KR20170013865A - 조작된 3차원 유방 조직, 지방조직, 및 종양 질병 모델 - Google Patents

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KR20170013865A
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로잘리 시어스
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엘렌 랭거
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오가노보, 인크.
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Abstract

3차원의 조작된 생물학적 유방 조직, 지방 조직, 및 유방암 모델을 포함한 종양 모델을 개시한다.

Description

조작된 3차원 유방 조직, 지방조직, 및 종양 질병 모델{ENGINEERED THREE-DIMENSIONAL BREAST TISSUE, ADIPOSE TISSUE, AND TUMOR DISEASE MODEL}
관련 출원의 상호참조
본 출원은 2014년 4월 4일자로 출원된 미국 출원 제 61/975,640 호 및 2014년 4월 8일자로 출원된 미국 출원 제 61/976,895 호의 이점을 청구하며, 이들 출원은 각각 내용 전체가 참고로 인용된다.
암은 미국에서 두 번째로 가장 흔한 사망 원인이며, 오직 심장병에만 추월당하고 사망 4건당 거의 1건을 차지한다. 8명의 미국여성 중 한 명이 그의 생애 중 유방암이 발병할 것이다. 미국 암협회는 2014년 동안 미국 여성에서 232,670건의 새로운 침윤성 유방암 사례가 진단될 것이며; 대략 2,360건의 새로운 사례가 남성에서 예상되는 것으로 추산한다. 표적화된, 안전한 유방암 치료법, 특히 난치성 질환에 대한 치료법이 시급히 필요하다.
암세포와, 섬유아세포, 내피세포, 지방세포 및 면역세포로 구성된 주변 간질세포간의 상호작용은 암 개시, 진행 및 전이에 중요한 역할을 한다. 상기 간질 세포는 세포 신호전달을 조절하고, 암세포에 대해 구조적 지지 역할을 하며, 혈관형성 및 멀리 떨어진 표적 조직으로의 전이에 영향을 미친다. 이와 같이 간질 세포는 암 치료법의 효능에 영향을 미친다. 예를 들어, 유방암의 개시 및 진행을 보다 정확히 설계하고 표적화된 치료법을 보다 효율적으로 한정하기 위해서, 3차원적인 조직 미세환경을 다루어야 한다. 섬유아세포, 내피세포 및 지방세포로 구성된 유방 간질은 발암 및 전이의 과정에 핵심 역할을 수행한다. 이들 세포 유형은, 치료제가 암세포에 접근하고 상기 암세포를 표적화하는 방법에 영향을 미치는 세포외 기질, 성장인자 및 호르몬을 분비한다.
2차원적인 암세포주 배양은 항암제를 시험하기 위한 모델로서 다수의 부적당한점들이 문제가 된다. 첫째로, 현행의 2차원 암 모델은 질병의 개시 및 진행을 정확하게 설계하지 못한다. 둘째로, 현행의 2차원 암 모델은 생리학적으로 관련된 간질 환경을 제공하지 못한다. 결과적으로, 현행의 2차원 암 모델은 항암 치료제에 대해 본래-같은(native-like) 반응을 적합하게 입증하지 못한다. 예를 들어, 2차원의 세포 배양 모델은 전형적으로 임상적 관찰에 비해 치료제에 대해 과장된 반응을 나타낸다.
더욱이, 다수의 관련 조직의 본래의 간질은 지방세포를 포함한다. 다수의 경우에, 생리학적으로-관련된 간질 환경을 갖는 본래-같은 종양 질병 모델은 생육성 지방세포를 포함한다. 기존의 조직 제작 방법들은 생육성 지방세포를 포함하는 조작된 조직을 생성시키는 적합한 능력이 결여되어 있다. 분화된 지방세포는 취약하며 상기 중요한 간질 세포를 손상시키거나 파괴하지 않고서 침착시킬 수 있는 선행 기술은 없다.
2차원 세포주의 사용과 3차원 동물 모델간의 간극을 이어주는 것을 포함하여, 효율적인 약물 개발에 대한 장애물을 극복하기 위한 개선된 전임상 종양학 모델에 대한 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 구체적으로, 표적 치료제의 보다 정확하고 효율적인 선별 및 조기 검출을 위한 신규의 영상화 양식의 개발을 가능하게 하는, 유방암을 포함한 암의 진행과 생리학적으로 관련된 다수의 세포 유형을 포함하는 모델 시스템의 개발에 대한 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 본 명세의 목적은 1) 표적 암 치료법의 선별 및 신규 영상화제의 개발을 위한, 인간 암세포가 섬유아세포, 지방세포 및 내피세포를 포함한 간질 세포에 의해 둘러싸인 본 발명; 및 2) 표적 암 치료법의 선별 및 신규 영상화제의 개발을 위한, 정상 상피로부터 발생하는 인간 유방암세포가 섬유아세포, 지방세포 및 내피세포를 포함한 간질 세포에 의해 둘러싸인 본 발명을 포함한다.
본 명세서에 개시된 종양 질병 모델은 조직 미세환경에서 상이한 세포 유형뿐만 아니라 암세포에 대한 소분자의 영향을 동시에 측정하는 능력을 포함하여, 현행 선별 도구에 비해 다수의 이점들을 갖는다. 본 명세서에 개시된 바이오프린트된 신생조직의 조직형태학적 분석은 상기 조직이 배양물 중에서 적어도 14일 동안 안정성이고 생육성이었으며 지방, 간질 및 상피 성분의 뚜렷한 구획화를 특징으로 함을 입증하였다. 상기 바이오프린팅 과정 동안, 확고한 미세혈관 망상구조가 3차원 조직 디자인의 성분으로서 내피 세포를 사용하여 생성되었다.
하나의 태양에서, 본 명세서는 간질 조직; 및 종양 조직을 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 개시하며; 상기 종양 조직은 암세포를 포함하고, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 상기 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직은 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 상기 종양 조직은 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 또는 상기 간질 조직 및 상기 종양 조직이 모두 그들 각각의 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었다. 일부 실시태양에서, 상기 모델은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포, 지방전구세포 (preadipocyte), 또는 지방세포와 지방전구세포 모두를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 간질 조직은 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포, 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 암세포주의 세포를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 종양 조직은 환자 종양으로부터의 원발암 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 내피세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 종양 조직은 65% 내지 85% 암세포 및 15% 내지 35% 내피세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 모델은 그의 최소 치수가 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 인간 유방 간질이며 상기 종양 조직은 인간 유방 종양이다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 방법은, 상기 간질 바이오-잉크는 압출 화합물 및 다수의 간질 세포 유형을 포함하며; 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 종양 바이오-잉크는 압출 화합물 및 암세포 유형을 포함하는 단계; 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착 (depositing)시키는 단계; 및 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 압출 화합물을 제거하고 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 압출 화합물은 알기네이트를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 압출 화합물은 효소적 절단에 의해 제거 가능하다. 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 침착된 바이오-잉크를 세포의 응집에 앞서 가교결합시켜 상기 종양 모델 구조를 물리적으로 안정화시킴을 추가로 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 가교결합된 바이오-잉크를 세포 응집에 이어서 효소적 분해에 의해 제거함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 세포 유형은 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포 또는 지방전구세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크는 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포, 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 암세포 유형은 암세포주를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 암세포 유형은 환자 종양으로부터의 원발암 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 바이오-잉크는 내피세포를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 300 x 106 세포/㎖를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 300 x 106 세포/㎖를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육, 유지 또는 분화를 지지하는 가용성 성분들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계: 표면상에 간질 바이오-잉크의 제1 시트를 침착시키는 단계; 상기 간질 바이오-잉크의 제1 시트상에 간질 바이오-잉크의 연속적인 보더 (border)를 침착시켜 한면이 개방된 구획을 한정하는 단계; 상기 구획 중에 종양 바이오-잉크의 노드 (node)를 침착시키는 단계; 및 간질 바이오-잉크의 제2 시트를 침착시켜 상기 구획의 개방면을 폐쇄하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 모델은 유방암 모델이다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 유방 간질 조직; 및 유방암 종양 조직을 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 개시하며; 상기 종양 조직은 유방암세포 및 인간 내피세포를 포함하고, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 상기 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직은 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 상기 종양 조직은 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 또는 상기 간질 조직 및 상기 종양 조직이 모두 그들 각각의 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었다. 일부 실시태양에서, 상기 모델은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 상기 유방 간질 조직은 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포, 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유방암 세포는 유방암 세포주로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, 상기 유방암 세포는 환자 종양으로부터의 원발암 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 유방암 종양 조직은 65% 내지 85% 암세포 및 15% 내지 35% 내피세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유방암 모델은 그의 최소 치수가 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 일부 실시태양에서, 상기 유방암 종양 조직은 모든 면이 상기 유방 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 간질 바이오-잉크는 다수의 간질 세포 유형을 포함하고, 상기 간질 세포 유형은 압출 화합물, 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는, 단계; 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 종양 바이오-잉크는 압출 화합물, 유방암 세포 유형 및 인간 내피세포를 포함하는, 단계; 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계; 및 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 압출 화합물을 제거하고 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 압출 화합물은 알기네이트를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 압출 화합물은 효소적 절단에 의해 제거 가능하다. 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 침착된 바이오-잉크를 세포의 응집에 앞서 가교결합시켜 상기 유방암 모델 구조의 유지를 용이하게 함을 추가로 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 가교결합된 바이오-잉크를 세포 응집에 이어서 효소적 분해에 의해 제거함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크는 55% 내지 75% 인간 유방 섬유아세포, 15% 내지 35% 인간 내피세포, 및 1% 내지 20% 인간 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유방암 세포 유형은 유방암 세포주를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 암세포 유형은 환자 종양으로부터의 원발 유방암 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 300 x 106 세포/㎖를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 300 x 106 세포/㎖를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육, 유지 또는 분화를 지지하는 가용성 성분들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크의 침착시키는 단계: 표면상에 간질 바이오-잉크의 제1 시트를 침착시키는 단계; 상기 간질 바이오-잉크의 제1 시트상에 간질 바이오-잉크의 연속적인 보더를 침착시켜 한면이 개방된 구획을 한정하는 단계; 상기 구획 중에 종양 바이오-잉크의 노드를 침착시키는 단계; 및 간질 바이오-잉크의 제2 시트를 침착시켜 상기 구획의 개방면을 폐쇄하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 지방전구세포이며 상기 방법은 상기 지방전구세포에 지방세포 분화 신호를 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 개체에서 암 치료제를 확인하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 다수의 간질 세포 유형을 포함하는 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계; 상기 개체로부터의 원발암 세포를 포함하는 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계; 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계; 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 구조물을 형성시키는 단계; 후보 치료제를 상기 구조물에 적용하는 단계; 상기 암세포의 생육력을 측정하는 단계; 상기 측정된 암세포의 생육력을 근거로 상기 개체에 대한 치료제를 선택하는 단계를 포함하나; 단 상기 구조물 중 적어도 하나의 성분을 바이오프린팅에 의해 침착시켰다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 압출 화합물을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 압출 화합물은 효소적 절단에 의해 제거 가능하다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 침착된 바이오-잉크를 세포의 응집에 앞서 가교결합시켜 상기 종양 모델 구조를 물리적으로 안정화시키는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 가교결합된 바이오-잉크를 세포 응집에 이어서 효소적 분해에 의해 제거함을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 세포 유형은 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포 또는 지방전구세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크는 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포, 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 바이오-잉크는 내피세포를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 300 x 106 세포/㎖를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 300 x 106 세포/㎖를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육, 유지 또는 분화를 지지하는 가용성 성분들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크의 침착시키는 단계: 표면상에 간질 바이오-잉크의 제1 시트를 침착시키는 단계; 상기 간질 바이오-잉크의 제1 시트상에 간질 바이오-잉크의 연속적인 보더를 침착시켜 한면이 개방된 구획을 한정하는 단계; 상기 구획 중에 종양 바이오-잉크의 노드를 침착시키는 단계; 및 간질 바이오-잉크의 제2 시트를 침착시켜 상기 구획의 개방면을 폐쇄하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 3차원의 조작된 생물학적 구조물은 유방암 구조물이다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 생육성의 분화된 지방세포를 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 조직을 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 조직은 바이오프린트되었다. 일부 실시태양에서, 상기 조직은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 상기 조직은 적어도 5%의 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 조직은 적어도 10%의 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포의 적어도 50%는 제작 후 24시간 생육성이다. 추가의 실시태양에서, 상기 지방세포의 적어도 75%는 제작 후 24시간 생육성이다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 제작후 적어도 1주일 동안 렙틴을 분비한다. 일부 실시태양에서, 상기 조직은 지방조직이다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 피하 지방세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 지방세포는 지방전구세포 또는 중간엽 줄기세포로부터 유래된다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 지방조직-함유 생물학적 구조물의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 지방전구세포에 지방세포 분화 신호를 제공하는 단계; 인간 지방전구세포를 포함하는 다수의 간질 세포 유형을 포함하는 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계; 상기 바이오-잉크를 표면상에 침착시키는 단계; 상기 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 구조물을 형성시키는 단계를 포함하며, 상기 구조물은 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 바이오프린팅에 의해 침착된다. 일부 실시태양에서, 상기 구조물은 적어도 5%의 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 구조물은 적어도 10%의 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포의 적어도 50%는 제작 후 24시간 생육성이다. 추가의 실시태양에서, 상기 지방세포의 적어도 75%는 제작 후 24시간 생육성이다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 제작후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 동안 렙틴을 분비한다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 제작후 적어도 1, 2 또는 3주 동안 렙틴을 분비한다. 일부 실시태양에서, 상기 구조물은 지방조직이다. 일부 실시태양에서, 상기 지방전구세포는 피하 지방전구세포이다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 인간 유방 상피세포, 및 인간 지방세포를 포함하나; 단 상기 세포는 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었고 응집되어 3차원의 조작된 생물학적 유방조직을 형성하고; 상기 조직은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 상기 3차원의 조작된 생물학적 유방조직을 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 조직은 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 조직은 그의 최소 직경이 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 일부 실시태양에서, 상기 조직을 질병-유발인자에 노출시켜 유방조직 질병 모델을 생성시킨다. 추가의 실시태양에서, 상기 질병-유발인자는 바이러스, 세균, 화학적 화합물, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 유방조직의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 인간 지방전구세포에 지방세포 분화 신호를 제공하는 단계; 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 인간 유방 상피세포, 및 인간 지방전구세포를 포함하는 다수의 유방세포 유형을 포함하는 바이오-잉크를 제조하는 단계; 상기 바이오-잉크를 생체적합성 표면상에 침착시키는 단계; 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 유방 조직을 형성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 바이오프린팅에 의해 침착된다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 55% 내지 75% 인간 유방 섬유아세포, 15% 내지 35% 인간 내피세포, 및 1% 내지 20% 인간 지방전구세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 300 x 106 세포/㎖를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 인간 섬유아세포, 인간 내피세포 및 지방세포의 생육, 유지 또는 분화를 지지하는 가용성 성분들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 3차원의 조작된 생물학적 유방조직을 질병-유발인자에 노출시켜 유방조직 질병 모델을 생성시킴을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 질병-유발인자는 바이러스, 세균, 화학적 화합물, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 어레이 (array)를 개시하며, 각각의 종양 모델은 간질 조직 및 종양 조직을 포함하고; 상기 종양 조직은 암세포를 포함하며, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나; 단 간질 조직, 상기 종양 조직, 또는 상기 간질조직과 상기 종양 조직 모두는 바이오프린트되었으며; 상기 어레이는 고속 대량처리 분석에 사용하기에 적합하다. 일부 실시태양에서, 각각의 종양 모델은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 각각의 종양 모델은 다중웰 플레이트 중의 웰 중에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 내피세포, 섬유아세포, 및 지방세포, 지방전구세포, 또는 지방세포와 지방전구세포 모두를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 환자 종양으로부터의 원발암 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 내피세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 종양 조직은 65 내지 85% 암세포 및 15% 내지 35% 내피세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 각각의 종양 모델은 그의 최소 치수가 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 인간 유방 간질이고 상기 종양 조직은 인간 유방 종양이다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델의 어레이를 개시하며, 각각의 유방암 모델은 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 간질 조직; 및 종양 조직을 포함하며; 상기 종양 조직은 유방암 세포 및 인간 내피세포를 포함하고, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직, 상기 종양 조직, 또는 상기 간질조직과 상기 종양 조직 모두는 바이오프린트되었으며; 상기 어레이는 고속 대량처리 분석에 사용하기에 적합하다. 일부 실시태양에서, 각각의 유방암 모델은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 각각의 유방암 모델은 다중웰 플레이트 중의 웰 중에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유방암 세포는 환자 종양으로부터의 원발암 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 65 내지 85% 암세포 및 15% 내지 35% 내피세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 각각의 유방암 모델은 그의 최소 치수가 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성한다.
