工序(c’)中，还可以将液体成分从所接种的混合物中除去。工序(c)及工序(c’)中的液体成分的除去处理的方法只要是不会对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定，作为将液体成分从液体成分和固体成分的悬浮物中除去的方法，可以利用本领域技术人员公知的手法适当进行。作为该手法，例如可举出抽吸、离心分离处理、磁性分离处理或过滤处理等。例如作为细胞培养容器使用细胞培养池时，通过将接种有混合物的细胞培养池供至以10℃、400×g下1分钟的离心分离处理，由于细胞混合物发生沉降，因此可以通过抽吸将液体成分除去。
<抗癌药物>
本实施方式的评价方法中使用的抗癌药物只要是用于癌症治疗的药物即可，不仅包含如具有细胞毒性的药物那样直接作用于癌细胞的药物，还包含虽然没有细胞毒性但抑制癌细胞的增殖等的药物。作为没有细胞毒性的抗癌药物，可以举出不会直接地攻击癌细胞、通过与生物体内的免疫细胞或其它药物的协同作用来发挥抑制癌细胞的增殖、或钝化癌细胞的活动、或杀死癌细胞的功能的药物，通过阻碍癌细胞以外的细胞或组织来抑制癌细胞的增殖的药物。本实施方式中使用的抗癌药物可以是已知具有抗癌作用的药物，还可以是新型抗癌药物的候补化合物。
作为具有细胞毒性的抗癌药物，并无特别限定，例如可举出分子靶向药物、烷化剂、以5-FU系抗癌药物为代表的代谢拮抗剂、植物生物碱、抗癌性抗生素、铂衍生物、激素类、拓朴异构酶抑制剂、微管抑制剂、被分类为生物应答调节剂的化合物等。
作为没有细胞毒性的抗癌药物，并无特别限定，例如可举出脉管新生抑制剂、抗癌药物的前体药物、调节与抗癌药物或其前体药物的代谢有关的细胞内代谢酶活性的药物(以下在说明书中称作“胞内酶调节剂”)、免疫疗法药物等。除此以外还可举出通过提高抗癌药物的功能或提高生物体内的免疫功能而最终参与到抗癌作用的药物。
脉管新生抑制剂只要是可期待具有脉管新生抑制活性的化合物即可，可以是已知的脉管新生抑制剂，还可以是新型脉管新生抑制剂的候补化合物。作为已知的脉管新生抑制剂，可举出Avastin、EYLEA、Suchibaga、CYRAMZA(注册商标)(Eli Lilly公司制、别名雷莫芦单抗)、BMS-275291(Bristol-Myers公司制)、Celecoxib(Pharmacia/Pfizer公司制)、EMD121974(Merck公司制)、Endostatin(EntreMed公司制)、Erbitaux(ImCloneSystems公司制)、Interferon-α(Roche公司制)、LY317615(Eli Lilly公司制)、Neovastat(AeternaLaboratories公司制)、PTK787(Abbott公司制)、SU6688(Sugen公司制)、Thalidomide(Celgene公司制)、VEGF-Trap(Regeneron公司制)、Iressa(注册商标)(Astrazeneca公司制、别名吉非替尼)、Caplerusa(注册商标)(Astrazeneca公司制、别名凡德他尼)、Recentin(注册商标)(Astrazeneca公司制、别名西地尼布)、VGX-100(Circadian Technologies公司制)、VD1andcVE199、VGX-300(Circadian Technologies公司制)、sVEGFR2、hF4-3C5、Nexavar(注册商标)(Bayer Yakuhin公司制、别名索拉非尼)、Vortrient(注册商标)(GlaxoSmithKline公司制、别名帕唑帕尼)、Sutent(注册商标)(Pfizer公司制、别名舒尼替尼)、Inlyta(注册商标)(Pfizer公司制、别名阿西替尼)、CEP-11981(Teva PharmaceuticalIndustries公司制)、AMG-386(Takeda Yakuhin公司制、别名Trebananib)、anti-NRP2B(Genentech公司制)、Ofev(注册商标)(boehringer-ingelheim公司制、别名尼达尼布)、AMG706(Takeda Yakuhin公司制、别名莫特塞尼)等。
抗癌药物的前体药物是通过肝脏等脏器或癌细胞的胞内酶而转换成具有抗癌作用的活性体的药物。通过细胞因子网络提高胞内酶的酶活性，活性体量增加、带来抗肿瘤效果的增强，因此可举出作为参与到抗癌作用的药物。
作为胞内酶调节剂，例如可举出虽然以单剂不会发挥直接的抗肿瘤效果，但通过阻碍5-FU系抗癌药物的分解酶(Dihydropyrimidine dehydrogenase：DPD，二氢嘧啶脱氢酶)而参与到抗癌作用的吉莫斯特等。
免疫疗法药物是通过免疫细胞的免疫功能或运动能力的活化等而提高免疫功能、从而获得抗癌效果的药物。作为免疫疗法药物，例如可举出在生物应答调节剂疗法中使用的药物(以下略记为“BRM制剂”)、由从免疫细胞分泌且参与游走或浸润的细胞因子形成的细胞因子系制剂、近年来备受关注的癌免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、癌症病毒等。作为BRM制剂，可举出云芝胞内多糖、香菇多糖、OK-432等。作为细胞因子系制剂，例如可举出IL-8、IL-2等白介素；IFN-α、IFN-β、IFN-γ等干扰素；CCL3、CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL16/CXCR6、CX3CL1/CX3CR1等趋化因子。
肿瘤免疫检查点抑制剂是对于存在于癌细胞或免疫细胞的表面、且参与到针对癌细胞的免疫功能降低的蛋白质、特异性地阻碍该蛋白质的功能的物质。作为该蛋白质，可举出PD-1、PD-L1、PD-L2、CD4、CD8、CD19、CD28、CD80/86、B7、Galectin-9、HVEM、CTLA-4、TIM-3、BTLA、MHC-II、LAG-3、TCR等。作为肿瘤免疫检查点抑制剂，优选针对这些蛋白质的特异性单克隆抗体药。具体地说，作为肿瘤免疫检查点抑制剂，可举出Nivolumab(Opdivo)、Pembrolizumab(Keytruda)、阿特朱单抗(Tecentriq)、Ipilimumab(Yervoy)、Tremelimumab、durvalmab、avelumab等。
本实施方式的评价方法中的在免疫细胞和抗癌药物的存在下对含有所述癌细胞的细胞结构体进行培养的方式中，作为所使用的抗癌药物，优选免疫疗法药物，其中出于考虑到有效性会受到免疫功能很大影响的理由，更优选癌症免疫检查点抑制剂。
本实施方式的评价方法中，可以使用1种抗癌药物，还可以组合使用2种以上的抗癌药物。另外，还可以将抗癌药物与抗癌药物以外的药物组合使用。例如，即便是单独给药时也发挥抗癌效果的抗癌药物，在实际的临床现场与其它药物并用给药时，本实施方式的评价方法也可以将该抗癌药物和该其它药物并用来进行。
<免疫细胞>
