JP2017518070A - 人工的な三次元の乳房組織、脂肪組織、および腫瘍疾患モデル - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年4月4日に提出された米国特許出願第61/975,640号および2014年4月8日に提出された米国特許出願第61/976,895号の恩典を主張するものであり、これらはいずれもその全体が参照により組み入れられる。
癌は、米国における死亡原因の第2位であってそれを上回るのは心臓疾患のみであり、4人当たりほぼ1人の死亡に相当する。アメリカ人女性の8人中1人は、一生涯の間に乳癌を発症すると考えられる。アメリカがん協会(American Cancer Society)は、2014年中に米国内の女性で232,670件の浸潤性乳癌の新たな症例が診断されるであろうと見積もっており;男性では約2,360件の新たな症例が予想されている。標的化された安全な乳癌治療法(特に難治性疾患)について緊急の必要性が存在する。
一部の態様において、本明細書において開示される腫瘍疾患モデルは、2つの主な部分である(1)ヒト乳腺線維芽細胞、内皮細胞、および骨髄由来間葉細胞または前駆脂肪細胞を含む間質区画;ならびに(2)ヒト乳腺上皮および/または乳房腺癌細胞を含む上皮区画、から構成される乳癌腫瘍モデルである。さらなる態様において、上皮/腺癌区画が全側面を間質区画によって囲まれるような方式で、Novogen Bioprinter(Organovo)を用いて細胞を堆積させる。なおさらなる態様において、構造体は、バイオインクまたは細胞(後に分解または除去されるハイドロゲルなどの支持用生体材料と混合されている)の、空間的に制御された堆積によって、創出される。
別段の定めのない限り、本明細書において用いられるすべての技術的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、「a」、「an」、および「the」という単数形の形態は、文脈上別段の明示がない限り、複数形の参照物を含む。本明細書における「または」への任意の言及は、別段の記載がない限り、「および/または」を包含することが意図される。
一部の態様において、人工的な組織、構築物、またはそれらのアレイの少なくとも1種の構成要素をバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた構築物は、三次元送達装置(例えば、バイオプリンター)による、生体適合性支持表面(例えば、ハイドロゲルおよび/または多孔質膜から構成される)上への、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞体(例えば、円柱、スフェロイド、リボンなど)を含む細胞、および任意で閉じ込め材料の、三次元の自動化されたコンピューター支援による堆積に基づく、迅速なプロトタイピング技術を利用する方法を用いて作製される。本明細書において使用するとき、一部の態様において、「人工的な」という用語は、組織または構築物を指すために用いられる場合、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞凝集体、およびそれらの層を、コンピュータースクリプトに従ったコンピューター支援装置(例えば、バイオプリンター)によって位置付けして、三次元構造体を形成させることを意味する。さらなる態様において、コンピュータースクリプトとは、例えば、実行可能命令を含む、1つまたは複数のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。なおさらなる態様において、三次元の組織構造体は、細胞または多細胞体のプリンティング後の融合を通じて形成され、それは、ある場合には、初期形態形成における自己組織化現象に類似している。
ある特定の態様において、脂肪組織、乳房組織を含む三次元の生組織、腫瘍モデル、それらのアレイ、および細胞をバイオプリントする工程を含む方法が本明細書において開示される。一部の態様において、細胞は、バイオプリンターからバイオインクを堆積させるまたは押し出すことによってバイオプリントされる。一部の態様において、「バイオインク」は、複数種の細胞を含む液体、半固体、または固体の組成物を含む。一部の態様において、バイオインクは、液体または半固体の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮物を含む。さらなる態様において、細胞溶液、懸濁液、または濃縮物は、液体または半固体の(例えば、粘性のある)キャリアおよび複数種の細胞を含む。なおさらなる態様において、キャリアは、適切な細胞栄養培地(本明細書に記載されるものなど)である。一部の態様において、バイオインクは、バイオプリンティング前に任意で多細胞凝集体へと密着する複数種の細胞を含む。さらなる態様において、バイオインクは複数種の細胞を含み、特定の平面状かつ/または薄層状の形状をもたらすようにバイオプリントされ;バイオインク内の個々の細胞の密着は、バイオプリンティングの前、間、および/または後に生じる。
一部の態様において、バイオインクは押出化合物(すなわち、バイオインクの押出特性を改変する化合物)を含む。押出化合物の例には、ゲル、ハイドロゲル、ペプチドハイドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性ポリオール(例えば、プルロニックF-127またはPF-127)、熱応答性ポリマー、ヒアルロネート、アルギネート、細胞外マトリックス構成要素(および、それらの誘導体)、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然または合成のポリマー、ナノファイバー、および自己組織化ナノファイバーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。一部の態様において、押出化合物は、バイオプリンティングの後に、バイオプリントされた細胞の密着後に、またはバイオプリントされた構築物の成熟後に、物理的、化学的、または酵素的な手段によって除去される。