또 다른 태양에서, 본 명세서는 인간 암세포를 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 종양 조직을 개시하나; 단 상기 세포는 응집되어 3차원의 조작된 생물학적 종양 조직을 형성하고; 상기 종양 조직은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 암세포 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 섬유아세포, 내피세포, 상피세포, 지방세포 및 면역세포 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 그의 최소 치수가 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직을 발암물질에 노출시켜 상기 세포를 형질전환시켰다. 추가의 실시태양에서, 상기 질병-유발인자는 바이러스, 세균, 화학적 화합물, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 가교결합성 압출 화합물을, 제작에 이어서 및 상기 종양 조직의 형성을 위한 세포들의 응집 전에 사용하여 상기 종양 조직을 물리적으로 안정화시킨다.
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도 1은 바이오프린트된 유방조직 구조물의 구성을 묘사하는 도식적인 다이어그램의 비제한적인 예를 도시하며; 이 경우에 구조물은 섬유아세포, 내피세포, 및 골수 유래된 중간엽 줄기세포의 외부 영역에 의해 둘러싸인 상피세포의 내부 영역을 갖는 실질적으로 6-층의 입방체 (six-layered cube)이다.
도 2는 도 1의 구조물의 전형적인 광학현미경사진의 비제한적인 시리즈를 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색된 표본을 묘사한다.
도 3A 내지 3D는 도 1의 구조물(제작-후 7일째)의 전형적인 광학현미경사진의 비제한적인 시리즈를 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 비멘틴(녹색) 및 TE7에 대한 항체에 의해 인간 유방 섬유아세포를 시각화하기 위해 염색된 구조물을 묘사한다.
도 4는 도 1의 구조물(제작-후 7일째)의 전형적인 광학현미경사진의 비제한적인 시리즈를 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 DAPI(청색)뿐만 아니라 비멘틴(적색) 및 판 사이토케라틴(녹색)에 대한 항체에 의해 정상적인 인간 유방 섬유아세포 및 인간 유방 상피세포의 상대적인 위치를 시각화하기 위해 염색된 구조물을 묘사한다.
도 5는 도 1의 구조물(제작-후 7일째)의 전형적인 광학현미경사진의 비제한적인 시리즈를 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 DAPI(청색)뿐만 아니라 비멘틴(적색) 및 CD31(녹색)에 대한 항체에 의해 정상적인 인간 유방 섬유아세포 및 인간 제대정맥 상피세포의 상대적인 위치를 시각화하기 위해 염색된 구조물을 묘사한다.
도 6은 도 1의 구조물의 전형적인 광학현미경사진의 비제한적인 시리즈를 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 마쏭의 트리크롬 염색 (Masson's trichrome stain)에 의해 염색된 구조물을 묘사한다.
도 7은 바이오프린트된 유방조직 구조물(도식적 및 사진에 의한)의 비제한적인 예를 도시하며; 이 경우에, 구조물은 골수-유래된 중간엽 줄기세포(제작-후 지방세포로 분화됨)의 보더 및 인간 유방 상피세포의 스트립을 둘러싸고 있는 인간 제대정맥 내피세포를 가지며, 여기에서 상기 보더와 상기 스트립 사이의 공간은 정상적인 인간 유방 섬유아세포 및 인간 제대정맥 내피세포로 채워진다.
도 8은 도 7의 구조물의 전형적인 광학현미경사진의 비제한적인 시리즈를 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색된 표본을 묘사한다.
도 9는 도 7의 구조물의 전형적인 광학현미경사진의 비제한적인 시리즈를 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 DAPI뿐만 아니라 CD31, 비멘틴, FABP4, 및 판 사이토케라틴에 대한 항체에 의해 내피세포, 섬유아세포, 지방세포 및 상피세포를 시각화하기 위해 염색된 구조물을 묘사한다.
도 10은 바이오프린트된 유방암 종양 모델(도식적 및 사진에 의한)의 비제한적인 예를 도시하며; 이 경우에, 종양 모델은 정상적인 인간 유방 섬유아세포, 인간 제대정맥 내피세포 및 피하 지방전구세포(이는 분화되어 생육성 지방세포를 형성하였다)를 포함하는 간질 조직에 의해 모든 면이 둘러싸인 유방암 세포 및 인간 제대정맥 내피세포를 포함하는 종양 조직 코어를 갖는다.
도 11은 분화-전 피하 지방전구세포의 비제한적인 예를 도시하며; 이 경우에 피하 전구세포는 도 10의 종양 모델의 제작 3일 전에 지방세포 분화 배지에 노출되었으며 지질 소적의 조기 형성을 입증한다.
도 12는 도 10의 종양 모델에 의한 시간에 따른 렙틴 분비를 묘사하는 선 그래프의 비제한적인 예를 도시하며, 이는 바이오프린트된 구조물내에서의 지방세포의 연속적인 분화를 암시한다.
도 13은 도 10의 종양 모델의 비제한적인 예시적인 광학현미경사진을 도시하며; 이 경우에, 광학현미경사진은 바이오프린트된 구획화된 구조의 유지 및 본래 조직 중의 관찰을 모방하는 약물 화학물의 침투를 묘사한다.
도 14는 다양한 약물 화합물 및 대조용 처리에 이은 도 10의 종양 모델의 구조물 생육력을 묘사하는 막대 그래프의 비제한적인 예를 도시한다.
도 15는 바이오프린트된 유방암 종양 모델(도식적 및 사진에 의한)의 비제한적인 예를 도시하며; 이 경우에 종양 모델은 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포를 포함하는 간질 구획에 의해 둘러싸인 인간 유방암 세포의 결절 (nodule)을 갖는다.
도 16은 도 15의 종양 모델의 비제한적인 예시적인 광학현미경사진을 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 조직 구조의 조직학적 분석 및 세포 유형의 상대적인 위치를 묘사하며, 여기에서 유방암 세포는 녹색으로 표지된다.
도 17은 도 15의 종양 모델의 비제한적인 예시적인 광학현미경사진을 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 ECM, 세포 유형, 간질 구획 및 미세혈관을 포함한 조직 구조의 조직학적 분석을 묘사한다.
도 18은 도 15의 종양 모델에 의한 시간에 따른 렙틴 분비(제작-후 2일에서 제작-후 8일까지)를 묘사하는 막대 그래프의 비제한적인 예를 도시하며, 이는 바이오프린트된 구조물내에서 지방세포의 연속적인 분화를 암시한다.
도 19는 도 15의 3개 종양 모델의 2개의 대사분석을 묘사하는 막대 그래프의 비제한적인 예를 도시하며, 상기 2개의 대사분석은 모두 낮은 구조물 대 구조물 가변성을 나타낸다.
도 20은 2차원 유방암 세포 배양물과 비교된 도 15의 종양 모델의 약물 반응 분석(타목시펜)을 묘사하는 막대 그래프의 비제한적인 예를 도시한다.
도 21은 MCF7 세포 단독과 비교된 화학요법 화합물에 의한 처리에 따른 도 15의 종양 모델의 대사 활성을 묘사하는 막대 그래프의 비제한적인 예를 도시한다.
도 22는 도 15의 종양 모델의 비제한적인 예시적인 광학현미경사진을 도시하며; 이 경우에 광학현미경사진은 시스플라틴에 의한 처리에 따른 세포사멸의 평가를 묘사한다.
도 23은 바이오프린트된 지방조직의 비제한적인 예시적인 광학현미경사진을 도시하며, 이 경우에 광학현미경사진은 지질에 대한 오일 레드 O 염색을 묘사한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 종양 질병 모델은 2개의 주요 부분 1) 인간 유방 섬유아세포, 내피세포 및 골수-유래된 중간엽 세포 또는 지방전구세포를 포함하는 간질 구획; 및 2) 인간 유방 상피 및/또는 유방 선암종 세포를 포함하는 상피 구획으로 구성된 유방암 종양 모델이다. 추가의 실시태양에서, 상기 세포를 상기 상피/선암종 구획이, 모든 면이 상기 간질 구획에 의해 둘러싸이도록 하는 방식으로 노보젠 바이오프린터(Novogen Bioprinter)(오가노보(Organovo))를 사용하여 침착시킨다. 더욱 추가의 실시태양에서, 바이오-잉크의 공간적으로-조절되는 침착, 또는 나중에 분해되거나 제거되는 하이드로젤과 같은 생물물질 지지체와 혼합된 세포에 의해 구조물을 생성시킨다.
몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 간질 조직; 및 종양 조직을 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 개시하며; 상기 종양 조직은 암세포를 포함하고, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 상기 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직은 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 상기 종양 조직은 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 또는 상기 간질 조직 및 상기 종양 조직이 모두 그들 각각의 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 간질 바이오-잉크는 압출 화합물 및 다수의 간질 세포 유형을 포함하는, 단계; 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 종양 바이오-잉크는 압출 화합물 및 암세포 유형을 포함하는, 단계; 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계; 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 압출 화합물을 제거하고 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성시키는 단계를 포함한다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 유방 간질 조직; 및 유방암 종양 조직을 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 개시하며; 상기 종양 조직은 유방암세포 및 인간 내피세포를 포함하고, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 상기 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직은 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 상기 종양 조직은 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 또는 상기 간질 조직 및 상기 종양 조직이 모두 그들 각각의 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 간질 바이오-잉크는 다수의 간질 세포 유형을 포함하고, 상기 간질 세포 유형은 압출 화합물, 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 단계; 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 종양 바이오-잉크는 압출 화합물, 유방암 세포 유형 및 인간 내피세포를 포함하는 단계; 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계; 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 압출 화합물을 제거하고 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성시키는 단계를 포함한다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 개체에서 암 치료제를 확인하는 방법을 개시하며, 상기 방법은, 다수의 간질 세포 유형을 포함하는 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계; 상기 개체로부터의 원발암 세포를 포함하는 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계; 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계; 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 구조물을 형성시키는 단계; 후보 치료제를 상기 구조물에 적용하는 단계; 상기 암세포의 생육력을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 암세포의 생육력을 근거로 상기 개체에 대한 치료제를 선택하는 단계를 포함하나; 단 상기 구조물 중 적어도 하나의 성분을 바이오프린팅에 의해 침착시켰다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 생육성의 분화된 지방세포를 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 조직을 개시한다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 지방조직-함유 생물학적 구조물의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 지방전구세포에 지방세포 분화 신호를 제공하는 단계; 지방전구세포 및 적어도 하나의 다른 세포 유형을 포함하는 상기 지방전구세포 바이오-잉크를 제조하는 단계; 상기 바이오-잉크를 표면상에 침착시키는 단계; 상기 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 구조물을 형성시키는 단계를 포함하며, 상기 구조물은 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 인간 유방 상피세포, 및 인간 지방세포를 포함하나; 단 상기 세포는 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었고 응집되어 3차원의 조작된 생물학적 유방조직을 형성하고; 상기 조직은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 상기 3차원의 조작된 생물학적 유방조직을 개시한다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 유방조직의 제작 방법을 개시하며, 상기 방법은 인간 지방전구세포에 지방세포 분화 신호를 제공하는 단계; 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 바이오-잉크는 다수의 유방세포 유형을 포함하며, 상기 유방세포 유형은 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 인간 유방 상피세포, 및 인간 지방전구세포를 포함하는, 단계; 상기 바이오-잉크를 생체적합성 표면상에 침착시키는 단계; 및 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 유방 조직을 형성시키는 단계를 포함한다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 어레이를 개시하며, 각각의 종양 모델은 간질 조직 및 종양 조직을 포함하고; 상기 종양 조직은 암세포를 포함하며, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직, 상기 종양 조직, 또는 상기 간질조직과 상기 종양 조직 모두는 바이오프린트되었으며; 상기 어레이는 고속 대량처리 분석에 사용하기에 적합하다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델의 어레이를 개시하며, 각각의 유방암 모델은 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 간질 조직; 및 종양 조직을 포함하며; 상기 종양 조직은 유방암 세포 및 인간 내피세포를 포함하고, 상기 종양 조직은 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직, 상기 종양 조직, 또는 상기 간질조직과 상기 종양 조직 모두는 바이오프린트되었으며; 상기 어레이는 고속 대량처리 분석에 사용하기에 적합하다.
또한 몇몇 실시태양에서, 본 명세서는 인간 암세포를 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 종양 조직을 개시하나; 단 상기 세포는 응집되어 3차원의 조작된 생물학적 종양 조직을 형성하고; 상기 종양 조직은 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다.
일부 정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형인 "하나의" 및 "상기"는 문맥상 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본 명세서에서 "또는"이란 임의의 언급은 달리 서술되지 않는 한 "및/또는"을 포함하고자 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "지방세포"(또한 "지질세포" 또는 "지방 세포"로서도 공지됨)는 지방으로서 에너지를 저장하는데 특화된 지방 조직을 주로 구성하는 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "지방전구세포"는 지방세포를 형성하도록 자극될 수 있는 임의의 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "간질"은 생물학적 세포, 조직 또는 기관의 결합성 지지 프레임워크를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조직"은 세포들의 응집체를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바이오-잉크"는 바이오프린팅에 사용하기 위한 액체, 반-고체 또는 고체 조성물을 의미한다. 일부 실시태양에서, 바이오-잉크는 세포 용액, 세포 응집체, 세포-포함 젤, 다세포체, 또는 조직을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 바이오프린팅이 가능한 특별한 생물역학적 성질을 제공하는 비-세포성 물질을 포함한다. 일부 실시태양에서 상기 바이오-잉크는 압출 화합물을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바이오프린팅"은 자동화된 또는 반-자동화된, 컴퓨터-보조의 3차원 원형화 장치(예를 들어 바이오프린터)에 적합한 방법을 통한 세포(예를 들어 세포 용액, 세포-함유 젤, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)의 3차원적인 정확한 침착을 사용함을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스캐폴드"는 중합체 스캐폴드와 같은 합성 스캐폴드 및 다공성 하이드로젤, 비-합성 스캐폴드, 예를 들어 사전-형성된 세포외 기질층, 죽은 세포층, 및 세포제거된 조직, 및 조작된 조직의 물리적 구조에 일체형이고 상기 조직의 손상/파괴 없이는 상기 조직으로부터 제거될 수 없는 임의의 다른 유형의 사전-형성된 스캐폴드를 지칭한다. 추가의 실시태양에서, 세포제거된 조직 스캐폴드는 세포제거된 본래 조직 또는 임의의 방식으로 배양된 세포에 의해 생성된 세포제거된 세포 물질; 예를 들어 죽거나 세포제거되어, 살아있는 동안 생성시킨 ECM을 남기는 세포층을 포함한다. 따라서 "무스캐폴드"란 용어는 스캐폴드가 사용시에 조작된 조직의 일체 부분이 아니라, 제거되었거나 상기 조작된 조직의 불활성 성분으로서 남아있음을 의미하고자 한다. "무스캐폴드"는 "스캐폴드가 없는" 및 "미리형성된 스캐폴드가 없는"과 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "분석"은 유기 또는 생물학적 샘플(예를 들어 세포 응집체, 조직, 기관, 유기체 등) 중에서 물질(예를 들어 화학물질, 분자, 생화학적 물질, 단백질, 호르몬, 또는 약물 등)의 존재 또는 활성을 시험하거나 측정하기 위한 과정을 의미한다.
바이오프린팅
일부 실시태양에서, 상기 조작된 조직, 구조물 또는 그의 어레이 중 적어도 하나의 성분을 바이오프린트한다. 추가의 실시태양에서, 바이오프린트된 구조물은 3차원 전달 장치(예를 들어 바이오프린터)에 의한 세포, 예를 들어 세포 용액, 세포 현탁액, 세포-포함 젤 또는 페이스트, 세포 농축물, 다세포체(예를 들어 원통형, 구형, 리본 등) 및 임의로 생체적합성 지지체 표면(예를 들어 하이드로젤 및/또는 다공성 멤브레인으로 구성된)상에 국한된 물질의, 3차원의 자동화된 컴퓨터 지원된 침착에 기반한 신속한 원형화 기술을 사용하는 방법에 의해 제조된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 일부 실시태양에서, "조작된"이란 용어는 조직 또는 구조물과 관련하여 사용될 때, 세포, 세포 용액, 세포 현탁액, 세포-포함 젤 또는 페이스트, 세포 농축물, 다세포 응집체, 및 그의 층들을 컴퓨터 스크립트에 따라 컴퓨터 지원된 장치(예를 들어 바이오프린터)에 의해 3차원 구조를 형성하도록 위치시킴을 의미한다. 추가의 실시태양에서, 상기 컴퓨터 스크립트는 예를 들어 하나 이상의 컴퓨터 프로그램, 컴퓨터 어플리케이션, 또는 실행가능한 설명서를 포함한 컴퓨터 모듈이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 3차원 조직 구조는 세포 또는 다세포체의 프린팅-후 융합을 통해 형성되며, 이는 일부의 경우 초기 형태형성에서의 자가-조립 현상과 유사하다.