免疫细胞是指参与免疫的细胞。具体地说，可举出淋巴细胞、巨噬细胞、树状细胞等。淋巴细胞有T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞等。
本实施方式的评价方法中使用的免疫细胞可以是1种，还可以是2种以上。作为本实施方式中使用的免疫细胞，只要是免疫细胞则无特别限定，优选实际存在于癌症微环境周边、参与通过免疫反应攻击癌细胞的机制的细胞。具体地说，本实施方式中，作为免疫细胞，优选使用选自白细胞及淋巴细胞中的1种以上，更优选含有T细胞。
本实施方式的评价方法中，作为免疫细胞，可以使用PBMC(血浆中外周血单核细胞)。PBMC中包含淋巴细胞及单核细胞。单核细胞中包含巨噬细胞。淋巴细胞中包含NK细胞、B细胞、T细胞。除了PBMC以外，也可以单独使用或者组合多个使用这些成分。PBMC可以是由血液分离纯化者，还可以直接使用由血液制备的血沉棕黄层。血沉棕黄层中PBMC与其它成分一起被含有。从血液制备血沉棕黄层可以利用离心分离等常规方法进行制备。
免疫细胞中，如ABO血型那样，有时存在即便是相同成分但也具有些许不同性质的多个类型。本实施方式的评价方法中，可根据需要使用任何一种类型的免疫细胞，也可组合使用多种类型的免疫细胞。
免疫细胞可以是从生物体采集的免疫细胞，还可以是培养细胞株，还可以是在生物体外人工地进行了改造或修饰的细胞。使用从癌症患者采集的免疫细胞时，优选使用从癌症患者的外周血或肿瘤部分离出的免疫细胞、特别优选使用PBMC。另外，作为经人工地进行改造或修饰的免疫细胞，优选人工地改造免疫功能而提高了抗癌活性的免疫细胞。作为这种改造了免疫功能的免疫细胞，例如可举出使用了近年来受到关注的嵌合抗原受体(CAR)的基因改造T细胞疗法中使用的改造T细胞等。
<培养工序>
本实施方式的评价方法中，首先作为培养工序，在1种以上的免疫细胞及1种以上的抗癌药物这两者的存在下对含有癌细胞及间质细胞的细胞结构体进行培养。具体地说，在混合有免疫细胞及抗癌药物的培养基中培养细胞结构体。抗癌药物和免疫细胞可以同时添加至培养细胞结构体的培养基中，也可以分别单独地添加。分别添加两者时，优选在培养基中先添加免疫细胞后，再添加抗癌药物。
混合在培养基中的抗癌药物的量可以考虑构成细胞结构体的细胞的种类或数量、所含癌细胞的种类或量、培养基的种类、培养温度、培养时间、共存的免疫细胞的种类或量、免疫功能的强度等条件，利用实验方法决定。同样，混合在培养基中的免疫细胞的量也可以考虑构成细胞结构体的细胞的种类或数量、所含癌细胞的种类或量、培养基的种类、培养温度、培养时间、并用的抗癌药物的种类或量等，利用实验方法决定。特别是，由于免疫反应对抗癌效果有较强的影响，因此本实施方式的评价方法中使用免疫细胞时，至少在培养工序的开始时刻，免疫细胞的总细胞数优选为细胞结构体的总细胞数的0.05％以上、更优选为细胞结构体所含的癌细胞数以上。
在含有免疫细胞和抗癌药物的培养基中培养所述细胞结构体时的培养时间并无特别限定，例如可以为24～96小时、优选为48～96小时、更优选为48～72小时。另外，只要是在不会使培养环境发生显著变化的限度内，则也可以根据需要赋予回流等流体力学的施加。
<评价工序>
以所述培养工序后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标，评价抗癌药物和免疫细胞的并存下的抗癌效果。抗癌效果是指抑制癌细胞的增殖或杀死癌细胞的效果。
具体地说，当与在抗癌药物和免疫细胞的任一者均不存在的环境下进行培养的情况相比，所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数较少时，评价为所使用的免疫细胞和抗癌药物中的至少一者对于该细胞结构体所含的癌细胞具有抗癌效果。另外，当与仅在抗癌药物的存在下进行培养的情况或仅在免疫细胞的存在下进行培养的情况相比，所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数较少时，评价为所使用的抗癌药物与免疫细胞通过并用、相比较于分别单独使用时具有更高的抗癌效果。另一方面，当与在抗癌药物和免疫细胞的任一者均不存在的环境下进行培养的情况相比，癌细胞的活细胞数为同等程度或显著性地多时，评价为该免疫细胞和该抗癌药物对于该细胞结构体所含的癌细胞均没有抗癌效果。
癌细胞的活细胞数可以使用与癌细胞的活细胞或癌细胞的活细胞的存在量具有相关性的信号来进行评价。只要是能够测定评价时刻的癌细胞的活细胞数即可，并没有必要一定要在活着的状态下进行测定。例如，可以按照将癌细胞与其它细胞相区分的方式对它们进行标记，以来自该标记的信号作为指标来进行研究。例如对癌细胞进行荧光标记后，通过进行细胞的生死判定，可以直接计数细胞结构体中的活着的癌细胞。此时，还可以利用图像解析技术。细胞的生死判定可以通过台盼蓝染色或PI(Propidium Iodide，碘化丙啶)染色等公知的细胞的生死判定方法来进行。此外，癌细胞的荧光标记例如可以利用使用以针对特异性地在癌细胞的细胞表面表达的物质的抗体作为一抗、并使用与该一抗特异性地结合的荧光标记二抗的免疫染色法等公知的手法来进行。细胞的生死判定及活细胞数的测定可以以细胞结构体的状态进行、也可以以将细胞结构体破坏成单细胞水平的状态进行。例如在对标记了癌细胞和死细胞之后的细胞结构体的立体结构进行破坏之后，通过以标记为指标的FACS(fluorescence activated cell sorting，荧光激活细胞分选术)等，也可仅对在评价时刻活着的癌细胞进行直接计数。
以活着的状态对细胞结构体中的癌细胞进行标记，通过经时地检测来自该标记的信号，也可经时地测定该细胞结构体中的癌细胞的活细胞数。可在构筑细胞结构体之后对该细胞结构体中的癌细胞进行标记，也可在构筑细胞结构体之前预先对癌细胞进行标记。例如在使用含有含癌症患者来源的癌细胞的细胞群的细胞结构体时，也可在构筑细胞结构体之前预先对癌细胞进行标记。另外，还可以与癌细胞一起、将癌症患者来源的其它细胞同样地标记。另外，当使用恒定地表达荧光色素的癌细胞时，通过利用酶标仪等对将细胞结构体溶解所获得的溶胞产物的荧光强度进行测定，也可评价癌细胞的活细胞数。
本实施方式的评价方法由于使用具备接近于实际生物体内的癌细胞周边组织的结构的间质的细胞结构体，以在体外下模仿出更接近体内环境的状态进行评价，因此对于药效可以获得可靠性高的评价。通过本实施方式的评价方法评价为具有抗癌效果的抗癌药物即便是在实际中给药至癌症患者时，也可期待获得充分的抗癌效果。因此，本实施方式的评价方法在制药现场的抗癌药物候補化合物的筛选或药物重新定位筛选、临床现场的抗癌药物治疗法(单剂、并用)的选择和决定(抗癌药物敏感性试验)等中，可作为之前没有过的体外药物评价工具进行利用。特别是，使用含有从癌症患者采集的癌细胞的细胞结构体进行本实施方式的评价方法，由此被评价为具有抗癌效果的抗癌药物可以期待在实际给药至该癌症患者时发挥适当的抗癌效果。
<抗癌药物的评价用试剂盒>