一部の態様において、いかなるあらかじめ形成された足場をも含んでいないまたは実質的に含んでいない、人工的な組織および腫瘍モデルが本明細書において開示される。さらなる態様において、「足場」とは、ポリマー足場および多孔質ハイドロゲルなどの合成足場、あらかじめ形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および脱細胞化組織などの非合成足場、ならびに人工的な組織および/または器官の物理的構造に不可欠でありかつ該組織および/または器官から除去されない他の任意のタイプのあらかじめ形成された足場を指す。なおさらなる態様において、脱細胞化組織による足場には、脱細胞化天然組織、または任意の様式で培養細胞によって生成された脱細胞化細胞材料;例えば、それらが生きている間に産生したECMを後に残して死滅したまたは脱細胞化された細胞層が含まれる。
一部の態様において、人工的な乳房組織のアレイ、および人工的な腫瘍モデル(乳癌腫瘍モデルを含む)のアレイが本明細書において開示される。一部の態様において、「アレイ」とは、1つのサンプルに対して複数の試験が実施されるのを可能にする、複数のサンプルに対して1つまたは複数の試験が実施されるのを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された複数種の要素の関連付けを含む、科学的ツールである。一部の態様において、アレイは、ミディアムまたはハイスループットスクリーニングと関連するものを含む、スクリーニング方法および装置に適している、つまり適合している。さらなる態様において、アレイは、複数の試験が同時に実施されるのを可能にする。さらなる態様において、アレイは、複数のサンプルが同時に試験されるのを可能にする。一部の態様において、アレイは細胞マイクロアレイである。さらなる態様において、細胞マイクロアレイとは、固体支持体の表面上の生細胞の多重照合を可能にする実験ツールである。他の態様において、アレイは組織マイクロアレイである。さらなる態様において、組織マイクロアレイは、多数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的な解析の実施を可能にする、アレイにおいて組織化された複数の別個の組織または組織サンプルを含む。
一部の態様において、乳房細胞を含む、三次元の人工的な生物学的乳房組織が本明細書に記載される。多くの乳房細胞は、人工的な乳房組織に包含されるのに適している。例えば、様々な態様において、人工的な乳房組織は、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、および脂肪細胞のうちの1種または複数種を適切に含む。様々な態様において、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。さらなる態様において、人工的な乳房組織は、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、およびヒト脂肪細胞のうちの1種または複数種を適切に含む。なおさらなる態様において、人工的な乳房組織は、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト乳腺上皮細胞、およびヒト脂肪細胞のそれぞれを適切に含む。
一部の態様において、間質組織および腫瘍組織を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルが本明細書に記載される。一部の態様において、間質組織は間質細胞を含む。一部の態様において、腫瘍組織は癌細胞を含む。本明細書に記載される人工的な腫瘍モデルは、区画化された構造を有する。例えば、一部の態様において、腫瘍モデルの間質組織は、腫瘍組織を取り囲む。さらなる態様において、腫瘍モデルの間質組織は、例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上の側面で腫瘍組織を取り囲む。なおさらなる態様において、腫瘍モデルの間質組織は、腫瘍組織が間質組織に埋め込まれて人工的な腫瘍モデルを形成するように、腫瘍組織を完全に取り囲む。
・該腫瘍モデルは、間質と癌細胞との間の相互作用を有する区画化された構造体を保持する。
・間質区画のバイオプリンティングの後、内皮ネットワークの形成および脂肪細胞の分化が観察された。
・該腫瘍モデルは、天然様の薬物透過および化学療法用化合物に対する応答を示した。同じ用量のタモキシフェンで同じ持続時間処理した場合、単離された二次元の癌細胞は、三次元のバイオプリントされた構築物中に組み入れられた細胞よりも、タモキシフェン誘導による毒性に対する感受性が高かった。
一部の態様において、本明細書に記載される、(乳房組織を含む)人工的な組織および(乳癌腫瘍モデルを含む)腫瘍モデルは、インビトロアッセイにおける使用のためのものである。一部の態様において、「アッセイ」とは、有機的または生物学的なサンプル(例えば、細胞凝集体、組織、器官、生物など)中の物質(例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など)の存在または活性を試験するまたは測定するための手法である。さらなる態様において、アッセイには、定性的アッセイおよび定量的アッセイが含まれる。なおさらなる態様において、定量的アッセイは、サンプル中の物質の量を測定する。