수동 배치를 포함하여 다수의 방법을 생체적합성 표면상에 세포, 세포 응집체 및 세포-함유 물질을 배열 (arrange)하여 3차원 구조를 생성시키는데 이용할 수 있지만, 자동화된, 컴퓨터 지원된 기계, 예를 들어 바이오프린터에 의한 배치가 유리하다. 상기 기술에 의한 세포, 세포 응집체 및 세포-함유 물질 전달의 이점은 다양한 조성으로 세포, 세포 응집체 및/또는 그의 층의 계획된 또는 사전-결정된 배향 또는 패턴을 나타내는 구조물을 생성시키기 위한 신속하고, 정확하며 재현가능한 세포 또는 다세포체의 배치를 포함한다. 이점은 또한 세포 손상을 최소화하면서 확실한 높은 세포 밀도를 포함한다. 지방세포는 전단력 및 다른 생물역학적 스트레스에 의한 손상에 특히 민감하며; 따라서 본 명세서에 개시된 바이오프린팅 과정은 실시예 2 내지 4에서 강조된 바와 같은 바이오프린트된 조직 중 지방세포의 유리한 생육력에 의해 강조된 바와 같이 대체 기술들에 비해 분명한 이점을 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오프린팅 방법은 연속적이고/이거나 실질적으로 연속적이다. 연속적인 바이오프린팅 방법의 비제한적인 예는 바이오-잉크의 수용조에 연결된 분배 팁(예를 들어 주사기, 바늘, 모세관 등)을 통해 바이오프린터로부터 바이오-잉크(즉 세포, 부형제 또는 압출 화합물과 결합된 세포, 또는 세포의 응집체)를 분배하는 것이다. 추가의 비제한적인 실시태양에서, 연속적인 바이오프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴으로 바이오-잉크를 분배하는 것이다. 다양한 실시태양에서, 반복 기능 단위는 임의의 적합한 기하학적 형태, 예를 들어 원, 사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙한 기하학적 형태를 가지며, 이에 의해 별도의 바이오-잉크들 및/또는 공극 공간들의 공간적 패턴화를 통해 성취되는 평면의 기하학적 형태를 갖는 하나 이상의 조직층들을 생성시킨다. 추가의 실시태양에서, 바이오프린트된 기능 단위의 반복 패턴은 층을 포함하며 다수의 층들이 인접하여(예를 들어 적층되어) 바이오프린트되어 층상의 기하학적 형태를 갖는 조작된 조직을 형성한다. 다양한 실시태양에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 층이 인접하여(예를 들어 적층되어) 바이오프린트되어 조작된 조직을 형성한다. 추가의 실시태양에서, 층상의 기하학적 형태를 갖는 조직의 하나 이상의 층들이 또한 평면의 기하학적 형태를 갖는다.
일부 실시태양에서, 연속적인 바이오프린팅은 임의로 주사기 기전을 사용하여 바이오-잉크의 큰 수용조로부터 보다 큰 조직을 프린팅하는 것을 용이하게 한다. 연속적인 바이오프린팅은 또한 압출 화합물, 하이드로젤, 중합체, 바이오-잉크, 또는 프린팅-후 그의 모양을 유지할 수 있는 임의의 프린트 가능한 물질을 사용하여 공간적으로 한정된 경계 (boundary)를 동시-프린트하는 편리한 방식이며; 여기에서 상기 생성되는 경계는 하나 이상의 바이오-잉크의 바이오프린팅을 통해 임의로 채워지고, 이에 의해 공간적으로 한정된 평면의 기하학적 형태를 갖는 모자이크 조직이 생성된다.
일부 실시태양에서, 연속적인 바이오프린팅 방법은 프린트 높이, 펌프 속도, 로봇 속도, 또는 이들의 조합과 같은 매개변수들을 서로 독립적으로 또는 서로에 대해 최적화하고/하거나 균형을 맞춤을 포함한다. 몇몇 경우에, 침착을 위한 바이오프린터 헤드 속도는 3 ㎜/s이었으며, 이때 제1층에 대한 분배 높이는 0.5 ㎜이고 각각의 후속 층에 대해서 분배 높이는 0.4 ㎜ 증가하였다. 일부 실시태양에서, 상기 분배 높이는 상기 바이오프린터 분배 팁의 직경에 대략적으로 동일하다. 제한 없이, 적합한 및/또는 최적의 분배 거리는 상기 분배 바늘에 부착하거나 평평해지는 물질을 생성시키지 않는다. 다양한 실시태양에서, 상기 바이오프린터 분배 팁은 증분을 포함하여, 약 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ㎛ 이상의 내부 직경을 갖는다. 다양한 실시태양에서, 상기 바이오프린터의 바이오-잉크 수용조는 증분을 포함하여, 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 입방 센티미터 이상의 부피를 갖는다. 상기 펌프 속도는 일부의 경우에 상기 시스템 중의 잔류 압력 형성이 낮은 경우 적합하고/하거나 최적이다. 유리한 펌프 속도는 일부의 경우에 상기 수용조와 분배 바늘의 횡단면적간의 비에 따라 변하며, 보다 큰 비는 보다 낮은 펌프 속도를 요한다. 일부 실시태양에서, 적합한 및/또는 최적의 프린트 속도는 상기 물질의 기계적 보전에 영향을 미치지 않으면서 균일한 선으로 침착될 수 있게 한다.
본 명세서에 개시된 발명은 사업 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 기법 및 방법의 속도 및 확장성을, 시험관내 분석과 같은 세포-기반 연구개발 도구의 생성에 사용하기 위한 조작된 유방 조직 및/또는 종양 질병 조직의 생성을 위한 산업적 및/또는 상업적 설비를 설계, 건조 및 작동시키는데 사용한다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및/또는 그의 모델 및 어레이를, 예를 들어 생물학적 분석 및 고속 대량처리 약물 선별을 위한 세포 어레이(예를 들어 미세어레이 또는 칩), 조직 어레이(예를 들어 미세어레이 또는 칩) 및 키트로서 제조하고, 보관하고, 분배하고, 시판하고, 광고하고, 판매한다. 다른 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및/또는 그의 모델 및 어레이를 제조하고 서비스로 생물학적 분석 및/또는 약물 선별을 수행하는데 사용한다.
바이오-잉크
몇몇 실시태양에서 본 명세서는 지방조직, 유방조직, 종양 모델, 그의 어레이를 포함하는 3차원의 살아있는 조직, 및 세포를 바이오프린팅함을 포함하는 방법을 개시한다. 일부 실시태양에서, 바이오-잉크를 바이오프린터로부터 침착시키거나 압출시킴으로서 세포를 바이오프린트한다. 일부 실시태양에서, "바이오-잉크"는 다수의 세포를 포함하는 액체, 반-고체, 또는 고체 조성물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 바이오-잉크는 액체 또는 반-고체 세포 용액, 세포 현탁액, 또는 세포 농축물을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 세포 용액, 현탁액 또는 농축물은 액체 또는 반-고체(예를 들어 점성) 담체 및 다수의 세포를 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 담체는 적합한 세포 영양 배지, 예를 들어 본 명세서에 개시된 것들이다. 일부 실시태양에서, 바이오-잉크는 바이오프린팅 전에 임의로 다세포 응집체로 응집되는 다수의 세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 바이오-잉크는 다수의 세포를 포함하며 바이오프린트되어 특정한 평면 및/또는 층상의 기하학적 형태를 생성시키며; 여기에서 상기 바이오-잉크 내 개별적인 세포들의 응집은 바이오프린팅 전, 상기 도중 및/또는 상기 후에 일어난다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크를, 다수의 세포를 고정된 부피로 수집함으로써 제조하며; 여기에서 상기 세포 성분(들)은 전체 부피의 적어도 약 30% 및 약 100% 이하를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 바이오-잉크는 반-고체 또는 고체 다세포 응집체 또는 다세포체를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 1) 다수의 세포 또는 세포 응집체 및 생체적합성 액체 또는 젤을 소정의 비로 혼합하여 바이오-잉크를 생성시키고, 2) 상기 바이오-잉크를 압축시켜 목적하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 바이오-잉크를 생성시킴으로써 제조된다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크의 압축은 원심분리, 접선류 여과("TFF") 또는 이들의 조합에 의해 성취된다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바이오-잉크는 높은 세포질 부피, 예를 들어 고농도의 살아있는 세포를 특징으로 한다. 추가의 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 용액의 밀리리터당 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 x 106 이상의 세포를 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 약 50 내지 약 300 x 106 세포/㎖을 포함한다. 일부 실시태양에서, 높은 세포질 부피를 갖는 바이오-잉크를 사용하여 높은 세포 밀도를 갖는 조작된 조직 및 구조물을 바이오프린팅한다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및 구조물은 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 퍼센트 이상이 세포이다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크의 압축은 압출성 조성물을 생성시키며, 이는 다세포 응집체 또는 다세포체의 형성을 허용한다. 일부 실시태양에서, "압출성"은 노즐 또는 오리피스(예를 들어 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 통해 강제로(예를 들어 가압하에) 밀어넣음으로써 성형될 수 있음을 의미한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크의 압축은 세포가 적합한 밀도로 증식함으로부터 생성된다. 상기 바이오-잉크에 필요한 세포 밀도는 사용되는 세포 및 생성되는 조직 또는 기관에 따라 변할 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크의 세포를 응집시키고/시키거나 부착시킨다. 일부 실시태양에서, "응집시키다", "응집된", 및 "응집"은 세포, 다세포 응집체, 다세포체 및/또는 그의 층들을 결합시키는 세포-세포 부착 성질을 지칭한다. 추가의 실시태양에서, 상기 용어는 "융합하다", "융합된" 및 "융합"과 호환적으로 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 지지 물질, 세포 배양 배지(또는 그의 보충물), 세포외 기질(또는 그의 성분), 세포 부착제, 세포사 억제제, 세포사멸 억제제, 산화방지제, 압출 화합물 및 이들의 조합을 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 암세포(예를 들어 종양 세포)를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 암 세포는 하나 이상의 세포주의 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 암세포는 환자의 종양으로부터 유래된 원발암 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 간질 세포, 예를 들어 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포 및/또는 지방전구세포를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 비-바이오프린팅 제작 방법에 적합한 바이오-젤이다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-젤은 암세포(예를 들어 종양 세포)를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 암세포는 하나 이상의 세포주의 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 암세포는 환자의 종양으로부터 유래된 원발암 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-젤은 간질세포, 예를 들어 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포 및/또는 지방전구세포를 포함한다.
압출 화합물
일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 압출 화합물(즉 상기 바이오-잉크의 압출 성질을 변형시키는 화합물)을 포함한다. 압출 화합물의 예는 비제한적으로 젤, 하이드로젤, 펩티드 하이드로젤, 아미노산-기재 젤, 계면활성제 폴리올(예를 들어 플루로닉 F-127 또는 PF-127), 열-반응성 중합체, 히아루로네이트, 알기네이트, 세포외 기질 성분(및 그의 유도체), 콜라겐, 젤라틴, 다른 생체적합성 천연 또는 합성 중합체, 나노섬유, 및 자가-조립 나노섬유를 포함한다. 일부 실시태양에서, 압출 화합물을 바이오프린팅에 이어서, 상기 바이오프린트된 세포의 응집에 이어서, 또는 상기 바이오프린트된 구조물의 성숙에 이어서 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 제거한다.
적합한 하이드로젤은 콜라겐, 히아루로네이트, 히아루로난, 피브린, 알기네이트, 아가로스, 키토산 및 이들의 조합으로부터 유래된 것들을 포함한다. 다른 실시태양에서, 적합한 하이드로젤은 합성 중합체이다. 추가의 실시태양에서, 적합한 하이드로젤은 폴리(아크릴산) 및 그의 유도체, 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 그의 공중합체, 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 및 이들의 조합으로부터 유래된 것들을 포함한다. 다양한 구체적인 실시태양에서, 상기 구속 물질은 하이드로젤, 노보젤®, 아가로스, 알기네이트, 젤라틴, 매트리젤™, 히아루로난, 폴록사머, 펩티드 하이드로젤, 폴리(이소프로필 n-폴리아크릴아미드), 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEG-DA), 하이드록시에틸 메트아크릴레이트, 폴리디메틸실록산, 폴리아크릴아미드, 폴리(락트산), 실리콘, 실크 또는 이들의 조합 중에서 선택된다.
일부 실시태양에서, 하이드로젤-기재 압출 화합물은 가교결합성 젤이다. 추가의 실시태양에서, 가교결합성 젤은 화학적 수단에 의해 가교결합 가능한 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 적합한 하이드로젤은 알기네이트-함유 가교결합성 하이드로젤을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 적합한 하이드로젤은 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 퍼센트 이상의 알기네이트를 포함한다. 일부 실시태양에서, 바이오프린팅에 이어서, 구조물을, 세포의 응집 전에 바이오프린트된 구조를 보존하기 위해서, 상기 하이드로젤을 화학적으로 가교결합시키는 작용제, 예를 들어 CaCl2의 용액과 임의로 인큐베이션한다. 더욱이, 일부 실시태양에서, 상기 바이오프린트된 구조물을, 상기 하이드로젤을 효소적으로 분해시키기 위해서 알기네이트 분해효소와 임의로 인큐베이션한다. 추가의 실시태양에서, 상기 바이오프린트된 구조물을, 상기 하이드로젤을 효소적으로 분해시키기 위해서 알기네이트 분해효소와 약 0.2 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 임의로 인큐베이션한다.
일부 실시태양에서, 적합한 하이드로젤은 젤라틴을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 적합한 하이드로젤은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 퍼센트 이상의 젤라틴을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 압출 화합물 또는 하이드로젤 중의 상기 젤라틴의 농도는 약 5 내지 15%이고 상기 알기네이트의 농도는 약 0.5 내지 5%이다. 특정한 실시태양에서, 상기 압출 화합물 또는 하이드로젤 중의 상기 젤라틴의 농도는 10%이고 상기 알기네이트의 농도는 1%이다.
일부 실시태양에서, 하이드로젤-기재 압출 화합물은 열가역성 젤(또한 열-반응성 젤 또는 써모젤로서 공지됨)이다. 일부 실시태양에서, 적합한 열가역성 하이드로젤은 실온에서 액체가 아니다. 구체적인 실시태양에서, 적합한 하이드로젤의 젤화 온도(Tgel)는 증분을 포함하여 약 10 ℃, 11 ℃, 12 ℃, 13 ℃, 14 ℃, 15 ℃, 16 ℃, 17 ℃, 18 ℃, 19 ℃, 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃, 24 ℃, 25 ℃, 26 ℃, 27 ℃, 28 ℃, 29 ℃, 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, 37 ℃, 38 ℃, 39 ℃, 40 ℃이다. 몇몇 실시태양에서, 적합한 하이드로젤의 Tgel은 약 10 ℃ 내지 약 40 ℃이다. 추가의 실시태양에서, 적합한 하이드로젤의 Tgel은 약 20 ℃ 내지 약 30 ℃이다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바이오-잉크(예를 들어 하이드로젤, 하나 이상의 세포 유형 및 다른 첨가제 등을 포함하는)는 실온에서 액체가 아니다. 일부 실시태양에서, 적합한 열가역성 하이드로젤은 포유동물 체온에서 액체가 아니다. 구체적인 실시태양에서, 적합한 하이드로젤의 젤화 온도(Tegl)는 증분을 포함하여 약 22 ℃, 23 ℃, 24 ℃, 25 ℃, 26 ℃, 27 ℃, 28 ℃, 29 ℃, 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, 37 ℃, 38 ℃, 39 ℃, 40 ℃, 41 ℃, 41 ℃, 43 ℃, 44 ℃, 45 ℃, 46 ℃, 47 ℃, 48 ℃, 49 ℃, 50 ℃, 51 ℃, 52 ℃이다. 몇몇 실시태양에서, 적합한 하이드로젤의 Tgel은 약 22 ℃ 내지 약 52 ℃이다. 추가의 실시태양에서, 적합한 하이드로젤의 Tgel은 약 32 ℃ 내지 약 42 ℃이다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바이오-잉크(예를 들어 하이드로젤, 하나 이상의 세포 유형 및 다른 첨가제 등을 포함하는)는 포유동물 체온에서 액체가 아니다. 구체적인 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 바이오-잉크의 젤화 온도(Tegl)는 증분을 포함하여 약 10 ℃, 약 15 ℃, 약 20 ℃, 약 25 ℃, 약 30 ℃, 약 35 ℃, 약 40 ℃, 약 45 ℃, 약 50 ℃, 약 55 ℃이다.
폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌으로 구성된 중합체는 수용액에 혼입시 열가역성 젤을 형성한다. 이들 중합체는 바이오프린터 장치에서 유지될 수 있는 온도에서 액체 상태로부터 젤 상태로 변하는 능력을 갖는다. 상기 액체 상태에서 젤 상태로의 변이는 상기 용액 중 중합체 농도 및 성분들에 따라 변한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 하이드로젤 및 바이오-잉크의 점도를 개시된 임의의 수단에 의해 측정한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, LVDV-II+CP 콘 플레이트(Cone Plate) 점도계 및 콘 스핀들(Cone Spindle) CPE-40을 사용하여 상기 하이드로젤 및 바이오-잉크의 점도를 계산한다. 다른 실시태양에서, 브룩필드(Brookfield)(스핀들 및 컵) 점도계를 사용하여 상기 하이드로젤 및 바이오-잉크의 점도를 계산한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에서 언급된 점도 범위는 실온에서 측정된다. 다른 실시태양에서, 본 명세서에서 언급된 점도 범위는 체온에서(예를 들어 건강한 인간의 평균 체온에서) 측정된다.
추가의 실시태양에서, 상기 하이드로젤 및/또는 바이오-잉크는 약 500 내지 1,000,000 센티포이즈, 약 750 내지 1,000,000 센티포이즈; 약 1000 내지 1,000,000 센티포이즈; 약 1000 내지 400,000 센티포이즈; 약 2000 내지 100,000 센티포이즈; 약 3000 내지 50,000 센티포이즈; 약 4000 내지 25,000 센티포이즈; 약 5000 내지 20,000 센티포이즈; 또는 약 6000 내지 15,000 센티포이즈의 점도를 가짐을 특징으로 한다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크의 비-세포 성분(예를 들어 압출 화합물 등)을 사용전에 제거한다. 추가의 실시태양에서, 상기 비-세포 성분은 예를 들어 하이드로젤, 펩티드 하이드로젤, 아미노산-기재 젤, 계면활성제 폴리올, 열-반응성 중합체, 히아루로네이트, 알기네이트, 콜라겐, 또는 다른 생체적합성 천연 또는 합성 중합체이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 비-세포 성분을 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 제거한다. 일부 실시태양에서, 상기 비-세포 성분의 일부는 사용시 세포 성분과 결합된 채로 있다.
사전-형성된 스캐폴드
일부 실시태양에서, 본 명세서는 임의의 사전-형성된 스캐폴드가 없거나 실질적으로 없는 조작된 조직 및 종양 모델을 개시한다. 추가의 실시태양에서, "스캐폴드"는 중합체 스캐폴드와 같은 합성 스캐폴드 및 다공성 하이드로젤, 비-합성 스캐폴드, 예를 들어 사전-형성된 세포외 기질층, 죽은 세포층, 및 세포제거된 조직, 및 조작된 조직 및/또는 기관의 물리적 구조에 일체형이고 상기 조직 및/또는 기관으로부터 제거되지 않는 임의의 다른 유형의 사전-형성된 스캐폴드를 지칭한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 세포제거된 조직 스캐폴드는 세포제거된 본래 조직 또는 임의의 방식으로 배양된 세포에 의해 생성된 세포제거된 세포 물질; 예를 들어 죽거나 세포제거되어, 살아있는 동안 생성시킨 ECM을 남기는 세포층을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및 종양 모델(그의 어레이 포함)은 예를 들어 상기 조직, 상기 조직의 임의의 층의 형성, 또는 상기 조직의 모양의 형성에 어떠한 사전-형성된 스캐폴드도 사용하지 않는다. 비-제한적인 예로서, 본 명세의 조작된 유방 및 지방 조직은 임의의 사전-형성된 합성 스캐폴드, 예를 들어 중합체 스캐폴드, 사전-형성된 세포외 기질층, 또는 임의의 다른 유형의 사전-형성된 스캐폴드를 제조시 또는 사용시에 사용하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 유방 및 지방 조직은 임의의 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없다. 추가의 실시태양에서, 상기 조직의 세포 성분은, 검출성이지만 미량 또는 사소한 양, 예를 들어 전체 조성물의 2.0% 미만, 1.0% 미만, 0.5% 미만, 또는 0.1% 미만의 스캐폴드를 함유한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 미량 또는 사소한 양의 스캐폴드는 상기 조직 또는 그의 어레이의 장기간 양상에 영향을 미치거나 또는 그의 1차적인 생물학적 기능을 간섭하기에는 불충분하다. 추가의 실시태양에서, 스캐폴드 성분은 물리적, 화학적 또는 효소적 방법에 의해 프린팅-후 제거되어, 스캐폴드 성분이 없거나 실질적으로 없는 조작된 조직을 제공한다.
어레이
일부 실시태양에서, 본 명세서는 조작된 유방 조직의 어레이 및 조작된 종양 모델(유방암 종양 모델 포함)의 어레이를 개시한다. 일부 실시태양에서, "어레이"는 하나의 샘플상에서 수행되는 다수의 시험, 다수의 샘플상에서 수행되는 하나 이상의 시험, 또는 이들을 다 허용하도록 공간적으로 배열되는 다수 요소들의 결합을 포함하는 과학적 도구이다. 일부 실시태양에서, 상기 어레이는 중간- 또는 고속 대량처리 선별과 관련된 것들을 포함한 선별 방법 및 장치에 적합하거나 또는 이를 위해 개조된다. 추가의 실시태양에서, 어레이는 다수의 시험을 동시에 수행되게 한다. 일부의 실시태양에서, 상기 어레이는 세포 미세어레이이다. 추가의 실시태양서, 세포 미세어레이는 고체 지지체의 표면상의 살아있는 세포의 복합 조사를 허용하는 실험 도구이다. 다른 실시태양에서, 상기 어레이는 조직 미세어레이이다. 추가의 실시태양에서, 조직 미세어레이는 다수의 생화학적, 대사, 분자 또는 조직학적 분석의 수행을 허용하는 어레이로 조립된 다수의 별도의 조직 또는 조직 샘플들을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및/또는 종양 모델은 각각 생체적합성 다중-웰 용기의 웰에 존재한다. 일부 실시태양에서, 각각의 조직을 웰내에 놓는다. 다른 실시태양에서, 각각의 조직을 웰내로 바이오프린트한다. 추가의 실시태양에서, 상기 웰을 코팅한다. 다양한 추가의 실시태양에서, 상기 웰을 생체적합성 하이드로젤, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 화학물질, 하나 이상의 펩티드, 하나 이상의 항체, 및 하나 이상의 성장 인자 및 이들의 조합 중 하나 이상으로 코팅한다. 일부 실시태양에서, 상기 웰을 노보젤®로 코팅한다. 다른 실시태양에서, 상기 웰을 아가로스로 코팅한다. 일부 실시태양에서, 각각의 조직은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰내에서 다공성의 생체적합성 멤브레인상에 존재한다. 일부 실시태양에서, 다중-웰 용기의 각 웰은 2개 이상의 조직을 함유한다.
일부 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및/또는 종양 모델을 하나 이상의 면에서 생체적합성 표면에 고정시킨다. 다수의 방법이 조직을 생체적합성 표면에 고정시키는데 적합하다. 다양한 실시태양에서, 조직을, 예를 들어 하나 이상의 전체 면을 따라, 단지 하나 이상의 면의 테두리에, 또는 단지 하나 이상의 면의 중심에서 생체적합성 표면에 적합하게 고정시킨다. 다양한 추가의 실시태양에서, 조직을 생체적합성 표면에, 상기 표면에 통합되거나 또는 상기 표면과 결합된 홀더 또는 담체로 적합하게 고정시킨다. 다양한 추가의 실시태양에서, 조직을 생체적합성 표면에, 상기 표면에 통합되거나 또는 상기 표면에 결합된 하나 이상의 핀치-클램프 또는 플라스틱 매듭으로 적합하게 고정시킨다. 일부 실시태양에서, 조직을 생체적합성 표면에 다공성 멤브레인에의 세포-부착에 의해 적합하게 고정시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및/또는 종양 모델을 하나 이상의 면에서 생체적합성 표면에의 붙임(affixation)에 의해 어레이 형태로 유지시킨다. 추가의 실시태양에서, 상기 조직을 1, 2, 3, 4개 이상의 면에서 생체적합성 표면에 붙인다. 일부 실시태양에서, 상기 생체적합성 표면은 상기 조직 또는 상기 조직과 접촉하는 유기체에 손상이나 독성의 현저한 위험을 제기하지 않는 임의의 표면이다. 추가의 실시태양에서, 상기 생체적합성 표면은 전통적인 조직 배양 방법에 적합한 임의의 표면이다. 적합한 생체적합성 표면은 비제한적인 예로서, 처리된 플라스틱, 멤브레인, 다공성 멤브레인, 코팅된 멤브레인, 코팅된 플라스틱, 금속, 코팅된 금속, 유리, 처리된 유리, 및 코팅된 유리를 포함하며, 여기에서 적합한 코팅은 하이드로젤, ECM 성분, 화학물질, 단백질 등을 포함하고, 코팅 또는 처리는 상기 생체적합성 표면에의 세포 및 조직 부착을 자극하거나 방지하는 수단을 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및/또는 종양 모델의 어레이는 2개 이상의 요소의 결합을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 어레이는 증분을 포함하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개 이상의 요소의 결합을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 각각의 요소는 하나 이상의 세포, 다세포 응집체, 조직, 종양 모델, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 조작된 조직 및/또는 종양 모델의 어레이는 소정의 패턴으로 공간적으로 배열된 다수의 요소들을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 패턴은 요소들의 임의의 적합한 공간적 배열 (arrangement)이다. 다양한 실시태양에서, 배열의 패턴은 비제한적인 예로서 2차원 그리드, 3차원 그리드, 하나 이상의 선, 호, 또는 원, 일련의 열 또는 컬럼 등을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 패턴은 중간- 또는 고속 대량처리 생물학적 분석 또는 선별 방법 또는 장치와의 적합성을 위해 선택된다.
다양한 실시태양에서, 하나 이상의 조직 또는 종양 모델을 하나의 어레이로 제작하는데 사용되는 세포의 세포 유형 및/또는 공급원을 특정한 연구 목표 또는 목적을 근거로 선택한다. 추가의 다양한 실시태양에서, 어레이 중 특정한 조직 또는 종양 모델을 특정한 연구 목표 또는 목적을 근거로 선택한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 특정한 조작된 조직을 하나의 어레이에 포함시켜 특정 질병 또는 상태의 조사를 용이하게 한다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 특정한 조작된 조직을 하나의 어레이에 포함시켜 특정 환자의 질병 또는 상태의 조사를 용이하게 한다. 추가의 실시태양에서, 상기 어레이 내의 하나 이상의 특정한 조작된 조직을 2개 이상의 별개의 인간 공여자로부터 유래된 하나 이상의 세포 유형으로 생성시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 어레이 내의 각 조직은 세포 유형, 세포의 공급원, 세포의 층, 세포의 비, 구성 방법, 크기, 모양 등에 관하여 실질적으로 유사하다. 다른 실시태양에서, 상기 어레이 내의 조직들 중 하나 이상은 세포 유형, 세포의 공급원, 세포의 층, 세포의 비, 구성 방법, 크기, 모양 등에 관하여 독특하다.
일부 실시태양에서, 상기 어레이 내의 각 조직 및/또는 종양 모델을 배양물 중에서 독립적으로 유지시킨다. 추가의 실시태양에서, 상기 어레이 내의 각 조직의 배양 조건은 상기 조직이 다른 조직들로부터 단리되고 배지 또는 상기 배지 중에 가용성인 인자를 교환할 수 없게 하는 것이다. 다른 실시태양에서, 상기 어레이 내의 2개 이상의 개별적인 조직은 가용성 인자를 교환한다. 추가의 실시태양에서, 상기 어레이 내의 2개 이상의 개별적인 조직의 배양 조건은 상기 조직이 다른 조직과 배지 및 상기 배지 중에 가용성인 인자를 교환하게 하는 것이다. 다양한 실시태양에서, 증분을 포함하여 상기 어레이 내의 조직 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300개 이상이 배지 및/또는 가용성 인자를 교환한다. 다른 다양한 실시태양에서, 증분을 포함하여 상기 어레이 내의 조직 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 배지 및/또는 가용성 인자를 교환한다.
조작된 유방 조직
몇몇 실시태양에서 본 명세서는 유방세포를 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 유방 조직을 개시한다. 다수의 유방세포가 상기 조작된 유방 조직에 포함시키기에 적합하다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 적합하게는 섬유아세포, 내피세포, 상피세포 및 지방세포 중 하나 이상을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 세포는 척추동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포 또는 이들의 조합이다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 적합하게는 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 인간 유방 상피세포 및 인간 지방세포 중 하나 이상을 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 적합하게는 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 인간 유방 상피세포 및 인간 지방세포를 각각 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 인간 내피세포는 인간 제대정맥 내피 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 전구세포, 예를 들어 골수 유래된 중간엽 줄기세포를 포함한 중간엽 줄기세포로부터 유래된다. 추가의 실시태양에서, 상기 지방세포는 지방전구세포와 같은 전구세포로부터 유래된다. 상기와 같은 경우에, 상기 지방세포 전구세포를 바이오-잉크의 제조에 사용하기 전에 또는 바이오프린팅에 사용하기 전에 분화 신호에 노출시킨다. 추가의 실시태양에서, 상기 지방세포 전구세포를 바이오-잉크의 제조에 사용하기 전에 또는 바이오프린팅에 사용하기 전에 분화 신호에 노출시켜 상기 세포를 부분적으로 사전-분화시킨다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 지방세포 전구세포 또는 지방전구세포는 바이오프린팅-후 분화를 완료한다. 일부 실시태양에서, 상기 인간 지방세포는 인간 피하 지방세포이다.
본 발명자들은 놀랍게도, 생육성의 분화된 지방세포가 본래-같은 조작된 유방조직에 핵심임을 발견하였다. 일부의 경우에, 상기 조직의 간질 중 상기 세포가 존재하지 않으면 상기 조직은 증식하지 못하고, 붕괴되며, 생성되는 미세구조는 본래 조직을 재현하지 못한다. 본 발명자들은 또한 기존의 조직 제작 방법이, 상기 세포가 관련된 압축 및 전단력을 견디기에는 너무 취약하기 때문에 분화된 지방세포의 침착에 적합하지 않음을 인식하였다. 본 명세서에 개시된 요지는 이러한 문제 모두에 대한 해법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 세포를 바이오프린트한다. 추가의 실시태양에서, 상기 바이오프린트된 세포들이 응집되어 조작된 유방 조직을 형성한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 제작시에 또는 사용시에 사전-형성된 스캐폴드가 없거나 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 신경이 통하지 않는다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 온전한 신경계 및/또는 성숙한 신경 조직이 없다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 온전한 혈관계 및/또는 성숙한 혈관구조가 없다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 유방조직은 적혈구가 없다.
다수의 세포 조성 및 비가 상기 조작된 유방 조직에 적합하다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 55% 내지 75% 섬유아세포, 15% 내지 35% 내피세포 및 1% 내지 20% 지방세포를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 65% 섬유아세포, 25% 내피세포 및 10% 지방세포를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 65% 섬유아세포, 25% 내피세포 및 10% 지방세포를 포함한다.
다수의 모양 및 크기가 상기 조작된 유방 조직에 적합하다. 예로서, 하나의 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직을 시트의 형태로 바이오프린트한다. 추가의 예로서, 다른 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직을 입방체 또는 블럭의 형태로 바이오프린트한다. 추가의 예로서, 또 다른 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직을 구의 형태로 바이오프린트한다. 최종적으로, 다른 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직을 원통형 또는 리본의 형태로 바이오프린트한다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 그의 최소 치수가 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직은 그의 최대 치수가 약 250 ㎛ 내지 약 5 ㎜이다. 특정한 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직을 각 변이 2 또는 3 ㎜인 입방체의 형태로 바이오프린트한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 조직은 세포 배양 조건에서 성숙화 기간 후에 구를 형성한다.
또한 일부 실시태양에서 본 명세서는 중간- 또는 고속-대량처리 분석, 예를 들어 약물 선별 분석, 약물 발견 분석, 약물 안전성 및 독성 분석, 약물 효능 분석 등에 사용하기에 적합한 3차원의 조작된 생물학적 유방 조직의 어레이를 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 어레이는 조작된 유방 조직을 다중-웰 플레이트의 각 웰에 침착시켜 조직들의 그리드를 형성시킴으로써 생성된다.