通过使用将本实施方式的评价方法中所用的试剂等制成了试剂盒而得到的抗癌药物评价用试剂盒，可以更为简便地实施本实施方式的评价方法。例如至少含有间质细胞的细胞结构体和收容该细胞结构体的细胞培养容器可以构成试剂盒。作为该试剂盒所含的细胞结构体，也可以含有癌细胞，还可以不含癌细胞，而是使试剂盒中具备含有构成间质的细胞的细胞结构体，在实际中马上进行评价方法之前，在该细胞结构体的表面形成癌细胞层。另外，该试剂盒中还可以代替细胞结构体而具备构成细胞结构体的细胞中的除癌细胞以外的细胞。
该试剂盒还可进一步具备在该评价方法中使用的其它物质。作为该其它物质，例如可举出抗癌药物、细胞结构体的培养基、用于标记癌细胞的标记物质、细胞的生死判定用试剂、构筑细胞结构体时使用的物质(例如阳离子性缓冲液、强电解质高分子、细胞外间质成分等)等。
<癌症免疫疗法的有效性预测方法>
本实施方式的评价方法中，在免疫细胞和抗癌药物这两者的存在下进行所述细胞结构体培养的方式中，可以在模仿出了包括生物体内免疫体系的癌症微环境的环境下，将免疫细胞浸润、到达至细胞结构体中存在的癌细胞的能力也包括在内地对免疫细胞和抗癌药物产生的抗癌效果进行评价。因此，通过利用该评价方法，对于癌症免疫疗法的有效性，可以进行可靠性高的预测。
为了预测癌症免疫疗法的有效性，使用在上述本实施方式的细胞结构体中的在内部具备含有癌细胞的细胞层的细胞结构体。通过癌细胞存在于细胞结构体的内部，可以将免疫细胞浸润、到达至细胞结构体中存在的癌细胞的能力也包括在内地进行评价。作为在癌症免疫疗法的有效性预测中使用的细胞结构体，出于可进一步提高评价的重现性和可靠性的理由，优选使用癌细胞仅存在于结构体内部的特定细胞层的细胞结构体。另外，出于免疫细胞及/或抗癌药物的影响可以充分地到达的理由，细胞结构体中的癌细胞层的厚度方向上的位置优选处于该结构体的从顶面至下方的厚度方向的一半高度的范围内。
为了预测癌症免疫疗法的有效性，使用抗癌药物和免疫细胞这两者。为了预测有效性而添加至细胞结构体的培养基中的抗癌药物使用在癌症免疫疗法中使用的抗癌药物。作为该抗癌药物，优选免疫疗法药物，更优选癌症免疫检查点抑制剂。另外，所使用的抗癌药物可以是1种，也可以是2种以上。
为了预测癌症免疫疗法的有效性，使用从作为该癌症免疫疗法治疗对象的癌症患者中采集的细胞作为免疫细胞和癌细胞中的至少一种，优选免疫细胞和癌细胞这两者。作为从癌症患者采集的免疫细胞，优选使用从自癌症患者的生物体采集的体液(例如血液或淋巴液)或者从肿瘤部分离出的免疫细胞，更优选使用从自癌症患者的生物体采集的外周血或从肿瘤部分离出的免疫细胞，进一步优选使用从癌症患者外周血或从肿瘤部分离出的PBMC。通过使用从癌症患者采集的癌细胞和免疫细胞，可以构筑包括所述免疫细胞的类型在内更接近该癌症患者的生物体内环境的培养环境。进而，通过在接近于癌症患者的生物体内环境的培养环境下进行评价，对于对该癌症患者实际进行使用该抗癌药物的癌症免疫疗法时所获得的抗癌效果，可以更为恰当地进行评价。
为了预测癌症免疫疗法的有效性，除了使用内部具备包含癌细胞的细胞层的细胞结构体、使用在癌症免疫疗法中使用的抗癌药物、使用从作为癌症免疫疗法治疗对象的癌症患者中采集的细胞作为免疫细胞和癌细胞中的至少一种之外，可以与上述本实施方式的评价方法同样地进行。
具体地说，通过以下工序预测癌症免疫疗法的有效性：在免疫细胞及抗癌药物的存在下对内部具备含有癌细胞的细胞层的细胞结构体进行培养的培养工序；和以所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标，对使用所述癌细胞和所述免疫细胞中的至少一者进行的癌症免疫疗法的有效性进行预测的预测工序。在细胞结构体的培养基中的免疫细胞及抗癌药物的添加及其之后的培养、培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数的测定可以与所述本实施方式的评价方法同样地进行。
癌症免疫疗法的有效性预测通过将以培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数为指标获得的抗癌效果的高低与对照区的抗癌效果相比较来进行。作为对照区，可举出在抗癌药物和免疫细胞的任一者或两者的不存在下进行培养的试验区，或者使用了在使用所用抗癌药物的癌症免疫疗法中已经确认到可获得抗癌效果的癌细胞或免疫细胞的试验区。
在使用癌症患者来源的细胞作为癌细胞和免疫细胞这两者时，具体地可如下地进行有效性预测。当培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数比在抗癌药物和免疫细胞的任一者均不存在的环境下进行培养的情况少、并且比在仅抗癌药物的存在下进行培养的情况或在仅免疫细胞的存在下进行培养的情况少时，预测为通过对该癌症患者进行使用了该抗癌药物的癌症免疫疗法、可获得充分的治疗效果。当培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数与在抗癌药物和免疫细胞的任一者均不存在的环境下进行培养的情况相比为同等程度或显著性地多时，预测为即便对该癌症患者进行使用了该抗癌药物的癌症免疫疗法、也无法期待治疗效果。当培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数比在抗癌药物和免疫细胞的任一者均不存在的环境下进行培养的情况少，但与在仅抗癌药物的存在下进行培养的情况或在仅免疫细胞的存在下进行培养的情况相比为同等程度或显著性地多时，预测为即便对该癌症患者进行使用了该抗癌药物的癌症免疫疗法、也无法期待治疗效果。
另外，在仅免疫细胞使用癌症患者来源的细胞、并使用并非癌症患者来源的癌细胞时，具体地可如下地进行有效性预测。此外，作为癌症患者来源的细胞以外的癌细胞并无特别限定，优选是已经确认到通过所使用的抗癌药物可获得抗癌效果的癌细胞。当培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数比仅在抗癌药物的存在下进行培养的情况少时，预测为该癌症患者的免疫功能没有特别的问题、通过对该癌症患者进行使用了该抗癌药物的癌症免疫疗法、可获得充分的治疗效果。
另一方面，当培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数与仅在抗癌药物的存在下进行培养的情况相比为同等程度或显著性地多时，预测为该癌症患者的免疫功能弱、即便对该癌症患者进行使用了该抗癌药物的癌症免疫疗法也无法期待治疗效果。