本明細書に記載されるように、以前の組織製造技術は、主として脂肪細胞の脆弱性および損傷に対する感受性が理由で、十分に生存可能な分化した脂肪細胞を含有する人工的な組織を充分に提供することができていない。一部の態様において、生存可能な分化した脂肪細胞を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルが本明細書に記載される。生存可能な脂肪細胞は、一部の組織において、天然様微小構造の形成における重要な因子である。
製造
図1に示された概略図に従って、3mm×3mm×3mmの寸法を有する6層の立方体を、6ウェル組織培養プレート内のトランスウェル膜上にバイオプリントした(構造体1)。底部2層および上部2層は、75%の正常ヒト乳腺線維芽細胞(NHMF)および25%のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)から構成された。中央部2層は、5000万〜3億個の細胞/mLを含むバイオインクを産生するようにアルギネートおよびゼラチンを含有するハイドロゲル(Novogel(登録商標)2.0システム;Organovo, CA)中に再懸濁されたヒト乳腺上皮細胞(HMEC)の中核部を75% NHMF/25% HUVECが取り囲むバイオプリントされた正方形から構成された。バイオプリンティングの直後に前記構造体を50mM CaCl2とともに2分間インキュベートし、6日間培養した。培養の6日目に、前記構築物を、ハイドロゲルを分解するアルギネートリアーゼとともにインキュベートし、さらに24時間インキュベートした。
構造体1についての査定を、細胞型特異的マーカーに対する組織学的染色によって実施した。構造体1の代表的なH&E染色が図2に示されている。図2に言及すると、H&E染色された標本は、製造後7日目に調製された;上の行(A〜D)は倍率2×を示しており、下の行(E〜H)は倍率20×を示している;左から右に、1列目(AおよびE)はハイドロゲルを含み、2列目(BおよびF)はハイドロゲルを含みかつリアーゼで処理され、3列目(CおよびG)はECMを含み、最後の列(DおよびH)はECMを含みかつリアーゼで処理された。
製造
図7Aに示されたように、5mm×5mm×500μmの寸法を有する四角形を、6ウェル組織培養プレート内のトランスウェル膜上にバイオプリントした(構造体2)。まず、90%の骨髄由来間葉系幹細胞(bmMSC)および10%のHUVECから構成される500μmの間質バイオインク円柱をバイオプリントして、四角形の形を形成させた。HMEC細胞を10%ゼラチンハイドロゲルと混合して上皮バイオインクを形成させ、間質バイオインク四角形の中央部にバイオプリントした。この際、HMECバイオインクは間質バイオインク境界に接触しなかった。75%のNHMFおよび25%のHUVECから構成される第三のバイオインクを用いて、中間部における間質バイオインク境界とHMECバイオインクとの間の空間を充填した。構築物を10日間インキュベートした。図7Bは製造の直後の構造体2を描写しており、図7Cおよび7Dは製造後10日目の構造体2を描写している。インキュベーション中、bmMSCに脂肪細胞分化シグナルを提供して、生存可能な分化したヒト脂肪細胞を生成した。
構造体2についての査定を、細胞型特異的マーカーに対する組織学的染色によって実施した。構造体2の代表的なH&E染色が図8に示されている。図8に言及すると、H&E染色された標本は、製造後10日目に調製された;1行目(AおよびB)は倍率5×を示しており、2行目(CおよびD)は倍率10×を示しており、最後の行(EおよびF)は倍率20×を示している。
MCF7乳癌細胞およびヒト臍帯静脈内皮(HUVEC)細胞から構成される癌細胞節が、正常ヒト乳腺線維芽細胞(NHMF)、HUVEC細胞、および皮下前駆脂肪細胞(SPA)から構成される間質区画によって全側面を取り囲まれている、バイオプリントされた乳癌構築物を作出した。細胞と、可逆的に架橋可能なアルギネートを含有するハイドロゲル(Novogel(登録商標)3.0システム;Organovo, CA)とを組み合わせることによって、バイオインクを産生した。
正常なヒト乳腺線維芽細胞(NHMF)をScienCell(Carlsbad, CA)から入手し、メーカーの指示に従って培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をBD Biosciences(San Jose, CA)から入手し、EGM-2内皮細胞培地(Lonza, Allendale, NJ)中で培養した。
構築物の間質区画は、65%のNHMF、25%のHUVEC、および10%のSPA(部分的に前分化した)から構成された。構築物の癌区画は、75%のMCF7、25%のHUVECから構成された。各区画について、細胞を表示される比率で一緒に混合し、1億5000万個の細胞/mlの濃度でNovogel(登録商標)3.0中に再懸濁した。3mm×3mm×0.75mmの寸法を有する3層状の構造体として、構築物をプリントした。バイオプリンティングの直後に、構築物を架橋により安定化させた。2分後、カルシウム架橋溶液を吸引し、培養培地で置き換えた。培養下で2日後、培養培地中に溶解された酵素で構築物を一晩処理して、Novogel(登録商標)3.0を除去した。次いで、構築物をさらに最高9日間インキュベートした。