본 명세서에 개시된 조작된 유방 조직의 제작 방법은 바이오프린팅을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 지방세포 전구세포(예를 들어 중간엽 줄기 세포, 지방전구세포 등)가 실질적인 손상 없이 침착될 수 있고 나중에 지방세포로 완전히 분화되도록 상기 세포에 지방세포 분화 신호를 제공함을 포함한다.
후속적으로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 바이오-잉크를 제조함을 포함하며, 상기 바이오-잉크는 압출 조성물(예를 들어 하이드로젤) 및 유방 세포 유형, 예를 들어 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 인간 유방 상피세포 및 인간 지방전구세포(이들은 지방세포 분화 신호에 노출되었다)를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 예를 들어 55% 내지 75% 인간 유방 섬유아세포, 15% 내지 35% 인간 내피세포, 및 1% 내지 20% 인간 지방전구세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 바이오-잉크는 약 50 x 106 세포/㎖ 내지 약 400 x 106 세포/㎖을 포함한다.
추가로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 바이오-잉크를 자동 또는 반자동 침착 장치, 예를 들어 바이오프린터를 통해 생체적합성 표면상에 침착시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직의 하나 이상의 성분을 바이오프린트한다. 다른 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직의 각 성분을 바이오프린트한다. 특정한 실시태양에서, 상기 조작된 유방 조직을 바이오프린팅에 의해 층층이 형성시켜 3차원 구조를 형성시킨다.
더욱 추가로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 유방 조직을 형성시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 상기 바이오-잉크의 하이드로젤을 제거하여 실질적으로 세포성 구조물을 남긴다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 상기 바이오-잉크 중에 포함된 세포 유형에 적합한 배지들의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 특정한 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지는 인간 섬유아세포 배지, 인간 내피세포 배지, 및 인간 지방세포 분화 배지를 포함한다.
본 명세서에 개시된 조작된 유방 조직은 다수의 유리한 용도를 갖는다. 예를 들어 암세포를 상기 조작된 유방 조직에 임의로 도입시켜 유방암 종양 모델을 형성시킨다. 추가의 예로서, 발암물질을 상기 조작된 유방 조직에 임의로 적용하여 유방암 모델을 생성시키기 위한 개시 사건을 제공한다. 더욱 추가의 예로서, 병든 유방암 모델을 생성시키기 위해서 병든 유방 조직을 제작한다. 추가로 상기 예에서, 상기 병든 유방 조직을 병원체, 예를 들어 하나 이상의 바이러스(바이러스-부하되도록) 또는 하나 이상의 세균(세균-부하되도록)에 임의로 노출시킨다. 상기와 같은 구조물은 종양학 분야의 연구 및 암 치료를 위한 치료법의 조사에 유용하다.
조작된 종양 모델
일부 실시태양에서, 본 명세서는 간질 조직 및 종양 조직을 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 간질세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 암세포를 포함한다. 본 명세서에 개시된 조작된 종양 모델은 구획화된 구조를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 종양 모델의 간질 조직은 상기 종양 조직을 둘러싼다. 추가의 실시태양에서, 상기 종양 모델의 간질 조직은 예를 들어 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 면에서 상기 종양 조직을 둘러싼다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 종양 모델의 간질 조직은 상기 종양 조직이 상기 간질 조직에 매몰되어 상기 조작된 종양 모델을 형성하도록 상기 종양 조직을 완전히 둘러싼다.
다수의 간질 세포가 상기 조작된 종양 모델에 포함시키기에 적합하다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 상기 조작된 종양 모델은 적합하게는 섬유아세포, 내피세포, 상피세포, 지방세포 및 면역세포, 예를 들어 대식세포 중 하나 이상을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 상기 세포는 척추동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포 또는 이들이 조합이다. 다수의 암세포가 상기 조작된 종양 모델에 포함시키기에 적합하다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 상기 조작된 종양 모델은 적합하게는 환자 종양으로부터 절제된 암세포주 및 원발암 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 내피세포 및/또는 면역세포, 예를 들어 대식세포를 추가로 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 세포를 바이오프린트한다. 추가의 실시태양에서, 바이오프린트된 간질 세포는 응집되어 조작된 간질 조직을 형성한다. 추가의 실시태양에서, 바이오프린트된 암세포는 응집되어 조작된 종양 조직을 형성한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 간질 조직 및 상기 종양 조직은 응집되어 조작된 종양 모델을 형성한다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 종양 모델은 제작시 또는 사용시에 사전-형성된 스캐폴드가 없거나 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 종양 모델은 신경이 통하지 않는다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 종양 모델은 온전한 신경계 및/또는 성숙한 신경 조직이 없다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 종양 모델은 온전한 혈관계 및/또는 성숙한 혈관구조가 없다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된 유방조직은 적혈구가 없다.
또한 일부 실시태양에서 본 명세서는 중간- 또는 고속-대량처리 분석, 예를 들어 약물 선별 분석, 약물 발견 분석, 약물 안전성 및 독성 분석, 약물 효능 분석 등에 사용하기에 적합한 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 어레이를 개시한다. 일부 실시태양에서, 상기 어레이는 조작된 종양 모델을 다중-웰 플레이트의 각 웰에 침착시켜 종양 모델들의 그리드를 형성시킴으로써 생성된다.
일부 실시태양에서, 상기 종양 모델은 유방암 종양 모델이다. 예를 들어, 상기와 같은 실시태양에서, 상기 간질 조직은 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 인간 유방 상피세포를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 간질 조직은 면역세포, 예를 들어 대식세포를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 인간 내피세포는 인간 제대정맥 내피세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 인간 내피세포는 인간 유방 내피세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 피하 지방세포 또는 지방세포 전구체, 예를 들어 중간엽 줄기세포 및/또는 지방전구세포로부터 유래된 지방세포이다. 추가로, 상기와 같은 실시태양에서, 상기 종양 조직은 유방암 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유방암 세포는 유방암 세포주의 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 유방암 세포는 절제된 환자 종양으로부터 유래된 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 조직은 내피세포 및/또는 면역세포, 예를 들어 대식세포를 추가로 포함한다.
신체 중 다수의 조직은 특징적인 "샘" 또는 "분비" 구조 및 기능을 가지며, 이때 상기 조직내 특화된 상피세포는 호르몬, 단백질, 효소, 또는 다른 세포 및 조직에 대해 국소 및/또는 전신 작용을 발휘하는 물질을 생성시킨다. 분비 조직은 외분비선일 수 있으며, 이때 생성되는 물질은 전형적으로는 상호연결된 도관계를 통해 상기 신체 밖으로 또는 하나의 위치에서 또 다른 위치로 운반된다. 여기에서 예는 외분비 췌장에 의한 소화 효소, 에크린샘에 의한 땀, 및 피지선에 의한 오일의 생성을 포함할 수 있다. 분비 조직은 또한 내분비선, 즉 내분비 췌장, 난소, 고환, 갑상선, 뇌하수체 및 부신을 포함한 신체의 호르몬-생산 조직일 수 있다.
분비 조직 중에는 하기의 특징들이 존재한다는 점에서 공통의 구조적 "테마"가 존재한다. 특화된 상피세포들은 응집체로 또는 관강내 중공 구조로 함께-국소화되며; 이들 세포는 하나 이상의 기전에 의해 조절 또는 분비 물질을 분비한다, 즉 상피 세포들의 공-결합은 상피세포의 상대적인 비율이 다른 세포 유형의 상대적인 비율보다 더 큰 '구획'을 형성한다. 상기 상피세포들의 구획은 지지 간질에 의해 둘러싸인다. 상기 조직 유형에 따라, 상기 간질의 조성이 변할 수 있다. 최소한, 조직 간질은 전형적으로 약간의 혈관세포 및 섬유아세포를 함유한다. 일부 조직에서, 상기 지지 간질은 또한 평활근세포, 고도로 특화된 중간엽세포, 신경세포, 면역세포, 림프세포 및/또는 지방세포를 포함할 수 있다. 상기 간질의 특정한 세포 성분들은 또한 섬유상 간질, 근육 간질, 관다발 간질 또는 지방조직의 별개의 영역들이 존재할 수 있다는 점에서 구획화될 수 있다. 상피세포-함유 종양은 종종 상술한 바와 유사한 공간 구성 패턴을 나타내며; 선암종, 관암종, 기형종 및 간모세포종이 간질 및 상피의 특징적인 구획화 패턴을 가질 수 있는 종양 유형의 모든 예이다. 마찬가지로, 구획화된 분비 조직에서 형성되는 종양은 전형적으로 구획화된 구성 패턴을 가지며, 여기에서 정상 조직 본래의 간질 및 상피 패턴이 일부 방식으로 붕괴되어, 정상 조직에 비해 상피:간질의 전체비의 일반적인 교란으로 인한 전체 조직 패턴의 이동이 일어난다. 상응하게, 일부 실시태양에서, 상기 종양 모델은 "샘" 또는 "분비" 조직암 종양 모델이다.
본 명세서에 개시된 조작된 종양 모델의 제작 방법은 바이오프린팅을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 압출 화합물, 예를 들어 하이드로젤 및 다수의 간질 세포 유형을 포함하는 간질 바이오-잉크의 제조를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 간질 세포 유형은 예를 들어 내피세포, 섬유아세포, 상피세포 및/또는 지방세포, 지방전구세포, 또는 지방세포와 지방전구세포의 조합을 포함한다. 지방전구세포의 경우에, 상기 세포를 분화 신호에 사전-노출시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 또한 하이드로젤 및 암세포 유형을 포함하는 종양 바이오-잉크의 제조를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 암세포 유형은 암세포주이다. 다른 실시태양에서, 상기 암세포는 절제된 환자 종양, 또는 환자 종양의 생검으로부터 유래된 원발암 세포이다. 일부 실시태양에서, 종양 바이오-잉크는 내피세포 및/또는 면역세포, 예를 들어 대식세포를 추가로 포함한다.
후속으로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크에 의해 둘러싸이고 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 종양 바이오-잉크를 침착시킴을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 종양 모델의 간질 조직은 예를 들어 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 면에서 상기 종양 조직을 둘러싼다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 종양 바이오-잉크는 상기 간질 바이오-잉크에 의해 완전히 둘러싸이고, 모든 면에서 상기 간질 바이오-잉크와 접촉한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오-잉크의 침착은 자동 또는 반자동 침착 장치, 예를 들어 바이오프린터에 의해 성취된다.
일부 실시태양에서, 상기 조작된 종양 모델은 바이오프린팅에 의해 층층이 형성되어 3차원 구조를 형성한다. 추가의 실시태양에서, 상기 간질 바이오-잉크 및 종양 바이오-잉크의 침착: 간질 바이오-잉크의 하나 이상의 층을 표면상에 침착시켜 간질 바이오-잉크의 제1 시트를 형성시키는 단계; 상기 간질 바이오-잉크의 제1 시트상에 간질 바이오-잉크의 연속적인 보더의 하나 이상의 층을 침착시켜 한면이 개방된 구획을 한정하는 단계; 상기 구획 중에 종양 바이오-잉크의 하나 이상의 층을 침착시켜 종양 바이오-잉크의 노드를 형성시키는 단계; 간질 바이오-잉크의 하나 이상의 층을 침착시켜 간질 바이오-잉크의 제2 시트를 형성시켜 상기 구획의 개방면을 폐쇄하는 단계를 추가로 포함한다.
추가로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지에서 성숙화는 하이드로젤을 제거하여 실질적으로 세포성 구조물을 남긴다.
일부 실시태양에서, 상기 하이드로젤은 가교결합성 또는 가역적으로 가교결합성이며 상기 방법은 상기 침착된 바이오-잉크를 상기 세포의 응집 전에 가교결합시켜 종양 모델 구조의 유지를 용이하게 함을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 세포 응집에 이은 효소적 분해에 의해 상기 가교결합된 하이드로젤을 제거함을 포함한다. 본 발명자들은 본 명세서에 개시된 종양 모델 구조가, 상기 구획하된 구조가 종종 상기 종양 모델의 융합 전에 상실되지 않으면서, 상기와 같은 가교결합성 압출 화합물(예를 들어 하이드로젤)을 사용하여 가장 잘 성취됨을 발견하였다.
유방암 종양 모델을 포함하여, 본 명세서에 개시된 조작된 종양 모델은 다수의 유리한 용도를 갖는다. 예를 들어 환자의 질병을 조사하기 위해 주문된 시험관내 종양 모델을 생성시키기 위해서 상기 환자의 종양으로부터 절제된 원발암 세포를 사용하여 종양 조직을 형성시킬 수 있었다. 상기와 같은 개인화된 (personalized) 종양 모델은, 가능한 치료법을 평가하고 환자의 질병을 치료하는데 유효한 치료법, 예를 들어 화학요법 화합물 및 생물학을 확인하는데 임의로 사용된다. 상기와 같은 구조물은 종양학 분야의 연구 및 암치료용 치료법의 조사에 유용하다.
유방종양 모델을 다중-웰 플레이트내에 직접 제작하였으며 에스트라디올, 프로제스틴, 프로락틴 및 HGF뿐만 아니라 표준 화학요법제 시스플라틴, 파클리탁셀, 메토트렉세이트 및 타목시펜을 포함한 신호 매개체에 대한 생물학적 반응 프로파일을 확립시키기 위해 사용하였다. 상기 신생조직내의 특정한 세포 유형에 대한 화학요법 약물의 효과를 형광 생/사 및 세포독성 분석 외에, 세포-유형 특이적 마커에 의한 염색에 의해 분석하였다. 성장 인자, 호르몬, 및 화학요법제에 대한 상기 3차원 유방암 종양 모델의 반응을 2차원 유방암 세포주의 반응과 비교하였다. 본 명세서에 개시된 모델이, 생체내 미세환경과 관련하여 암세포의 표적화에 보다 양호한 효율 및 정확성으로 새로운 항암 표적을 선별하는데 사용되는 기존 모델보다 우수하다.
본 명세서에 개시된 조작된 종양 모델의 이점은 비제한적으로 하기를 포함한다:
· 상기 종양 모델은 간질 및 암세포간에 상호작용을 갖는 구획화된 구조를 유지한다.
·상기 간질 구획의 바이오프린팅에 이어서, 내피 망상구조의 형성 및 지방세포의 분화가 관찰되었다.
·상기 종양 모델은 화학요법 화합물에 대해 본래-같은 약물 침투 및 반응을 나타내었다. 단리된 2차원 암세포가 3차원의 바이오프린트된 구조물에 통합된 세포보다, 동일한 지속기간 동안 동일한 용량의 타목시펜으로 처리되었을 때 타목시펜-유도된 독성에 더 민감하였다.
분석
일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된, 유방 조직을 포함한 조작된 조직 및 유방암 종양 모델을 포함한 종양 모델은 시험관내 분석에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시태양에서, "분석"은 유기 또는 생물학적 샘플(예를 들어 세포 응집체, 조직, 기관, 유기체 등) 중에서 물질(예를 들어 화학물질, 분자, 생화학적 물질, 약물 등)의 존재 또는 활성을 시험하거나 측정하기 위한 과정이다. 추가의 실시태양에서, 분석은 정량분석 및 정성분석을 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 정량분석은 샘플 중 물질의 양을 측정한다.
다양한 실시태양에서, 본 명세서에 개시된, 유방 조직을 포함한 조작된 조직 및 유방암 종양 모델을 포함한 종양 모델은 비제한적인 예로서, 상-기반 분석, 분비된 단백질의 측정, 마커의 발현 및 단백질의 생성에 사용하기 위한 것이다. 다양한 추가의 실시태양에서, 본 명세서에 개시된, 유방 조직을 포함한 조작된 조직 및 유방암 종양 모델을 포함한 종양 모델은 분자 결합(방사성리간드 결합 포함), 분자 흡수, 활성(예를 들어 효소 활성 및 수용체 활성 등), 유전자 발현, 단백질 발현, 수용체 활성 (agonism), 수용체 길항작용, 세포 신호전달, 세포사멸, 화학민감성, 형질감염, 세포 이동, 화학주성, 세포 생육력, 세포 증식, 안전성, 효능, 대사, 독성 및 오용 부담 중 하나 이상을 검출하거나 측정하는 분석에 사용하기 위한 것이다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된, 유방 조직을 포함한 조작된 조직 및 유방암 종양 모델을 포함한 종양 모델은 면역분석에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 면역분석은 경쟁 면역분석 또는 비경쟁 면역분석이다. 경쟁 면역분석에서, 예를 들어 샘플 중 항원은 항체와의 결합에 대해서 표지된 항원과 경쟁하며 이어서 상기 항체 부위에 결합된 표지된 항원의 양을 측정한다. 비경쟁 면역분석(또한 "샌드위치 분석"이라 칭한다)에서, 예를 들어 샘플 중 항원은 항체 부위에 결합하며; 후속으로, 표지된 항체는 항원에 결합하고 이어서 상기 부위상의 표지된 항체의 양을 측정한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된, 유방 조직을 포함한 조작된 조직 및 유방암 종양 모델을 포함한 종양 모델은 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, ELISA는 샘플 중 항체 또는 항원의 존재를 검출하는데 사용되는 생화학적 기법이다. ELISA에서, 예를 들어 특정 항원에 대해 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체가 사용된다. 추가의 예로서, 미지량의 항원을 갖는 샘플을 고체 지지체(예를 들어 폴리스티렌 미세적정 플레이트)상에 비-특이적으로(상기 표면에의 흡착을 통해) 또는 특이적으로("샌드위치" ELISA에서 동일한 항원에 특이적인 또 다른 항체에 의한 포획에 의해) 고정화시킨다. 더욱 추가의 예로서, 상기 항원을 고정화시킨 후에, 검출 항체를 가하여 상기 항원과 복합체를 형성시킨다. 상기 검출 항체를 예를 들어 효소에 공유 결합시키거나, 또는 상기 검출 항체 자체가 생물접합을 통해 효소에 결합된 2차 항체에 의해 검출된다.