另外，在仅癌细胞使用癌症患者来源的细胞、并使用并非癌症患者来源的免疫细胞时，具体地可如下地进行有效性预测。此外，作为并非癌症患者来源的免疫细胞并无特别限定，优选是在添加至所使用的细胞结构体的培养基中时进行培养的情况已经确认到了单独即有抗癌效果的免疫细胞。当培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数比仅在免疫细胞的存在下进行培养的情况少时，预测为由于该癌症患者的癌细胞通过该抗癌药物可获得充分的抗癌效果、因此通过对该癌症患者进行使用了该抗癌药物的癌症免疫疗法可获得充分的治疗效果。另一方面，当培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数与仅在免疫细胞的存在下进行培养的情况相比为同等程度或显著性地多时，预测为该抗癌药物对该癌症患者的癌细胞无效、即便是对该癌症患者进行使用了该抗癌药物的癌症免疫疗法也无法期待治疗效果。
在预测癌症免疫疗法的有效性时，还优选使用细胞结构体中的癌细胞层的厚度方向上的位置不同的2种以上的细胞结构体、分别单独地在所述免疫细胞及所述抗癌药物的存在下进行培养。为了癌症免疫疗法有效，在癌细胞的附近存在免疫细胞、特别是T细胞是重要的(参照非专利文献3)，免疫细胞浸润周围的间质并到达癌细胞的能力的强弱对癌症免疫疗法的有效性有很大影响。通过使用癌细胞层的厚度方向上的位置不同的2种以上的细胞结构体，对各自的培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数进行比较，可以更为适当地判断免疫细胞对癌细胞的浸润、到达能力来预测癌症免疫疗法的有效性。此外，还优选使用在顶面具备癌细胞层的细胞结构体同样地进行培养，将培养后的细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为判断免疫细胞对癌细胞的浸润、到达能力时的对照。
<癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒>
预测利用了本实施方式评价方法的癌症免疫疗法的有效性的方法可以通过使用将该预测方法中所用的试剂等制成了试剂盒的癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒来更为简便地实施。
该试剂盒中例如可以具备构成细胞结构体的间质细胞、构筑细胞结构体时使用的物质(例如阳离子性缓冲液、强电解质高分子、细胞外间质成分等)、构筑细胞结构体时使用的细胞培养容器。该细胞培养容器也可作为构筑后的细胞结构体的培养容器进行使用。该试剂盒除此以外还可以具备癌细胞、免疫细胞、抗癌药物、细胞结构体的培养基、用于标记癌细胞的标记物质、细胞的生死判定用试剂等。
作为使用患者来源的免疫细胞、用于预测癌症免疫疗法的有效性的试剂盒，优选具备细胞结构体中含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置互不相同的2种以上的细胞结构体和分别单独地收容所述细胞结构体的细胞培养容器的试剂盒。这些细胞结构体优选细胞结构体中含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置位于从顶面至厚度方向一半高度的范围内。
实施例
以下示出实施例具体地说明本实施方式，但本实施方式并非限定于下述实施例。此外，以下的实施例中，只要无特别说明，则作为胶原使用胶原I。
[实施例1]
使用由成纤维细胞和血管内皮细胞和癌细胞形成、具备血管网结构的细胞结构体，评价健康人来源的免疫细胞及抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在由人新生儿来源皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制、产品编号：CC-2509)、人脐带静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell：HUVEC)(Lonza公司制、产品编号：CC-2517A)这2种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠由人结直肠腺癌细胞株HCT116(ATCC编号：CCL-247)所形成的癌细胞层而成的细胞结构体。另外，作为细胞培养容器，使用Transwell细胞培养池(Corning公司制、产品编号：#3470)，作为培养基，使用含有10容量％牛血清(Corning公司制、产品编号：#35-010-CV)及1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制、产品编号：168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制、产品编号：043-30085)。成为评价对象的健康人来源的免疫细胞使用外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell：PBMC)(CTL公司制、产品编号：CTL-CP1)，抗癌药物使用纳武单抗(R&D Systems公司制、产品编号：MAB10861)。
<细胞结构体的构筑>
首先，将NHDF(2×106个)和HUVEC(3×104个)悬浮在含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温下以400×g离心处理1分钟，将上清去除后，利用适量的培养基再次悬浮(工序(a’-1)、(a’-2))。接着，将该细胞悬浮液接种在Transwell细胞培养池内之后，对该Transwell细胞培养池在室温下以400×g离心处理1分钟(工序(b))。之后，在该Transwell细胞培养池中追加适量的培养基后，在CO2孵育箱(37℃、5％CO2)中培养24小时(工序(c))。
在形成有结构体的Transwell细胞培养池内接种在适量的培养基中悬浮得到的2×104个癌细胞后，在CO2孵育箱(37℃、5％CO2)中培养96小时。培养结束后，获得在具备血管网结构的层上层叠有癌细胞层的细胞结构体。癌细胞使用预先进行了荧光标记(SIGMA公司制、产品编号：PKH26GL)的细胞。
<在PBMC及纳武单抗存在下的培养>
将所得的细胞结构体在Transwell细胞培养池的每1孔的PBMC接种量为0或2×105个、纳武单抗添加量为0或2μg的培养基中、在37℃、5％CO2下培养72小时。作为对照，除了不添加PBMC及纳武单抗以外同样地进行培养(药物不存在下的培养)。
另外，为了比较，代替所述细胞结构体，将对癌细胞按照在一般的培养容器中成为单层的方式进行培养而得到的细胞(2D法)和进行球体培养而获得的球体(球体法)也同样地操作，在PBMC及纳武单抗存在下进行培养。
<细胞结构体的分散>