すべての化合物をSigma-Aldrichから入手し、DMSO中に溶解した。化合物を培地中10μMまたは100μMの最終濃度に希釈した。最終DMSO濃度は0.1%であり、それをビヒクル処理に用いた。alamarBlueアッセイ(Life Technologies, Carlsbad, CA)またはCellTiter Gloアッセイ(Promega, Madison, WI)によって、構築物を代謝活性について査定した。構築物を、標識された化合物の取り込み調査に関して24時間、または代謝活性の査定に関して4日間処理した。
構築物由来の培養上清を9日間毎日回収した。培地を1:2希釈し、メーカー(Life Technologies)の指示に従って、レプチン分泌について査定した。
2%パラホルムアルデヒド溶液(PBS中、2%パラホルムアルデヒド、10mM塩化カルシウム、50mMスクロース)中、室温で24時間、構築物をインサイチューで固定した。24時間後、固定液を除去しかつ70%エタノールで置き換えた。自動化された組織プロセッサー(Tissue-Tek、Sakura Finetek Europe BV, the Netherlands)を用いて、構築物をパラフィン包埋のために加工した。パラフィンによる浸透後、構築物をパラフィン鋳型中に包埋し、回転式ミクロトーム(Jung Biocut 2035、Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL)を用いて、5μm切片を生成した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色に関しては、スライドをキシレン中で脱ろうし、100%、95%、70%、および50%エタノールを通じて再水和し、蒸留水中でリンスした。スライドをギルヘマトキシリン(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中に浸した。蒸留水でリンスした後、スライドを0.2% v/vの水酸化アンモニウム中に短時間浸した。蒸留水でリンスした後、スライドをエオシン水溶液(American MasterTech)中に浸した。次いで、スライドをエタノール勾配を通じて再水和し、キシレン中で一掃し、樹脂性封入媒体(CytoSeal、Fisher Scientific)で封入した。メーカーの指示(American MasterTech)に従って、マッソン・トリクローム染色を実施した。
構築物をDPBSで1回リンスし、Tissue-Tek OCT化合物(Sakura Finetek Europe B.V., The Netherlands)中に浸し、急速冷凍した。次いで、冷凍したブロックをクライオスタット(Leica Cryocut 1800、Leica Microsystems)で5μmに切片化した。切片化したスライドを-20℃液体アセトン中で瞬間固定し、室温で20分間空気乾燥させた。オイルレッドO染色に関しては、スライドを蒸留水中で再水和し、60%イソプロパノール中に2分間浸した。スライドを、60%イソプロパノール中0.3% w/vのオイルレッドO(Sigma-Aldrich)で室温にて15分間染色し、その後に60%イソプロパノールによる1分間のリンスが続いた。スライドをギルヘマトキシリン中に短時間浸して、対比染色した。スライドを蒸留水でリンスし、水性媒体(American MasterTech)で封入した。蛍光化合物のイメージングに関しては、スライドをDAPI含有封入媒体で封入した。
H&E、トリクローム、およびオイルレッドOで染色されたスライドを、Zeiss Axioskop顕微鏡(Zeiss, Jena, Germany)を用いて撮像した。画像を、Insight 2カメラおよびSpot 5.0ソフトウェア(Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI)で入手した。蛍光染色されたスライドを、Zeiss AxioImager顕微鏡で撮像し、画像をZeiss ICM-1カメラおよびZen Proソフトウェアで入手した。
バイオプリントされた乳癌腫瘍モデルは、経時的なレプチン分泌を示した。バイオプリントされた乳癌構築物由来の培養上清を9日間毎日回収し、レプチン分泌についてELISAアッセイによって査定した。レプチンは、9日間の培養期間を通じて産生され、それは、バイオプリンティング後の前駆脂肪細胞の継続的分化を反映している。図12を参照されたい。
製造
図15Aに示された概略図に従って、乳癌腫瘍モデルをバイオプリントした(構造体4)。乳癌腫瘍モデルは、ヒト間葉系幹細胞から分化したヒト脂肪細胞、ヒト乳腺線維芽細胞、およびヒト内皮細胞を含む、生理学的に関連する間質層によって囲まれたヒト乳癌細胞の節を含んだ。脂肪細胞は、単離されかつバイオインクの調製およびバイオプリンティングの前に脂肪細胞分化に曝露された間葉系幹細胞に由来した。図15Bは、バイオプリンティング直後の構築物の写真を示している。
構造体4についての組織学的解析を、細胞型特異的マーカーに対して染色することによって実施して、組織構造、および細胞型の相対的位置を査定した。図16に言及すると、上の行は、H&E染色(A)およびマッソン・トリクローム染色(B)を描写しており、乳癌細胞は、CellTracker Green CMFDAで標識された。図16Cは、内皮細胞(CD31、赤色)、癌細胞(緑色)に対して染色されかつDAPIでさらに処理された組織を示している。図16Dは、線維芽細胞(TE7、赤色)、癌細胞(緑色)に対して染色されかつDAPIでさらに処理された組織を示している。図16Eは、コラーゲンIV(赤色)、癌細胞(緑色)に対して染色されかつDAPIでさらに処理された組織を示している。図17に言及すると、上の行は、H&E染色(A)およびマッソン・トリクローム染色(B)を描写しており、コラーゲンは青色染色によって表されている。下の行において、E-カドヘリン(緑色)およびTE7(赤色)染色は、それぞれ癌細胞および線維芽細胞を表しており(C)、CD31(緑色)染色は、線維芽細胞(TE7、赤色)を含有する間質区画における微小脈管構造形成のエリアを表している(D)。