예를 들어, 일부의 실시태양에서, 세포, 다세포 응집체 또는 조직의 어레이, 미세어레이 또는 칩이 약물 선별 또는 약물 발견에 사용된다. 추가의 실시태양에서, 조직의 어레이, 미세어레이 또는 칩은 약물 선별 또는 약물 발견을 위한 키트의 부분으로서 사용된다. 일부 실시태양에서, 각각의 혈관벽 분절은 생체적합성 다중-웰 용기의 웰내에 존재하며, 여기에서 상기 용기는 하나 이상의 자동 약물 선별 과정 및/또는 장치에 적합하다. 추가의 실시태양에서, 자동 약물 선별 과정 및/또는 장치는 컴퓨터 또는 로봇-지원된 임의의 적합한 과정 또는 장치를 포함한다.
일부 실시태양에서, 약물 선별 분석 또는 약물 발견 분석을 위한 분석을 임의의 치료 분야에 잠재적으로 유용한 약물의 연구 또는 개발에 사용한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 적합한 치료 분야는 비제한적인 예로서 감염성 질병, 혈액학, 종양학, 소아과학, 심장병학, 중추신경계 질병, 신경학, 위장병학, 간장학, 비뇨기학, 불임, 안과학, 신장병학, 정형외과학, 통증 조절, 정신병학, 호흡기학, 백신, 상처 치유, 생리학, 약물학, 피부과학, 유전자 요법, 독성학 및 면역학을 포함한다.
일부 실시태양에서, 치료법 선별 분석 또는 치료법 발견 분석을 위한 분석을 사용하여 특정 개체 또는 개체들의 그룹의 질병 또는 상태에 잠재적으로 유용한 치료법을 확인한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 방법은 특정 개체의 세포를 사용하여 조직, 질병 모델 또는 종양 모델을 조작함을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 방법은 후보 치료제를 상기 조직 또는 모델에 적용하고; 상기 세포의 생육력을 측정하고; 상기 세포의 측정된 생육력을 근거로 상기 개체에 대한 치료제를 선택함을 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 후보 치료제는 하나 이상의 화학요법 화합물, 하나 이상의 방사성약학 화합물, 방사선요법, 또는 이들의 조합이다. 상응하게, 본 명세서는 개체 또는 개체들의 그룹에 대해 약물을 개체화하는 방법을 개시한다.
조작된 지방세포-함유 조직
본 명세서에 개시된 바와 같이, 선행의 조직 제작 기술들은 주로 지방세포의 취약성 및 손상에 대한 그의 민감성으로 인해 충분히 생육성인 분화된 지방세포를 함유하는 조작된 조직을 적합하게 제공하지 못했다. 본 명세서는 일부 실시태양에서 생육성의 분화된 지방세포를 포함하는 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 개시한다. 생육성 지방세포는 일부 조직에서 본래-같은 미세구조의 형성에 중요한 인자이다.
일부 실시태양에서, 상기 조직은 지방 풍부 또는 지방-의존적인 조직이다. 추가의 실시태양에서, 상기 조직은 지방 조직이다. 일부 실시태양에서, 상기 조직은 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 이상의 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다. 특히, 비제한적인 실시태양에서, 상기 조직은 적어도 약 5% 또는 적어도 약 10%의 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다.
일부 실시태양에서, 예를 들어 상기 지방세포의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 이상이 제작-후 생육성이다. 특히, 비제한적인 실시태양에서, 상기 지방세포의 적어도 약 50% 또는 적어도 약 75%는 제작-후 생육성이다. 다양한 실시태양에서, 상기 지방세포 생육력은 제작-후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 이상까지 연장된다. 추가의 실시태양에서, 상기 지방세포는 제작-후 검출 가능한 양의 렙틴을 분비한다. 다양한 실시태양에서, 상기 렙틴 분비는 제작-후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 이상까지 연장된다.
일부 실시태양에서, 상기 지방세포를 바이오프린트한다. 추가의 실시태양에서, 바이오프린트된 지방세포는 응집되어 조작된 조직을 형성한다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 지방세포-함유 조직은 제작시 또는 사용시에 사전-형성된 스캐폴드가 없거나 실질적으로 없다. 일부 실시태양에서, 상기 조작된 지방세포-함유 조직은 신경이 통하지 않는다.
일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 피하 지방세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 지방세포는 지방세포 전구세포, 예를 들어 중간엽 줄기세포(골수 유래된 중간엽 줄기세포를 포함한다) 또는 지방전구세포로부터 유래된다.
본 명세서에 개시된 방법은 다수의 조직 및 종양 모델에서 핵심 간질 성분인 생육성의 분화된 지방세포를 함유하는 조직의 바이오프린팅을 허용한다.
본 명세서에 개시된 조작된 지방조직의 제작 방법은 바이오프린팅을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 지방세포 전구체, 예를 들어 줄기 세포 또는 지방전구세포에 지방세포 분화 신호를 제공함을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 지방세포 전구체, 예를 들어 줄기세포 또는 지방전구세포를 바이오프린팅시에 적어도 부분적으로 사전-분화시킨다.
후속으로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 압출 화합물, 예를 들어 하이드로젤, 지방전구세포, 및 적어도 하나의 다른 세포 유형, 예를 들어 내피세포를 포함하는 바이오-잉크의 제조를 포함한다.
추가로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 바이오-잉크를 자동 또는 반자동 침착 장치, 예를 들어 바이오프린터를 통해 표면상에 침착시킴을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 조작된 조직은 바이오프린팅에 의해 층층이 형성되어 3차원 구조를 형성시킨다.
추가로, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 구조물을 형성시킴을 포함하며, 상기 구조물은 생육성의 분화된 지방세포를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 세포 배양 배지에서의 성숙화는 하이드로젤을 제거하여 실질적으로 세포성 구조물을 남긴다.
도 23에 관하여, 지방조직을 본 명세서에 개시된 방법을 통해 바이오프린트하였다. 이 실시태양에서 상기 지방세포는 오일 레드 O에 의한 염색에 의해 밝혀진 바와 같이, 분화되었고, 생육성이며 특징적인 지질 침착물을 생성하였다.
실시예
하기의 예시적인 실시예들은 본 명세서에 개시된 소프트웨어 애플리케이션, 시스템 및 방법들의 실시태양을 나타내며, 어떠한 방식으로도 제한을 의미하지 않는다.
실시예 1 - 조작된 인간 유방조직 모델
제작
3 ㎜ x 3 ㎜ x 3 ㎜ 치수의 6-층 입방체를 도 1에 도시된 도식적 다이어그램에 따라 6-웰 조직 배양 플레이트 중의 트랜스웰(Transwell) 멤브레인상에 바이오프린트하였다(구조물 1). 기부의 2개 층 및 상부의 2개 층은 75% 정상적인 인간 유방 섬유아세포(NHMF) 및 25% 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)로 구성되었다. 중간의 2개 층은 알기네이트 및 젤라틴-함유 하이드로젤(노보젤® 2.0 시스템; 오가노보, 미국 캘리포니아주 소재) 중에 재현탁된 인간 유방 상피세포(HMEC)의 코어를 둘러싸는 75% NHMF/25% HUVEC의 바이오프린트된 사각형으로 구성되어 50 내지 300 x 106 세포/㎖을 포함하는 바이오-잉크를 생성시켰다. 바이오프린팅에 이어서 바로, 구조물을 2분 동안 50 mM CaCl2와 인큐베이션하고, 6일 동안 배양하였다. 배양 6일째에, 상기 구조물을 알기네이트 분해효소와 함께 인큐베이션하여 하이드로젤을 분해시키고 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다.
결과
세포-유형 특이적 마커에 대한 조직학적 염색에 의해 구조물 1의 평가를 수행하였다. 구조물 1에 대한 전형적인 H&E 염색을 도 2에 도시한다. 도 2에 관하여, 상기 H&E 염색된 표본을 제작-후 7일째에 제조하였으며; 상부 열(A-D)은 2X 배율을 도시하고 기부 열(E-H)은 20X 배율을 도시하며; 좌측에서 우측으로 첫 번째 컬럼(A 및 E)은 하이드로젤을 포함하고, 두 번째 컬럼(B 및 F)은 하이드로젤을 포함하며 분해효소로 처리되었고, 세 번째 컬럼(C 및 G)은 ECM을 포함하고, 마지막 컬럼(D 및 H)은 ECM을 포함하며 분해효소로 처리되었다.
구조물을 인간 유방 섬유아세포의 마커들인 비멘틴 및 TE7에 대해 염색하였으며(제작-후 7일째), 상기 마커들은 상기 구조물의 외부 부분에 국소화되었고 HMEC 세포가 바이오프린트된 내부로부터 제외되었다. 도 3A 내지 3D를 참조하시오. 도 3A 내지 3D 각각에서, 상부 열(A-C)은 비멘틴(녹색)을 도시하고 기부 열(D-F)은 TE7(녹색)을 도시하며; 첫 번째 컬럼(A 및 D)은 10X 배율을 도시하고 두 번째 컬럼(B 및 E)은 20배 배율을 도시하며, 마지막 컬럼(C 및 F)은 60X 배율을 도시한다. 도 3A의 구조물은 ECM을 포함하고, 도 3B의 구조물은 하이드로젤을 포함하며, 도 3C의 구조물은 ECM을 포함하고 분해효소로 처리되었으며, 도 3D의 구조물은 하이드로젤을 포함하고 분해효소로 처리되었다.
상기 구조물 중의 NHMF 및 HMEC 세포의 상대적인 위치를 시각화하기 위해서, 조직을 DAPI(청색) 외에 비멘틴(적색) 및 판 사이토케라틴(녹색)에 대한 항체로 염색하였다. 도 4를 참조하시오. 예상된 바와 같이, 상피세포는 상기 구조물의 중심을 향해 농축되었다. 도 4에 관하여, 첫 번째 컬럼(A, H 및 L)은 5X 배율을 도시하고, 두 번째 컬럼(B, E, I 및 M)은 10X 배율을 도시하며, 세 번째 컬럼(C, F, J 및 N)은 20X 배율을 도시하고, 마지막 컬럼(D, G 및 K)은 60X 배율을 도시하며; 제1열(A-D)의 구조물은 ECM을 포함하고, 제2열(E-G)의 구조물은 ECM을 포함하며 분해효소로 처리되었고, 제3열(H-K)의 구조물은 하이드로젤을 포함하고, 마지막 열(L-N)의 구조물은 하이드로젤을 포함하고 분해효소로 처리되었다.
상기 구조물 중의 HNMF 및 HUVEC 세포의 상대적인 위치를 시각화하기 위해서, 조직을 DAPI(청색)뿐만 아니라 비멘틴(적색) 및 CD31(녹색)에 대한 항체로 염색하였다. 도 5를 참조하시오. 도 5에 관하여, 첫 번째 컬럼(A, D, G 및 J)은 10X 배율을 도시하고, 두 번째 컬럼(B, E, H 및 K)은 20X 배율을 도시하며, 마지막 컬럼(C, F, I 및 L)은 60X 배율을 도시하고; 제1열(A-C)의 구조물은 ECM을 포함하고, 제2열(D-F)의 구조물은 ECM을 포함하며 분해효소로 처리되었고, 제3열(G-I)의 구조물은 하이드로젤을 포함하고, 마지막 열(J-L)의 구조물은 하이드로젤을 포함하고 분해효소로 처리되었다.
CD31+ 세포의 확고한 망상구조가 모든 분석된 구조물에서 발견되었으며, 이때 일부 영역은 미세혈관 형성의 증거를 나타내었다. 상기 CD31+ 세포는 주로 상기 구조물의 외부 표면을 향해 발견된 반면, 상기 구조물의 내부에는 약 1 내지 2 ㎜에 있는 것으로 밝혀졌다. 전체 ECM 침착을 평가하기 위해서, 마쏭의 트리크롬 염색을 수행하였다. 도 6을 참조하시오. 분해효소 처리된 조직에서 현저한 ECM 침착이 관찰되었다. 도 6에 관하여, 첫 번째 컬럼(A 및 D)은 5X 배율을 도시하고, 두 번째 컬럼(B 및 E)은 10X 배율을 도시하며, 마지막 컬럼(C 및 F)은 20X 배율을 도시하고; 제1열(A-C)의 구조물은 ECM을 포함하고 분해효소로 처리되었으며, 제2열(D-F)의 구조물은 하이드로젤을 포함하고 분해효소로 처리되었다.
실시예 2 - 지방 조직을 갖는 조작된 인간 유방 조직 모델
제작
5 ㎜ x 5 ㎜ x 500 ㎛ 치수의 상자를 도 7A에 도시된 바와 같이 6-웰 조직 배양 플레이트 중에 트랜스웰 멤브레인상에 바이오프린트하였다(구조물 2). 먼저, 90% 골수-유래된 중간엽 줄기세포(bmMSC) 및 10% HUVEC로 구성된 500 ㎛ 간질 바이오-잉크 원통을 바이오프린트하여 상자 모양을 형성시켰다. HMEC 세포를 10% 젤라틴 하이드로젤과 혼합하여 상피 바이오-잉크를 형성시키고 상기 간질 바이오-잉크 상자의 중간에 바이오프린트하였으며, 여기에서 상기 HMEC 바이오-잉크는 상기 간질 바이오-잉크 보더와 접촉하지 않았다. 75% NHMF 및 25% HUVEC로 구성된 세 번째 바이오-잉크를 사용하여 상기 중간의 바이오-잉크 보더와 HMEC 바이오-잉크 사이의 공간을 채웠다. 구조물을 10일 동안 인큐베이션하였다. 도 7B는 제작-직후의 구조물 2를 묘사하고 도 7C 및 7D는 제작-후 10일째의 구조물 2를 묘사한다. 상기 bmMSC에, 인큐베이션 중에 지방세포 분화 신호를 제공하여 생육성의 분화된 인간 지방세포를 생성시켰다.
결과
구조물 2의 평가를 세포-유형 특이성 마커에 대한 조직학적 염색에 의해 수행하였다. 구조물 2의 전형적인 H&E 염색을 도 8에 도시한다. 도 8에 관하여, 상기 H&E 염색된 표본을 제작-후 10일째에 제조하였으며; 제1열(A 및 B)은 5X 배율을 도시하고, 제2열(C 및 D)은 10X 배율을 도시하며 마지막 열(E 및 F)은 20X 배율을 도시한다.
다수의 상이한 세포 마커에 대한 염색을 도 9에 도시한다(CD31, 내피세포; 비멘틴, 섬유아세포; FABP4, 지방세포; 판 사이토케라틴, 상피). 오일 레드 O 염색을 사용하여 상기 구조물의 외부상의 bmMSC로부터 분화된 지방세포 중의 지질 소적의 존재를 입증하였다.
도 9에 관하여, 제1열(A-D)은 5X 배율을 도시하고, 제2열(E-H)은 10X 배율을 도시하고, 제3열(E-H)은 20X 배율을 도시하고, 마지막 열(M)은 60X 배율을 도시하며; 첫 번째 컬럼(A, E 및 I)의 구조물은 CD31(녹색) 비멘틴(적색)에 대해 염색되었을 뿐만 아니라 DAPI(청색)로 처리되었고, 두 번째 컬럼(B, F 및 J)의 구조물은 FABP4(녹색)에 대해 염색되었을 뿐만 아니라 DAPI(청색)로 처리되었고, 세 번째 컬럼(C, G 및 K)의 구조물은 판 사이토케라틴(녹색) 비멘틴(적색)에 대해 염색되었을 뿐만 아니라 DAPI(청색)로 처리되었고, 마지막 컬럼(D, H, L 및 M)의 구조물은 오일 레드 O(동결-절단됨)를 사용하여 염색되었다.