接着，将培养后的细胞结构体分散成细胞水平。具体地说，在该Transwell细胞培养池中适量添加Tris缓冲溶液(50mM，pH为7.4)，之后将液体成分除去。反复实施3次该一系列工序。接着，在该Transwell细胞培养池中添加0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen公司制)300μL，在CO2孵育箱(37℃，5％CO2)中孵育15分钟。之后，将溶液总量回收，移至预先添加有300μL的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen公司制)的回收用1.5mL收集管中。接着，在该Transwell细胞培养池中添加0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen公司制)100μL，与回收用1.5mL收集管一起在CO2孵育箱(37℃，5％CO2)中孵育5分钟。之后，将溶液总量回收，移至回收用1.5mL收集管，进而添加0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen公司制)300μL，在CO2孵育箱(37℃，5％CO2)中孵育5分钟，获得细胞结构体分散液。
<活细胞数解析及评价>
将所得细胞结构体分散液浸渍在台盼蓝溶液中进行台盼蓝染色后，将发出荧光且被台盼蓝染色的细胞作为活着的癌细胞进行计数。细胞的计数使用细胞计数器“CountessII”(Life Technologies公司制)的荧光模式进行。
另外，对于2D培养物、球体也同样地制备细胞结构体分散液并进行台盼蓝染色后，作为活着的癌细胞进行计数。对于各培养条件，反复各测定3次。
对于各培养物，根据下述式算出CNT(残留活细胞率)(％)，将其作为评价值。
CNT(％)＝[癌细胞的活细胞数]/[药物不存在下的培养中的癌细胞的活细胞数]×100
将各培养物的算出的CNT结果与构成的细胞数量一起示于表1。表中“2D”一栏表示2D培养物的结果、“Spheroid”一栏表示球体的结果、“3D”一栏表示所构筑的具备血管网结构的细胞结构体的结果。
表1
其结果为，单独给药纳武单抗的情况时，2D培养物和球体和细胞结构体的任一者的CNT均基本为100％，没有抗癌效果。即便是仅接种了PBMC者，2D培养物和球体和细胞结构体的任一者的CNT均为78％左右，获得了同等程度的抗癌效果。并用给药了PBMC和纳武单抗者中，2D培养物和球体的CNT为78％左右，与仅接种了PBMC时的抗癌效果为同等程度。另而在具备血管网结构的细胞结构体中，并用给药PBMC和纳武单抗时，CNT为55％左右，与仅接种了PBMC时相比，CNT显著性地小，观察到了抗癌效果。
非专利文献5中报告了，PDX动物模型中单独给药纳武单抗(抗PD-1抗体)时没有抗癌效果，并用给药PBMC和纳武单抗时比单独给药PBMC时更有效果。另外，非专利文献6中报告了，在与这次使用的大肠癌细胞株同样具有微卫星不稳定性的性质的病例中，通过给药纳武单抗，患者的无复发生存期与总生存期的中位数延长。
如表1所示获得了以下结果：使用具备血管网结构的细胞结构体时，与非专利文献6的动物模型同样地单独给药纳武单抗时没有效果，并用给药PBMC和纳武单抗时比单独给药PBMC更有效果。另外，与非专利文献5的人同样，在免疫细胞(PBMC)存在下观察到了纳武单抗产生的抗癌效果。即教示了通过本实施方式的评价方法能够预测动物模型的结果或人临床结果的可能性。
[实施例2]
使用与纳武单抗作用机制有关的PD-L1蛋白的表达量不同的2种癌细胞，与实施例1同样地评价健康人来源的免疫细胞及抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在实施例1中使用的由NHDF和HUVEC的2种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠由PD-L1蛋白表达量多的人非小细胞性肺腺癌细胞株NCI-H1975(ATCC编号：CRL-5908)或PD-L1蛋白的表达量少的人肺泡基底上皮腺癌细胞株A549(ATCC编号：CCL-185)形成的癌细胞层而成的细胞结构体。
另外，细胞培养容器、培养基、PBMC及纳武单抗使用与实施例1中所用相同者。
<NCI-H1975和A549中的PD-L1蛋白表达量的确认试验>
此外，对本实施例中使用的NCI-H1975和A549进行PD-L1蛋白表达量的检测。
图1是表示作为实施例2中的确认试验、通过利用Western blotting法的凝胶电泳对PD-L1蛋白表达量多的人非小细胞性肺腺癌细胞株NCI-H1975与PD-L1蛋白表达量少的人肺泡基底上皮腺癌细胞株A549中的PD-L1表达量进行比较的结果的图。
测定PD-L1表达量时的Western blotting法的顺序如下进行。
<Western blotting法>
利用Western blotting法进行的NCI-H1975与A549的PD-L1检测中使用抗PD-L1抗体(CST公司制、E1L3N(注册商标))。
培养NCI-H1975和A549之后，利用溶解缓冲液将细胞溶解而制成细胞提取液。使用所得细胞提取液实施电泳(SDS-PAGE)，根据大小将提取液中所含的蛋白质分离后，利用转印至PVDF膜的Western blotting法检测PD-L1。
此外，图1所示的β-肌动蛋白为内源性对照(内部标准)。
<利用Western blotting法获得的PD-L1测定结果>
如图1所示确认到，由本实施例中使用的NCI-H1975检测到了PD-L1的条带，但A549中未检测到。
即，通过利用Western blotting法的试验确认了本实施例中使用的NCI-H1975的PD-L1蛋白表达量高、以及本实施例中使用的A549的PD-L1蛋白表达量低。
<使用了NCI-H1975和A549的健康人来源免疫细胞及抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)的效果的评价试验>
接着，与实施例1同样地操作，构筑顶面具备癌细胞层且具备血管网结构的细胞结构体，在PBMC及纳武单抗存在下进行培养。接着，与实施例1同样地操作，计数培养后的细胞结构体的活着的癌细胞，算出CNT(％)。对于各培养条件，反复各测定3次。将结果示于表2。
表2
其结果为，PD-L1蛋白表达量多的NCI-H1975中，仅接种了PBMC者的CNT为70％左右、而并用给药PBMC和纳武单抗者的CNT为33％左右。即，NCI-H1975中，并用给药PBMC和纳武单抗时，与仅给药PBMC时相比，CNT显著性地小，观察到了更高的抗癌效果。另一方面，PD-L1蛋白表达量少的A549中，仅接种PBMC时及并用给药PBMC和纳武单抗时的CNT为基本同等程度的55％左右，未观察到纳武单抗产生的抗癌效果。关于纳武单抗已知：从纳武单抗的作用机制来说，对于PD-L1蛋白高表达的癌细胞可获得抗癌效果，但对于PD-L1蛋白不表达的癌细胞则没有抗癌效果。本实施例的结果与该纳武单抗的抗癌效果的见解是一致的，教示了：通过本实施方式的评价方法，能够进行准确地反映了抗癌药物的作用机制的评价。
[实施例3]