製造
90%の骨髄由来間葉系幹細胞(脂肪細胞の前駆体)および10%のHUVECから構成されるバイオインクを調製した。インクを、存在している他の細胞型を有しない四角形としてNovogen Bioprinter(Organovo;San Diego, CA)で堆積させ、脂肪生成分化培地中で10日間成熟させた。
成熟した脂肪組織を、中性脂質のマーカーであるオイルレッドOで染色した。図23は、染色された組織の顕微鏡写真を示しており、有意な脂質産生を示している。
Claims (78)
- 以下を含む、三次元の人工的な生物学的乳癌モデル:
a.ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、乳房間質組織;ならびに
b.乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、該三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれている、乳癌腫瘍組織;
ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであるか、該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであるか、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がそれらの各バイオインクからバイオプリントされたものである。 - あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項1に記載の乳癌モデル。
- 前記乳癌細胞が乳癌細胞株に由来する、請求項1に記載の乳癌モデル。
- 前記乳癌細胞が、患者腫瘍由来の原発性癌細胞である、請求項1に記載の乳癌モデル。
- 前記乳癌腫瘍組織が、前記三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を前記乳房間質組織によって完全に囲まれている、請求項1に記載の乳癌モデル。
- 以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを製造する方法:
a.間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞型を含み、該間質細胞型が押出化合物、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、工程;
b.腫瘍バイオインクを調製する工程であって、該腫瘍バイオインクが押出化合物および1つの乳癌細胞型を含む、工程;
c.該腫瘍バイオインクが、該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程;ならびに
d.該押出化合物を除去しかつ細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。 - 前記バイオインクが、バイオプリンティングによって堆積する、請求項6に記載の方法。
- 前記乳癌細胞型が乳癌細胞株を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記癌細胞型が、患者腫瘍由来の原発性乳癌細胞を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖または維持を支持する可溶性構成要素を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクを堆積させる工程が、
a.表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程;
b.一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程;
c.該区画内に腫瘍バイオインクの節(node)を堆積させる工程;および
d.該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程
をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - 個体における癌に対する治療剤を同定する方法であって、該方法が、
a.複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程;
b.該個体由来の原発性癌細胞を含む腫瘍バイオインクを調製する工程;
c.該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程;
d.細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的構築物を形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程;
e.該構築物に治療剤候補を適用する工程;
f.該癌細胞の生存率を測定する工程;ならびに
g.測定された該癌細胞の生存率に基づいて、該個体に対する治療剤を選択する工程
を含み、ただし、該構築物の少なくとも1種の構成要素がバイオプリンティングによって堆積したものである、前記方法。 - 前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクが、バイオプリンティングによって堆積する、請求項12に記載の方法。