모든 세포 유형이 상기 구조물 중에 존재하였으며, CD31+ 내피세포의 망상구조가 상기 구조물 전체를 통해 형성되었다. 상피는 상기 구조물의 내부로 한정되었다. 지방세포 분화 마커(오일 레드 O 및 FABP4)는 상기 구조물의 외부를 향해서 발견되었으며, 이는 바이오-잉크 중 bmMSC-유래된 지방세포의 존재와 일치하였다.
실시예 3 - 조작된 인간 유방암 종양 모델
MCF7 유방암 세포 및 인간 제대정맥 내피(HUVEC) 세포로 구성된 암세포 노드가 모든 면이 정상적인 인간 유방 섬유아세포(NHMF), HUVEC 세포, 및 피하 지방전구세포(SPA)로 구성된 간질 구획에 의해 둘러싸인 바이오프린트된 유방암 구조물을 생성시켰다. 세포를 가역적으로 가교결합성인 젤라틴-함유 하이드로젤(노보젤® 3.0 시스템; 오가노보, 미국 캘리포니아주 소재)과 결합시켜 바이오-잉크를 제조하였다.
도 10A는 구조물의 구성을 묘사하는 도식적 다이어그램을 도시한다(구조물 3). 도 10B는 바이오프린팅 및 하이드로젤의 가교결합 직후 상기 구조물의 사진을 도시한다. 도 10C는 상기 하이드로젤을 제거하기 위한 효소적 처리 후 2일째의 상기 구조물을 도시하며, 여기에서 상기 구조물은 조직의 축합 및 평활한 고체 소결절 (solid nodule)의 생성을 나타낸다.
세포 배양
정상적인 인간 유방 섬유아세포(NHMF)를 사이언셀(ScienCell)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)로부터 획득하고 제조사의 설명에 따라 배양하였다. 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)를 BD 바이오사이언시즈(미국 캘리포니아주 산호세 소재)로부터 획득하고 EGM-2 내피 세포 배지(론자(Lonza), 미국 뉴저지주 알렌데일 소재)에서 배양하였다.
피하 지방전구세포(SPA)를 젠-바이오(Zen-Bio)(리써치 트라이앵글 파크(Research Triangle Park), 미국 노쓰캐롤라이나주 소재)로부터 획득하고 증식 (expansion)을 위해 피하 지방전구세포 배지에서 배양하였다. 바이오프린팅 3일 전에, 세포를 지방세포 분화 배지(젠-바이오)에서 배양하였다. 도 11은 바이오프린팅 당일까지 세포내에서 축적되는 것으로 보이는 초기 지질 소적들(화살표)을 도시한다.
MCF7 세포를 시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스 소재) 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: 미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 획득하였으며 제조사의 설명에 따라 배양하였다.
바이오프린팅
상기 구조물들의 간질 구획은 65% NHMF, 25% HUVEC 및 10% SPA(부분적으로 사전-분화된)로 구성되었다. 상기 구조물들의 암 구획은 75% MCF7, 25% HUVEC로 구성되었다. 각각의 구획에 대해서, 세포를 지시된 비로 함께 혼합하고 노보젤® 3.0 중에 150 x 106 세포/㎖의 농도로 재현탁시켰다. 구조물들을 3 ㎜ x 3 ㎜ x 0.75 ㎜ 치수의 3층 구조로 프린트하였다. 바이오프린팅에 이어서 바로, 구조물들을 가교결합을 통해 안정화시켰다. 2분 후에, 칼슘 가교결합 용액을 흡출하고 배양 배지로 대체하였다. 배양 2일 후에, 구조물들을 밤새 배양 배지 중에 용해된 효소로 처리하여 노보젤® 3.0을 제거하였다. 이어서 구조물들을 추가로 9일까지 인큐베이션하였다.
화학요법 화합물에 의한 구조물의 처리
모든 화합물을 시그마-알드리치로부터 획득하였으며 DMSO에 용해시켰다. 화합물을 배지 중에 10 μM 또는 100 μM의 최종 농도로 희석하였다. 최종 DMSO 농도는 0.1% 였으며, 이를 비히클 처리에 사용하였다. 구조물을 알라마블루(alamarBlue) 분석(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 또는 셀티터 글로(CellTiter Glo) 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 대사 활성에 대해 평가하였다. 구조물을 표지된 화합물 흡수 연구를 위해 24시간 동안, 또는 대사 활성의 평가를 위해 4일 동안 처리하였다.
렙틴 ELISA
구조물로부터의 순화 배지 (conditioned medium0를 9일 동안 매일 수집하였다. 배지를 1:2로 희석하고 제조사의 설명(라이프 테크놀로지스)에 따라 렙틴 분비에 대해 평가하였다.
조직학
구조물을 동일 반응계에서 (in situ) 실온에서 24시간 동안 2% 파라포름알데하이드 용액(PBS 중의 2% 파라포름알데하이드, 10 mM 염화 칼슘, 50 mM 슈크로스) 중에서 고정시켰다. 24시간 후에, 상기 고정액을 제거하고 70% 에탄올로 대체하였다. 구조물을 자동 조직 프로세서(티슈-텍(Tissue-Tek), 사쿠라 파인텍 유럽(Sakura Finetek Europe) BV, 네덜란드 소재)를 사용하여 파라핀 매몰을 위해 처리하였다. 파라핀을 침윤시킨 다음, 구조물을 파라핀 몰드에 매몰하고 5 ㎛ 절편을 회전 마이크로톰(정 바이오컷(Jung Biocut) 2035, 레이카 마이크로시스템스, 미국 일리노이주 버팔로 그로브 소재)을 사용하여 생성시켰다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해서, 슬라이드를 자일렌으로 탈랍시키고 100%, 95%, 70%, 및 50% 에탄올을 통해 재수화시키고 증류수로 세정하였다. 슬라이드를 길(Gill)의 헤마톡실린(피셔 사이언티픽, 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재)에 침지시켰다. 증류로수 세정한 다음, 슬라이드를 0.2% v/v 수산화 암모늄 중에 짧게 침지시켰다. 증류수로 세정 후에, 슬라이드를 에오신 수용액(아메리칸 마스터테크(American MasterTech))에 침지시켰다. 이어서 슬라이드를 에탄올 구배를 통해 탈수시키고, 자일렌 중에서 세척하고, 수지성 봉입제(사이토씰(CytoSeal), 피셔 사이언티픽)로 봉입시켰다. 마쏭의 트리크롬 염색을 제조사의 설명(아메리칸 마스터테크)에 따라 수행하였다.
면역조직화학 분석을 위해서, 슬라이드를 자일렌으로 탈랍시키고 이를 최종적으로 증류수 중에서 세척하기 전에 100, 95, 70 및 50% 에탄올 중에 연속적으로 침지시켜 재수화시켰다. 재수화된 절편들에 표준 전자레인지 오븐을 사용하여 10 mM 나트륨 시트레이트 pH 6.0 중의 열-매개된 항원 복구를 수행하여 상기 용액과 슬라이드를 비등전까지 가열한 다음 30분 동안 서서히 냉각시켰다. 이어서 슬라이드를 1시간 동안 트리스-완충된 염수(TBS) 중 10% 염소 혈청으로 차단시킨 다음, 4 ℃에서 밤새 1차 항체와 인큐베이션하였다. 하기의 1차 항체들이 사용되었다: 마우스 항-사이토케라틴 8(1:100; 애브캠(Abcam), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재); 토끼 항-CD31(1:100; 애브캠); 마우스 항-TE7(1:250; EMD 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재); 마우스 항-콜라겐 4(1:250; 애브캠). 이어서 절편들을 0.1% 트윈 20이 있는 TBS 중에서 3회 세척하고 TBS 중에서 1:200 희석된 알렉사플루오르(AlexaFluor) 488 또는 알렉사플루오르 568-접합된 2차 항체(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 절편들을 TBS-0.1% 트윈20으로 3회 세척하고, 증류수로 세정하고, DAPI-함유 봉입제(벡터 랩스(Vector Labs), 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)로 봉입시켰다.
동결-절단용 구조물의 제조
구조물을 DPBS로 1회 세정하고, 티슈-텍 OCT 화합물(사쿠라 파인텍 유럽 B.V., 네덜란드 소재) 중에 침지시키고, 급속 동결시켰다. 이어서 동결된 블럭을 크라이오스탯(레이카 크라이오컷(Leica Cryocut) 1800, 레이카 마이크로시스템스)상에서 5 ㎛로 절단하였다. 절단된 슬라이드를 -20 ℃ 액체 아세톤 중에서 순간 고정시키고 실온에서 20분 동안 공기 건조시켰다. 오일 레드 O 염색을 위해서, 슬라이드를 증류수 중에서 재수화시키고 60% 이소프로판올 중에 2분 동안 침지시켰다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 60% 이소프로판올 중의 0.3% w/v 오일 레드 O(시그마-알드리치)로 염색시킨 다음, 1분 동안 60% 이소프로판올로 세정하였다. 슬라이드를 길(Gill)의 헤마톡실린 중에 짧게 침지시켜 대비염색시켰다. 슬라이드를 증류수로 세정하고 수성 매질(아메리칸 마스터테크)로 봉입시켰다. 형광 화합물의 영상화를 위해, 슬라이드를 DAPI-함유 봉입제로 봉입시켰다.
현미경검사
H&E, 트리크롬, 및 오일 레드 O-염색된 슬라이드를 자이스 액시오스콥(Zeiss Axioskop) 현미경(자이스, 독일 예나 소재)을 사용하여 영상화하였다. 인사이트(Insight)2 카메라 및 스폿(Spot) 5.0 소프트웨어(다이아그노스틱 인스트루먼츠 인코포레이티드(Diagnostic Instruments, Inc.), 미국 미시간주 스털링 하이츠 소재)를 사용하여 상들을 포착하였다. 형광 염색된 슬라이드를 자이스 액시오이미저 현미경으로 영상화하고 상들을 자이스 ICM-1 카메라 및 젠 프로(Zen Pro) 소프트웨어로 포착하였다.
결과
상기 바이오프린트된 유방암 종양 모델은 시간이 지남에 따라 렙틴 분비를 나타내었다. 바이오프린트된 유방암 구조물로부터의 순화 배지를 9일동안 매일 수집하고 ELISA 분석에 의해 렙틴 분비에 대해 분석하였다. 렙틴은 상기 9일의 배양 기간 전체를 통해 생성되었으며, 이는 바이오프린팅에 이은 지방전구세포의 연속적인 분화를 반영한다. 도 12를 참조하시오.
표지된 화학요법 화합물에 의한 상기 바이오프린트된 암 종양 모델의 처리는 상기 구조물 구조의 유지 및 약물 침투의 본래-같은 패턴을 나타내었다. 구조물을 24시간 동안 100 μM 화합물로 처리하고 전체를 통해 동결-절단하여 표지된 약물의 침투를 평가하였다. 도 13A는 MCF7 유방암 세포의 마커로서 사이토케라틴 8에 대해 염색된 조직 절편을 도시하며, 이는 상기 구조물의 중심에서 암세포의 체류를 암시한다. 도 13B는 오레곤그린(OregonGreen) 488 형광단으로 단독 처리한 구조물을 도시하며, 상기 구조물 전체를 통해 형광이 관찰되었다. 도 13C는 오레곤그린 488-파클리탁셀로 처리된 구조물을 도시하며, 상기 화합물의 침투는 상기 구조물의 외부 ∼200 ㎛로 제한되었다.
약물 처리에 이은 구조물 생육력의 평가는 본래-같은 약물 반응을 입증하였다. 구조물을 10 μM 화합물로 3일 동안 처리한 다음 100 μM 화합물로 24시간 동안 처리하였다. 도 14에 관하여, 생육력을 알라마블루 분석에 의해 평가하였으며, 이때 보다 높은 형광 강도는 대사적으로 활성인 세포를 가리킨다. 시스플라틴 및 파클리탁셀은 배지 또는 비히클 대조용에 비해 구조물 생육력을 감소시켰다.
실시예 4 - 조작된 인간 유방암 종양 모델
제작
유방암 종양 모델을 도 15A에 도시된 도식적 다이어그램에 따라 바이오프린트하였다(구조물 4). 상기 유방암 종양 모델은 생리학적으로-관련된 간질층(인간 중간엽 줄기세포로부터 분화된 인간 지방세포, 인간 유방 섬유아세포 및 인간 내피세포를 포함하였음)에 의해 둘러싸인 인간 유방암 세포의 소결절을 포함하였다. 상기 지방세포는, 상기 바이오-잉크의 제조 및 바이오프린팅 전에 단리되고 지방세포 분화 신호에 노출된 중간엽 줄기세포로부터 유래되었다. 도 15B는 바이오프린팅 직후의 상기 구조물의 사진을 도시한다.
결과
구조물 4의 조직학적 분석을 세포 유형의 조직 구조 및 상대적인 위치를 평가하기 위해서 세포-유형 특이적인 마커를 염색함으로써 수행하였다. 도 16에 관하여, 상부 열은 H&E 염색(A) 및 마쏭의 트리크롬 염색(B)을 묘사하며, 여기에서 유방암 세포는 셀트랙커 그린(CellTracker Green) CMFDA로 표지되었다. 도 16C는 내피세포(CD31, 적색), 암세포(녹색)에 대해 염색되고 DAPI로 추가로 처리된 조직을 도시한다. 도 16D는 섬유아세포(TE7, 적색), 암세포(녹색)에 대해 염색되고 DAPI로 추가로 처리된 조직을 도시한다. 도 16E는 콜라겐 IV(적색), 암세포(녹색)에 대해 염색되고 DAPI로 추가로 처리된 조직을 도시한다. 도 17에 관하여, 상부 열은 H&E 염색(A) 및 마쏭의 트리크롬 염색(B)을 묘사하며, 여기에서 콜라겐은 청색 염색에 의해 나타낸다. 기부 열에서, E-카데린(녹색) 및 TE7(적색) 염색은 각각 암세포 및 섬유아세포를 가리키고(C) CD31(녹색) 염색은 섬유아세포(TE7, 적색)를 함유하는 간질 구획 중의 미세혈관 형성 영역을 가리킨다(D).
상기 구조물 중의 지방세포는 렙틴을 분비하였으며, 이는 바이오프린트된 구조물내에서 지방세포의 계속된 분화를 암시한다. 도 18에 관하여, 구조물로부터의 순화 배지를 24시간마다 수집하고 ELISA에 의해 렙틴 분비에 대해 평가하였다. 도시된 데이터는 평균±표준 편차를 나타낸다.
구조물 대 구조물 가변성을 평가하기 위해서, 대사 분석을 3개의 유방암 종양 모델상에서 수행하였다. 도 19에 관하여, 3개의 개별적인 종양 모델을 시간의 함수로서 알라마블루 기질의 대사에 대해 평가하고(A) 3개의 개별적인 종양 모델을 셀티터 글로 시약에서 용해시키고 상대적인 루시페라제 강도에 대해 평가하였다(B). 낮은 구조물 대 구조물 가변성을 세포 대사 분석에 의해 관찰하였다.
상기 유방암 종양 모델을 약물 반응을 입수하기 위해서 화학요법 화합물에 노출시켰다. 도 20에 관하여, 2차원 세포 배양물에서 증식시킨 유방암 세포(A) 및 상기 바이오프린트된 유방암 종양 모델(B)을 배지 단독, DMSO, 또는 10 μM 타목시펜으로 48시간 동안 처리하고 ATP 루시페라제 분석에 의해 생육력에 대해 평가하였다. 각각의 그래프에 대해서, *는 대조용과 비교된 처리에 대해서 p<0.05를 가리킨다. 단리된 2차원 암세포는 동일한 지속기간 동안 동일한 용량의 타목시펜으로 처리시 3차원의 바이오프린트된 구조물에 통합된 세포보다 타목시펜-유도된 독성에 더 민감하였다.