使用由成纤维细胞和血管内皮细胞和癌细胞形成、具备血管网结构的细胞结构体，改变添加在该细胞结构体中的健康人来源免疫细胞的量来评价健康人来源免疫细胞的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用与实施例2所用细胞结构体相同者，即，使用在由NHDF和HUVEC的2种细胞形成的多层结构体的顶面层叠由预先进行了荧光标记的NCI-H1975形成的癌细胞层而成的细胞结构体。
另外，细胞培养容器、培养基、PBMC及纳武单抗使用与实施例1中所用相同者。
与实施例1同样地操作，构筑顶面具备癌细胞层且具备血管网结构的细胞结构体，在表3记载的细胞数量的PBMC及纳武单抗存在下进行培养。接着，与实施例1同样地计数培养后的细胞结构体的活着的癌细胞，算出CNT(％)。对于各培养条件，反复各测定3次。将结果示于表3。
表3
其结果为，仅接种PBMC时及并用给药PBMC和纳武单抗时的任一种情况下，CNT均是与PBMC量依赖性地减小。由这些结果教示了，PBMC单独使用的抗癌效果及并用PBMC和肿瘤免疫检查点抑制剂产生的抗癌效果均可以通过使用具备血管网结构的细胞结构体以充分的精度进行评价。
[实施例4]
使用结构体中仅由癌细胞形成的细胞层的位置不同的各种细胞结构体来评价健康人来源免疫细胞及抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)的效果。
<健康人来源免疫细胞及抗癌药物的效果评价用的细胞结构体(4种)的构筑>
作为健康人来源免疫细胞及抗癌药物的效果评价中使用的含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用按照由实施例1所用的NHDF和HUVEC的2种细胞形成的多层结构体(20层)的顶面、自顶面起第2层、自顶面起第5层、自顶面起第10层为由癌细胞形成的细胞层的方式所构筑的4种细胞结构体。
作为癌细胞，使用人非小细胞性肺腺癌细胞株NCI-H1975(ATCC编号：CRL-5908)。另外，细胞培养容器、培养基、PBMC及纳武单抗使用实施例1中所用相同者。
<癌细胞层位于细胞结构体顶面时的结构体的构筑>
与实施例1同样地操作，构筑顶面具备癌细胞层且具备血管网结构的细胞结构体。
<癌细胞层位于细胞结构体的顶面以外时的结构体的构筑>
首先，将所需层数份的NHDF和HUVEC悬浮在含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液。将该细胞悬浮液在室温下以400×g离心处理1分钟，将上清除去后，利用适量的培养基再次悬浮。
接着，将该细胞悬浮液接种在Transwell细胞培养池内之后，将该Transwell细胞培养池在室温下以400×g离心处理1分钟。之后，在该Transwell细胞培养池中追加适量的培养基，然后在CO2孵育箱(37℃、5％CO2)中培养24小时。
在形成了结构体的Transwell细胞培养池内接种悬浮在适量培养基中的2×105个癌细胞之后，在CO2孵育箱(37℃、5％CO2)中培养1小时。癌细胞使用预先进行了荧光标记(SIGMA公司制、产品编号：PKH26GL)的细胞。
进而，将所需层数份的NHDF和HUVEC悬浮在含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.1mg/mL肝素、0.1mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液。将该细胞悬浮液在室温下以400×g离心处理1分钟，将上清除去后，利用适量的培养基再次悬浮。接着，将该细胞悬浮液接种在形成有含有癌细胞层的结构体的Transwell细胞培养池内之后，将该Transwell细胞培养池在室温下以400×g离心处理1分钟。之后，在该Transwell细胞培养池中追加适量的培养基，之后在CO2孵育箱(37℃、5％CO2)中培养96小时。培养结束后，获得在顶面以外含有癌细胞层的细胞结构体。
<细胞结构体(3种)中癌细胞层形成的确认试验>
利用本实施例的方法，进行是否在细胞结构体中想要的位置上形成了癌细胞层的确认试验。
此外，在确认试验中，通过本实施例所示的方法，制备了在层数为20层的细胞结构体中、(1)按照顶面(20层)具有癌细胞层的方式构筑的细胞结构体、(2)按照在自顶面起第10层具有癌细胞层的方式构筑的细胞结构体、及(3)按照在自顶面起第20层具有癌细胞层的方式构筑的细胞结构体(细胞结构体的第一层)。
作为癌细胞层形成的确认试验，对于各种细胞结构体的切片，通过苏木精染色对NHDF、HUVEC、癌细胞的全部核进行染色，通过免疫染色法对癌细胞中大量表达的CK7进行染色，利用公知的方法进行拍摄。CK7检测中使用抗CK7抗体(abcam公司、克隆：EPR17078)。
图2表示作为实施例4中的确认试验，(a)是癌细胞层形成于顶面时的细胞结构体的截面照片、(b)是癌细胞层形成于自顶面起第10层时的细胞结构体的截面照片、(c)是癌细胞层形成于自顶面起第20层时的细胞结构体的截面照片。
图2(a)～(c)中，箭头所示之处为利用免疫染色法确认到了癌细胞的位置。
图2(a)中如箭头所示，在细胞结构体的切片的顶面确认到癌细胞来源的CK7染色。
另外，图2(b)中如箭头所示，在细胞结构体的切片的自顶面起第10层附近(细胞结构体的厚度方向上的中央附近)确认到癌细胞来源的CK7染色。
进而，图2(c)中如箭头所示，在细胞结构体的自顶面起第20层附近确认到癌细胞来源的CK7染色。
如图2(a)～(c)所示的切片图像所示，根据本实施例的手法，确认到了在细胞结构体中的想要的位置上形成了癌细胞层。
<PBMC及纳武单抗存在下的培养、以及活细胞数解析及评价>
将上述<健康人来源免疫细胞及抗癌药物的效果评价用的细胞结构体(4种)的构筑＞中所得的4种细胞结构体(顶面、自顶面起第2层、自顶面起第5层、自顶面起第10层)分别在PBMC及纳武单抗存在下进行培养。
接着，与实施例1同样地操作，计数培养后的细胞结构体的活着的癌细胞，算出CNT(％)。对于各培养条件，反复各测定3次。将结果示于表4中。
表4
其结果为，在癌细胞层位于结构体顶面的细胞结构体中，仅接种PBMC者的CNT为75％左右，并用给药了PBMC和纳武单抗者的CNT为46％左右。即，并用给药了PBMC和纳武单抗时，与仅接种PBMC时相比，CNT小了31.6％，观察到了纳武单抗产生的抗癌效果。在癌细胞层的位置位于结构体的自顶面起2层份的底面侧的细胞结构体中，仅接种PBMC者的CNT为85％左右，并用给药了PBMC和纳武单抗者的CNT为50％左右。即，并用给药了PBMC和纳武单抗时，与仅接种PBMC时相比，CNT小了32.5％，观察到了纳武单抗产生的抗癌效果。在癌细胞的位置位于结构体的自顶面起5层份的底面侧的细胞结构体中，仅接种PBMC者的CNT为90％左右，并用给药了PBMC和纳武单抗者的CNT为62.3％左右。即，并用给药了PBMC和纳武单抗时，与仅接种PBMC时相比，CNT小了28.4％，观察到了纳武单抗产生的抗癌效果。在癌细胞的位置位于结构体的自顶面起10层份的底面侧(结构体的厚度方向上的大概一半高度的位置)的细胞结构体中，仅接种PBMC者的CNT为90％左右，并用给药了PBMC和纳武单抗者的CNT为80％左右。即，并用给药了PBMC和纳武单抗时，与仅接种PBMC时相比，CNT小了11.2％，观察到了纳武单抗产生的抗癌效果。观察到以下倾向：随着细胞结构体的厚度方向上的癌细胞层的位置自结构体的顶面起越向深(远)的位置，PBMC单独给药时以及与纳武单抗并用给药时的任一种情况下的抗癌效果均越降低。由这些结果教示了，本实施方式的评价方法中，通过使用细胞结构体的厚度方向上的癌细胞层的位置不同的细胞结构体，具有能够将PBMC向多细胞层中的癌细胞层的到达能力也包括在内地对抗癌效果进行预测的可能性。