- 前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖または維持を支持する可溶性構成要素を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクを堆積させる工程が、
a.表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程;
b.一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程;
c.該区画内に腫瘍バイオインクの節を堆積させる工程;および
d.該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 個体における乳癌に対する治療剤を同定する方法であって、該方法が、
a.複数の乳房間質細胞型を含む乳房間質バイオインクを調製する工程;
b.該個体由来の原発性乳癌細胞を含む乳房腫瘍バイオインクを調製する工程;
c.該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクに埋め込まれかつ全側面で該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程;
d.細胞を密着させて三次元の人工的な乳癌腫瘍モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程;
e.該乳癌腫瘍モデルに治療剤候補を適用する工程;
f.該乳癌細胞の生存率を測定する工程;ならびに
g.測定された該乳癌細胞の生存率に基づいて、該個体に対する治療剤を選択する工程
を含み、ただし、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクがバイオプリンティングによって堆積したものである、前記方法。 - 前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖または維持を支持する可溶性構成要素を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記間質バイオインクおよび前記腫瘍バイオインクを堆積させる工程が、
a.表面上に間質バイオインクの第一のシートを堆積させる工程;
b.一つの側面で開いている区画を規定するために間質バイオインクの第一のシート上に間質バイオインクの連続的な境界を堆積させる工程;
c.該区画内に腫瘍バイオインクの節を堆積させる工程;および
d.該区画の開いた側面を閉じるために間質バイオインクの第二のシートを堆積させる工程
をさらに含む、請求項17に記載の方法。 - 三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイであって、各乳癌モデルが、
a.ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含む、間質組織;ならびに
b.乳癌細胞およびヒト内皮細胞を含み、各三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を該間質組織によって囲まれている、腫瘍組織
を含み、ただし、該間質組織、該腫瘍組織、または該間質組織および該腫瘍組織の両方がバイオプリントされたものであり;ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、三次元の人工的な生物学的乳癌モデルのアレイ。 - 各乳癌モデルが、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項21に記載のアレイ。
- 各乳癌モデルが、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項21に記載のアレイ。
- 前記乳癌細胞が、患者の腫瘍由来の原発性癌細胞である、請求項21に記載のアレイ。
- 前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的乳癌モデルを形成するように全側面を間質組織によって完全に囲まれている、請求項21に記載のアレイ。
- a.間質組織;および
b.腫瘍組織
を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルであって、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、該三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており;
ただし、該間質組織が、分化シグナルに曝露されたヒト前駆脂肪細胞を含む間質バイオインクからバイオプリントされたものであり、かつ該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものである、前記三次元の人工的な生物学的腫瘍モデル。 - 前記腫瘍組織が、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項1に記載の腫瘍モデル。
- 前記腫瘍組織が、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項2に記載の腫瘍モデル。
- あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項1に記載の腫瘍モデル。
- 前記間質組織が、
a.内皮細胞、
b.線維芽細胞、ならびに