도 21에 관하여, 100 μM 화학요법 화합물에 의한 처리에 따른 대사 활성을 또한 평가하였다. MCF7 세포 단독(검은색 막대) 또는 유방암 종양 모델(회색 막대)을 48시간 동안(MCF7) 또는 4일 동안 매일(3차원 바이오프린트된 유방암 종양 모델) 화합물로 처리하고 셀티터 글로 ATP 루시페라제 분석에 의해 생육력에 대해 평가하였다. 도시된 데이터는 비히클 대조용±표준 편차의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 22에 관하여, 바이오프린트된 조직을 비히클(A-C) 또는 100 μM 시스플라틴(D-F)으로 4일 동안 처리하였다. 첫 번째(A 및 D) 및 두 번째(B 및 E) 컬럼은 TUNEL 염색(녹색) 및 암세포에 대한 마커(CK8, 적색)에 의해 세포사멸에 대해 평가된 조직을 묘사한다. 마지막(B 및 E) 컬럼은 TUNEL 염색(녹색) 및 섬유아세포에 대한 마커(TE7, 적색)에 의해 세포사멸에 대해 평가된 조직을 묘사한다. 도 22는 시스플라틴이 암 구획에서보다 바이오프린트된 조직의 간질 구획에서 보다 큰 세포사멸을 유도함을 입증한다.
실시예 5 - 조작된 지방 조직
제작
90% 골수-유래된 중간엽 줄기세포(지방세포에 대한 전구체) 및 10% HUVEC로 구성된 바이오-잉크를 제조하였다. 상기 잉크를 노보젠 바이오프린터(오가노보; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로, 다른 세포 유형은 존재하지 않는 상자로서 침착시켰으며 10일 동안 지방생성 분화 배지에서 성숙시켰다.
결과
상기 성숙된 지방조직을 중성 지질의 마커인 오일 레드 O로 염색하였다. 도 23은 상기 염색된 조직의 광학현미경 사진을 도시하며 이는 현저한 지질 생성을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시태양들을 본 명세서에 도시하고 개시하였지만, 상기와 같은 실시태양이 단지 예로서 제공됨은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 다수의 변이, 변화 및 치환들은 이제 본 발명으로부터 이탈됨 없이 당해 분야의 숙련가들에게 떠오를 것이다. 본 명세서에 개시된 발명의 실시태양들에 대한 대안을 본 발명의 실시에 사용할 수 있음은 물론이다.

Claims (78)

  1. 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델로,
    a. 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 유방 간질 조직; 및
    b. 유방암 세포 및 인간 내피세포를 포함하고, 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸인 유방암 종양 조직
    을 포함하여 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하나;
    단 상기 간질 조직이 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 상기 종양 조직이 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었거나, 또는 상기 간질 조직 및 상기 종양 조직이 모두 그들 각각의 바이오-잉크로부터 바이오프린트된, 유방암 모델.
  2. 제1항에 있어서,
    사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 유방암 모델.
  3. 제1항에 있어서,
    유방암 세포가 유방암 세포주로부터 유래되는 유방암 모델.
  4. 제1항에 있어서,
    유방암 세포가 환자 종양으로부터의 원발암 세포인 유방암 모델.
  5. 제1항에 있어서,
    유방암 종양 조직이 모든 면이 유방 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하는 유방암 모델.
  6. 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델의 제작 방법으로, 상기 방법은,
    a. 간질 바이오-잉크를 제조는 단계로서, 상기 간질 바이오-잉크가 다수의 간질 세포 유형을 포함하고, 상기 간질 세포 유형이 압출 화합물, 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는, 단계;
    b. 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계로서, 상기 종양 바이오-잉크가 압출 화합물 및 유방암 세포 유형을 포함하는, 단계;
    c. 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계; 및
    d. 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 압출 화합물을 제거하고 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시키는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    유방암 세포 유형이 유방암 세포주를 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    암세포 유형이 환자 종양으로부터의 원발 유방암 세포를 포함하는 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    세포 배양 배지가, 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육 또는 유지를 지지하는 가용성 성분들을 포함하는 방법.
  11. 제6항에 있어서,
    간질 바이오-잉크 및 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계가
    a. 표면상에 간질 바이오-잉크의 제1 시트를 침착시키는 단계;
    b. 상기 간질 바이오-잉크의 제1 시트상에 간질 바이오-잉크의 연속적인 보더를 침착시켜 한면이 개방된 구획을 한정하는 단계;
    c. 상기 구획 중에 종양 바이오-잉크의 노드를 침착시키는 단계; 및
    d. 간질 바이오-잉크의 제2 시트를 침착시켜 상기 구획의 개방면을 폐쇄하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  12. 개체에서 암 치료제를 확인하는 방법으로, 상기 방법은,
    a. 다수의 간질 세포 유형을 포함하는 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    b. 상기 개체로부터의 원발암 세포를 포함하는 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    c. 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계;
    d. 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 구조물을 형성시키는 단계;
    e. 후보 치료제를 상기 구조물에 적용하는 단계;
    f. 상기 암세포의 생육력을 측정하는 단계; 및
    g. 상기 측정된 암세포의 생육력을 근거로 상기 개체에 대한 치료제를 선택하는 단계
    를 포함하나;
    단 상기 구조물 중 적어도 하나의 성분을 바이오프린팅에 의해 침착시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    간질 바이오-잉크 및 종양 바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시키는 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    간질 세포 유형이 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포를 포함하는 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    세포 배양 배지가, 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육 또는 유지를 지지하는 가용성 성분들을 포함하는 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    간질 바이오-잉크 및 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계가
    a. 표면상에 간질 바이오-잉크의 제1 시트를 침착시키는 단계;
    b. 상기 간질 바이오-잉크의 제1 시트상에 간질 바이오-잉크의 연속적인 보더를 침착시켜 한면이 개방된 구획을 한정하는 단계;
    c. 상기 구획 중에 종양 바이오-잉크의 노드를 침착시키는 단계; 및
    d. 간질 바이오-잉크의 제2 시트를 침착시켜 상기 구획의 개방면을 폐쇄하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  17. 개체에서 유방암 치료제를 확인하는 방법으로, 상기 방법은,
    a. 다수의 유방 간질 세포 유형을 포함하는 유방 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    b. 상기 개체로부터의 원발 유방암 세포를 포함하는 유방 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    c. 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크 중에 매몰되고 모든 면이 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계;
    d. 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 유방암 종양 모델을 형성시키는 단계;
    e. 후보 치료제를 상기 유방암 종양 모델에 적용하는 단계;
    f. 상기 유방암 세포의 생육력을 측정하는 단계; 및
    g. 상기 측정된 유방암 세포의 생육력을 근거로 상기 개체에 대한 치료제를 선택하는 단계
    를 포함하나;
    단 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    간질 세포 유형이 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포를 포함하는 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    세포 배양 배지가, 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육 또는 유지를 지지하는 가용성 성분들을 포함하는 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    간질 바이오-잉크 및 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계가
    a. 표면상에 간질 바이오-잉크의 제1 시트를 침착시키는 단계;
    b. 상기 간질 바이오-잉크의 제1 시트상에 간질 바이오-잉크의 연속적인 보더를 침착시켜 한면이 개방된 구획을 한정하는 단계;
    c. 상기 구획 중에 종양 바이오-잉크의 노드를 침착시키는 단계; 및
    d. 간질 바이오-잉크의 제2 시트를 침착시켜 상기 구획의 개방면을 폐쇄하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  21. 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델의 어레이로, 각각의 유방암 모델이
    a. 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 간질 조직; 및
    b. 유방암 세포 및 인간 내피세포를 포함하고, 모든 면이 상기 간질 조직에 의해 둘러싸인 종양 조직
    을 포함하여 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하나;
    단 상기 간질 조직, 상기 종양 조직, 또는 상기 간질 조직과 상기 종양 조직이 모두 바이오프린트되었고;
    상기 어레이가 고속 대량처리 분석에 사용하기에 적합한 것인 어레이.
  22. 제21항에 있어서,
    각각의 유방암 모델이 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 어레이.
  23. 제21항에 있어서,
    각각의 유방암 모델이 다중-웰 플레이트의 웰 중에 있는 어레이.
  24. 제21항에 있어서,
    유방암 세포가 환자 종양으로부터의 원발암 세포인 어레이.
  25. 제21항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 유방암 모델을 형성하는 어레이.
  26. 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델로,
    a. 간질 조직; 및
    b. 종양 조직
    을 포함하고, 상기 종양 조직이 암세포를 포함하며, 상기 종양 조직이 상기 간질 조직과 접촉하여 상기 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나;
    단 상기 간질 조직이 분화 신호에 노출된 인간 지방전구세포 (preadipocyte)를 포함하는 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었고, 상기 종양 조직이 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트된 종양 모델.
  27. 제1항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 둘러싸여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 종양 모델.
  28. 제2항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 종양 모델.
  29. 제1항에 있어서,
    사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 종양 모델.
  30. 제1항에 있어서,
    간질 조직이
    a. 내피세포,
    b. 섬유아세포, 및
    c. 지방세포, 지방전구세포, 또는 지방세포와 지방전구세포 모두
    를 포함하는 종양 모델.
  31. 제1항에 있어서,
    종양 조직이 내피세포를 포함하는 종양 모델.
  32. 제1항에 있어서,
    종양 모델이 인간 유방암 모델이고, 간질 조직이 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 및 인간 지방세포를 포함하는 인간 유방 간질이고, 종양 조직이 인간 유방 종양인 종양 모델.
  33. 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델로,
    a. 간질 조직; 및
    b. 종양 조직
    을 포함하고, 상기 종양 조직이 암세포를 포함하며, 상기 종양 조직이 상기 간질 조직과 접촉하여 상기 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나;
    단 상기 간질 조직이 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었고 상기 종양 조직이 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었으며;
    상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크가 각각, 세포들의 응집 전에 상기 종양 모델 구조를 물리적으로 안정화시키는데 사용되는 가역적으로 가교결합성인 압출 화합물을 포함하는 종양 모델.
  34. 제8항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 둘러싸여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 종양 모델.
  35. 제9항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 종양 모델.
  36. 제8항에 있어서,
    사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 종양 모델.
  37. 제8항에 있어서,
    간질 조직이
    a. 내피세포,
    b. 섬유아세포, 및
    c. 지방세포, 지방전구세포, 또는 지방세포와 지방전구세포 모두
    를 포함하는 종양 모델.
  38. 제8항에 있어서,
    종양 조직이 내피세포를 포함하는 종양 모델.
  39. 제8항에 있어서,
    종양 모델이 인간 유방암 모델이고, 간질 조직이 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포, 및 인간 지방세포를 포함하는 인간 유방 간질이고, 종양 조직이 인간 유방 종양인 종양 모델.
  40. 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 제작 방법으로, 상기 방법은
    a. 인간 지방전구세포에 지방세포 분화 신호를 제공하는 단계;
    b. 인간 지방전구세포를 포함하는 다수의 간질 세포 유형을 포함하는 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    c. 암세포 유형을 포함하는 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    d. 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계; 및
    e. 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  41. 제15항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 둘러싸이는 방법.
  42. 제16항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸이는 방법.
  43. 제15항에 있어서,
    바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시키는 방법.
  44. 제15항에 있어서,
    간질 세포 유형이 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제15항에 있어서,
    종양 바이오-잉크가 내피세포를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제15항에 있어서,
    간질 바이오-잉크가 50 x 106 세포/㎖ 내지 300 x 106 세포/㎖을 포함하는 방법.
  47. 제15항에 있어서,
    종양 바이오-잉크가 50 x 106 세포/㎖ 내지 300 x 106 세포/㎖을 포함하는 방법.
  48. 제15항에 있어서,
    세포 배양 배지가, 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육, 유지, 또는 분화를 지지하는 가용성 성분들을 포함하는 방법.
  49. 제15항에 있어서,
    종양 모델이 인간 유방암 모델이고, 간질 바이오-잉크가 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 인간 유방 간질 바이오-잉크이고, 종양 바이오-잉크가 인간 유방 종양 바이오-잉크인 방법.
  50. 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 제작 방법으로, 상기 방법은,
    a. 가역적으로 가교결합성인 압출 화합물 및 다수의 간질 세포 유형을 포함하는 간질 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    b. 가역적으로 가교결합성인 압출 화합물 및 암세포 유형을 포함하는 종양 바이오-잉크를 제조하는 단계;
    c. 상기 종양 바이오-잉크가 상기 간질 바이오-잉크와 접촉하도록 상기 간질 바이오-잉크 및 상기 종양 바이오-잉크를 침착시키는 단계;
    d. 상기 세포의 응집 전에 상기 압출 화합물을 가교결합시켜 상기 종양 모델 구조를 물리적으로 안정화시키는 단계;
    e. 상기 침착된 바이오-잉크를 세포 배양 배지에서 성숙시켜 상기 압출 화합물을 제거하고 상기 세포들이 응집되게 하여 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  51. 제25항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 둘러싸이는 방법.
  52. 제26항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸이는 방법.
  53. 제25항에 있어서,
    바이오-잉크를 바이오프린팅에 의해 침착시키는 방법.
  54. 제25항에 있어서,
    압출 화합물이 알기네이트를 포함하는 방법.
  55. 제25항에 있어서,
    압출 화합물을 효소적 절단에 의해 제거할 수 있는 방법.
  56. 제30항에 있어서,
    세포 응집에 이어서 효소적 절단에 의해 가교결합된 압출 화합물을 제거함을 추가로 포함하는 방법.
  57. 제25항에 있어서,
    간질 세포 유형이 내피세포, 섬유아세포 및 지방세포 또는 지방전구세포를 포함하는 방법.
  58. 제25항에 있어서,
    종양 바이오-잉크가 내피세포를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제25항에 있어서,
    간질 바이오-잉크가 50 x 106 세포/㎖ 내지 300 x 106 세포/㎖을 포함하는 방법.
  60. 제25항에 있어서,
    종양 바이오-잉크가 50 x 106 세포/㎖ 내지 300 x 106 세포/㎖을 포함하는 방법.
  61. 제25항에 있어서,
    세포 배양 배지가, 인간 섬유아세포, 인간 내피세포, 지방세포 및 암세포의 생육, 유지, 또는 분화를 지지하는 가용성 성분들을 포함하는 방법.
  62. 제25항에 있어서,
    종양 모델이 인간 유방암 모델이고, 간질 바이오-잉크가 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 인간 유방 간질 바이오-잉크이고, 종양 바이오-잉크가 인간 유방 종양 바이오-잉크인 방법.
  63. 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 어레이로, 각각의 종양 모델이 간질 조직 및 종양 조직을 포함하고; 상기 종양 조직이 암세포를 포함하며, 상기 종양 조직이 상기 간질 조직과 접촉하여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직이, 분화 신호에 노출된 인간 지방전구세포를 포함하는 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었고; 어레이가 고속 대량처리 분석에 사용하기에 적합한 어레이.
  64. 제38항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 어레이.
  65. 제39항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 어레이.
  66. 제38항에 있어서,
    각각의 종양 모델이 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 어레이.
  67. 제38항에 있어서,
    각각의 종양 모델이 다중-웰 플레이트의 웰 중에 있는 어레이.
  68. 제38항에 있어서,
    간질 조직이 내피세포, 섬유아세포, 및 지방세포, 지방전구세포, 또는 지방세포와 지방전구세포 모두를 포함하는 어레이.
  69. 제38항에 있어서,
    종양 조직이 내피세포를 포함하는 어레이.
  70. 제38항에 있어서,
    각각의 종양 모델이 인간 유방암 모델이고, 간질 조직이 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 인간 유방 간질이고, 종양 조직이 인간 유방 종양인 어레이.
  71. 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델의 어레이로, 각각의 종양 모델이 간질 조직 및 종양 조직을 포함하고; 상기 종양 조직이 암세포를 포함하며, 상기 종양 조직이 상기 간질 조직과 접촉하여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하나; 단 상기 간질 조직이, 가역적으로 가교결합성인 압출 화합물을 포함하는 간질 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었고 상기 종양 조직이, 가역적으로 가교결합성인 압출 화합물을 포함하는 종양 바이오-잉크로부터 바이오프린트되었으며; 어레이가 고속 대량처리 분석에 사용하기에 적합한 어레이.
  72. 제46항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 어레이.
  73. 제47항에 있어서,
    종양 조직이 모든 면이 간질 조직에 의해 완전히 둘러싸여 각각의 3차원의 조작된 생물학적 종양 모델을 형성하는 어레이.
  74. 제46항에 있어서,
    각각의 종양 모델이 사전-형성된 스캐폴드가 실질적으로 없는 어레이.
  75. 제46항에 있어서,
    각각의 종양 모델이 다중-웰 플레이트의 웰 중에 있는 어레이.
  76. 제46항에 있어서,
    간질 조직이 내피세포, 섬유아세포, 및 지방세포, 지방전구세포, 또는 지방세포와 지방전구세포 모두를 포함하는 어레이.
  77. 제46항에 있어서,
    종양 조직이 내피세포를 포함하는 어레이.
  78. 제46항에 있어서,
    각각의 종양 모델이 인간 유방암 모델이고, 간질 조직이 인간 유방 섬유아세포, 인간 내피세포 및 인간 지방세포를 포함하는 인간 유방 간질이고, 종양 조직이 인간 유방 종양인 어레이.
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