[实施例5]
作为癌细胞，使用PD-L1蛋白表达量多的NCI-H1975(与实施例2～4中使用者相同的NCI-H1975)，作为抗癌药物，代替纳武单抗而使用作为抗PD-L1抗体的阿特朱单抗，并使阿特朱单抗的给药量为0.75μg，除此之外，与实施例1同样地操作，使用由成纤维细胞和血管内皮细胞和癌细胞形成、具备血管网结构的细胞结构体，评价健康人来源免疫细胞及抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在实施例1中所用的由NHDF和HUVEC的2种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠由与实施例2～4所用者相同的PD-L1蛋白表达量多的人非小细胞性肺腺癌瘤细胞株NCI-H1975(ATCC编号：CRL-5908)形成的癌细胞层而成的细胞结构体。
另外，作为抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)，代替纳武单抗而使用作为抗PD-L1抗体的阿特朱单抗。
此外，细胞培养容器、培养基及PBMC使用与实施例1所用相同者。
与实施例1同样地操作，构筑顶面具备癌细胞层且具备血管网结构的细胞结构体，在PBMC及阿特朱单抗存在下进行培养。
接着，与实施例1同样地操作，计数培养后的细胞结构体的活着的癌细胞，算出CNT(％)。对于各培养条件，反复各测定3次。将结果示于表5。
表5
此外，表5的结果中，作为参照，示出了既未给药PBMC也未给药阿特朱单抗的试样中、2D培养物和细胞结构体中的任一者的CNT均为大致100％的例子。
如表5所示，即便是仅接种了PBMC者，2D培养物和细胞结构体的任一者的CNT也均为85％左右，获得了同等程度的抗癌效果。
并用给药了PBMC和阿特朱单抗者中，2D培养物的CNT为86％左右，与仅接种了PBMC时的抗癌效果为同等程度。
另一方面，具备血管网结构的细胞结构体中，在并用给药PBMC和阿特朱单抗时，CNT为75％左右，与仅接种PBMC时相比，CNT显著性地小，观察到了抗癌效果。
通过本实施例显示，在使用细胞结构体(3D)时，在代替纳武单抗而使用阿特朱单抗时，也观察到了并用给药PBMC和阿特朱单抗时的优异的抗癌效果。
本实施例的结果与阿特朱单抗的抗癌效果的见解是一致的。
即，通过本实施例的结果显示，通过使用本实施方式的评价方法，即便是使用了与纳武单抗不同的抗癌药物，也可准确地评价抗癌效果。
[实施例6]
作为癌细胞，使用NCI-H1975或A549，作为评价对象的免疫细胞，代替健康人来源的PBMC而使用肺癌患者来源的PBMC，并使纳武单抗的给药量为0.3μg，除此之外与实施例1同样地操作，使用由成纤维细胞和血管内皮细胞和癌细胞形成、具备血管网结构的细胞结构体，评价肺癌患者来源的免疫细胞及抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在实施例1中所用的由NHDF和HUVEC的2种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠由PD-L1蛋白表达量多的人非小细胞性肺腺癌细胞株NCI-H1975(ATCC编号：CRL-5908)或PD-L1蛋白表达量少的人肺泡基底上皮腺癌细胞株A549(ATCC编号：CCL-185)形成的癌细胞层而成的细胞结构体。
此外，本实施例中，除了使用肺癌患者来源的外周血单核细胞(Peripheral BloodMononuclear Cell：PBMC)之外，与实施例1中的<PBMC及纳武单抗存在下的培养＞同样地操作，构筑细胞结构体，在肺癌患者来源的PBMC及纳武单抗存在下进行培养。
另外，为了比较，使用肺癌患者来源的PBMC且NCI-H1975或A549，除此之外与实施例1同样地操作，代替所述细胞结构体而构筑将癌细胞按照在一般的培养容器中变为单层的方式进行培养而得到的细胞(2D法)，在肺癌患者来源的PBMC及纳武单抗存在下进行培养。
此外，细胞培养容器、培养基及纳武单抗使用与实施例1所用相同者。
接着，与实施例1同样地操作，计数培养后的细胞结构体的活着的癌细胞，算出CNT(％)。对于各培养条件，反复各测定3次。
将结果示于表6。
表6
其结果为，使用细胞结构体(3D)时，在PD-L1蛋白表达量多的NCI-H1975中，仅接种了肺癌患者来源的PBMC者的CNT为79％左右，而并用给药了肺癌患者来源的PBMC和纳武单抗者的CNT为66％左右。即，使用细胞结构体(3D)时，在NCI-H1975中，并用给药肺癌患者来源的PBMC和纳武单抗时，与仅给药肺癌患者来源的PBMC时相比，CNT显著性地小，观察到了更高的抗癌效果。
另一方面，作为癌细胞构筑将NCI-H1975按照在一般的培养容器中变为单层的方式进行培养而得到的细胞(2D法)，在仅给药肺癌患者来源的PBMC时以及在肺癌患者来源的PBMC及纳武单抗存在下进行培养时的任一种情况下均未观察到充分的抗癌效果。
另外，在使用细胞结构体(3D)时，在PD-L1蛋白表达量少的A549中，仅接种了肺癌患者来源的PBMC者及并用给药了肺癌患者来源的PBMC和纳武单抗者的CNT为基本同等程度的85％左右，未观察到纳武单抗产生的抗癌效果。
另外，使用A549，构筑将癌细胞按照在一般的培养容器中变为单层的方式进行培养而得到的细胞(2D法)，在仅给药肺癌患者来源的PBMC时以及在肺癌患者来源的PBMC及纳武单抗存在下进行培养时的任一种情况下均未观察到充分的抗癌效果。
如上所述，仅在作为癌细胞使用NCI-H1975、且使用具有3D结构的细胞结构体时，因纳武单抗的有无产生的评价结果才有显著性差异。
本实施例的结果与对于PD-L1蛋白高表达的癌细胞可获得抗癌效果、但对于PD-L1蛋白不表达的癌细胞则不显示抗癌效果这一纳武单抗的抗癌效果的见解是一致的。
由这些结果显示，根据本实施方式的评价方法，即便是使用患者来源的PBMC时，也能够准确地评价准确地反映了抗癌药物作用机制的抗癌效果。
[实施例7]
作为与纳武单抗作用机制有关的PD-L1蛋白的表达量不同的2种癌细胞，使用人胃癌细胞NUGC-3(JCRB编号：JCRB0822)或人胃癌细胞MKN-1(JCRB编号：JCRB0252)，并使纳武单抗的给药量为0.3μg，除此之外，与实施例1同样地操作，使用由成纤维细胞和血管内皮细胞和癌细胞形成、具备血管网结构的细胞结构体，评价免疫细胞及抗癌药物(肿瘤免疫检查点抑制剂)的效果。