c.脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方
を含む、請求項1に記載の腫瘍モデル。 - 前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項1に記載の腫瘍モデル。
- 前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項1に記載の腫瘍モデル。
- a.間質組織;および
b.腫瘍組織
を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルであって、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、該三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており;
ただし、該間質組織が間質バイオインクからバイオプリントされたものであり、かつ該腫瘍組織が腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであり;
ただし、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクがそれぞれ、細胞の密着前に該腫瘍モデルの構造を物理的に安定化させるために利用される可逆的に架橋可能な押出化合物を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデル。 - 前記腫瘍組織が、前記三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項8に記載の腫瘍モデル。
- 前記腫瘍組織が、前記三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項9に記載の腫瘍モデル。
- あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項8に記載の腫瘍モデル。
- 前記間質組織が、
a.内皮細胞、
b.線維芽細胞、ならびに
c.脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方
を含む、請求項8に記載の腫瘍モデル。 - 前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項8に記載の腫瘍モデル。
- 前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項8に記載の腫瘍モデル。
- 以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを製造する方法:
a.ヒト前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化シグナルを提供する工程;
b.間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞型を含み、該間質細胞型が該ヒト前駆脂肪細胞を含む、工程;
c.腫瘍バイオインクを調製する工程であって、該腫瘍バイオインクが1つの癌細胞型を含む、工程;
d.該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程;ならびに
e.細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。 - 前記腫瘍組織が、全側面を間質組織によって囲まれる、請求項15に記載の方法。
- 前記腫瘍組織が、全側面を間質組織によって完全に囲まれる、請求項16に記載の方法。
- 前記バイオインクが、バイオプリンティングによって堆積する、請求項15に記載の方法。
- 前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記腫瘍バイオインクが内皮細胞をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記間質バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記腫瘍バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質バイオインクが、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質バイオインクであり、かつ前記腫瘍バイオインクがヒト乳房腫瘍バイオインクである、請求項15に記載の方法。
- 以下の工程を含む、三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを製造する方法:
a.可逆的に架橋可能な押出化合物および複数の間質細胞型を含む間質バイオインクを調製する工程;
b.可逆的に架橋可能な押出化合物および1つの癌細胞型を含む腫瘍バイオインクを調製する工程;
c.該腫瘍バイオインクが該間質バイオインクと接触するように、該間質バイオインクおよび該腫瘍バイオインクを堆積させる工程;
d.細胞の密着前に該腫瘍モデルの構造を物理的に安定化させるために、該押出化合物を架橋する工程;ならびに
e.該押出化合物を除去しかつ細胞を密着させて三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成させるために、堆積した該バイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程。 - 前記腫瘍組織が、全側面を前記間質組織によって囲まれる、請求項25に記載の方法。