作为含有癌细胞和血管网结构的细胞结构体，使用在实施例1中所用的由NHDF和HUVEC的2种细胞形成的多层结构体的顶面上层叠由PD-L1蛋白表达量多的人胃癌细胞NUGC-3或PD-L1蛋白表达量少的人胃癌细胞MKN-1形成的癌细胞层而成的细胞结构体。
另外，细胞培养容器、培养基、PBMC及纳武单抗使用与实施例1所用相同者。
与实施例1同样地操作，构筑在顶面具备癌细胞层且具备血管网结构的细胞结构体(3D结构)，在PBMC及纳武单抗存在下进行培养。接着，与实施例1同样地操作，计数培养后的细胞结构体的活着的癌细胞，算出CNT(％)。对于各培养条件，反复各测定3次。将结果示于表7。
表7
其结果为，在PD-L1蛋白表达量多的NUGC-3中，仅接种PBMC者的CNT为84％左右，而并用给药PBMC和纳武单抗者的CNT为73％左右。
即，NUGC-3中，并用给药PBMC和纳武单抗时，与仅给药PBMC时相比，CNT更小，观察到了可获得更高抗癌效果的倾向。
另一方面，在PD-L1蛋白表达量少的MKN-1中，仅接种PBMC者及并用给药PBMC和纳武单抗者的CNT为基本同等程度的86％左右，未观察到纳武单抗产生的抗癌效果。
关于纳武单抗已知：从纳武单抗的作用机制来说，对于PD-L1蛋白高表达的癌细胞可获得抗癌效果，但对于PD-L1蛋白不表达的癌细胞则没有抗癌效果。
本实施例的结果与该纳武单抗的抗癌效果的见解是一致的，教示了：通过本实施方式的评价方法，即便是胃癌等癌症种类与肺癌不同的情况下，也能够进行准确地反映了抗癌药物的作用机制的评价。
以上说明了本发明的实施方式，但实施方式的各构成及它们的组合等仅为一例，在不脱离本发明主旨的范围内，可进行构成的附加、省略、置换及其它变更。另外，本发明不受实施方式所限定。
产业上的可利用性
本实施方式的评价方法是对于受到免疫体系影响的抗癌药物所产生的抗癌效果、在不使用动物模型的情况下的情况下可获得可靠性更高的评价的评价方法。因此，该评价方法可以利用于制药现场的新药开发或药物重新定位筛选、或者临床现场的治疗法的选择和决定等。
Claims (10)
1.一种抗癌药物的评价用试剂盒，其是进行抗癌效果的评价方法的试剂盒，所述抗癌效果的评价方法具有以下工序：
在免疫细胞及抗癌药物的存在下对含有作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞和癌细胞的细胞结构体进行培养的培养工序；和
以所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标，对所述抗癌药物或所述免疫细胞的抗癌效果进行评价的评价工序，
所述试剂盒具备1种以上的所述细胞结构体和分别收容所述细胞结构体的细胞培养容器，所述细胞结构体具备脉管网结构，且厚度为5μm以上，并且所述细胞结构体是5～60层的细胞层层叠而成的3维结构体，
所述作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞为：
选自血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞中的1种以上；和
选自成纤维细胞、神经细胞、肥大细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞及平滑肌细胞中的1种以上。
2.根据权利要求1所述的抗癌药物的评价用试剂盒，其中，所述细胞结构体中，癌细胞仅存在于特定的细胞层中。
3.根据权利要求1所述的抗癌药物的评价用试剂盒，其中，所述癌细胞散存于所述细胞结构体的内部。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的抗癌药物的评价用试剂盒，其中，所述免疫细胞为选自白细胞及淋巴细胞中的1种以上。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的抗癌药物的评价用试剂盒，其中，所述免疫细胞是血浆中外周血单核细胞。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的抗癌药物的评价用试剂盒，其中，所述抗癌药物是癌症免疫检查点抑制剂。
7.一种癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒，其是进行癌症免疫疗法的有效性预测方法的试剂盒，所述癌症免疫疗法的有效性预测方法具有以下工序：
在免疫细胞及抗癌药物的存在下对内部具备含有癌细胞的细胞层的细胞结构体进行培养的培养工序；和
以所述培养工序后的所述细胞结构体中的癌细胞的活细胞数作为指标，使用所述癌细胞和所述免疫细胞中的至少一者对癌症免疫疗法的有效性进行预测的预测工序，
所述癌细胞与所述免疫细胞中的至少一者为从癌症患者采集的细胞，
所述试剂盒具备：细胞结构体中含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置互不相同的2种以上的细胞结构体；和分别收容所述细胞结构体的细胞培养容器，
所述细胞结构体含有1种以上的作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞，并具备脉管网结构，且所述细胞结构体是5～60层的细胞层层叠而成的3维结构体，并且所述细胞结构体中的含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置处于所述细胞结构体的从顶面至厚度方向的一半高度的范围内，
所述作为构成间质的细胞且为免疫细胞以外的细胞为：
选自血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞中的1种以上；和
选自成纤维细胞、神经细胞、肥大细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞及平滑肌细胞中的1种以上。
8.根据权利要求7所述的癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒，其中，在所述培养工序中，在所述免疫细胞及所述抗癌药物的存在下对细胞结构体中含有癌细胞的细胞层的厚度方向上的位置互不相同的2种以上的细胞结构体分别单独地进行培养。
9.根据权利要求7或8所述的癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒，其中，所述抗癌药物是癌症免疫检查点抑制剂。
10.根据权利要求7或8所述的癌症免疫疗法的有效性预测用试剂盒，其中，所述免疫细胞是血浆中外周血单核细胞。
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