- 前記腫瘍組織が、全側面を前記間質組織によって完全に囲まれる、請求項26に記載の方法。
- 前記バイオインクがバイオプリンティングによって堆積する、請求項25に記載の方法。
- 前記押出化合物がアルギネートを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記押出化合物が酵素消化によって除去可能である、請求項25に記載の方法。
- 細胞の密着後に、架橋された前記押出化合物を酵素分解によって除去する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 前記間質細胞型が、内皮細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞または前駆脂肪細胞を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記腫瘍バイオインクが内皮細胞をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記間質バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記腫瘍バイオインクが、1mLあたり5000万個〜3億個の細胞を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、ヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、脂肪細胞、および癌細胞の増殖、維持、または分化を支持する可溶性構成要素を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質バイオインクが、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質バイオインクであり、かつ前記腫瘍バイオインクがヒト乳房腫瘍バイオインクである、請求項25に記載の方法。
- 三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイであって、各腫瘍モデルが間質組織および腫瘍組織を含み、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており;ただし、該間質組織が、分化シグナルに曝露されたヒト前駆脂肪細胞を含む間質バイオインクからバイオプリントされたものであり;ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、前記アレイ。
- 前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項38に記載のアレイ。
- 前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項39に記載のアレイ。
- 各腫瘍モデルが、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項38に記載のアレイ。
- 各腫瘍モデルが、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項38に記載のアレイ。
- 前記間質組織が、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方を含む、請求項38に記載のアレイ。
- 前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項38に記載のアレイ。
- 各腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項38に記載のアレイ。
- 三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルのアレイであって、各腫瘍モデルが間質組織および腫瘍組織を含み、該腫瘍組織が癌細胞を含み、該腫瘍組織が該間質組織と接触して、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成しており;ただし、該間質組織が、可逆的に架橋可能な押出化合物を含む間質バイオインクからバイオプリントされたものであり、かつ該腫瘍組織が、可逆的に架橋可能な押出化合物を含む腫瘍バイオインクからバイオプリントされたものであり;ただし、該アレイが、ハイスループットアッセイにおける使用に適している、前記アレイ。
- 前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって囲まれている、請求項46に記載のアレイ。
- 前記腫瘍組織が、各三次元の人工的な生物学的腫瘍モデルを形成するように全側面を前記間質組織によって完全に囲まれている、請求項47に記載のアレイ。
- 各腫瘍モデルが、あらかじめ形成された足場を実質的に含んでいない、請求項46に記載のアレイ。
- 各腫瘍モデルが、マルチウェルプレートのウェル内にある、請求項46に記載のアレイ。
- 前記間質組織が、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに脂肪細胞、前駆脂肪細胞、または脂肪細胞および前駆脂肪細胞の両方を含む、請求項46に記載のアレイ。
- 前記腫瘍組織が内皮細胞を含む、請求項46に記載のアレイ。
- 各腫瘍モデルがヒト乳癌モデルであり、前記間質組織が、ヒト乳腺線維芽細胞、ヒト内皮細胞、およびヒト脂肪細胞を含むヒト乳房間質であり、かつ前記腫瘍組織がヒト乳房腫瘍である、請求項46に記載のアレイ。
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