CN106536720B - 工程化的三维乳腺组织，脂肪组织和肿瘤疾病模型 - Google Patents

工程化的三维乳腺组织，脂肪组织和肿瘤疾病模型 Download PDF

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Abstract

所描述的是三维、工程化的生物乳腺组织，脂肪组织和肿瘤模型，包括乳腺癌模型。

Description

工程化的三维乳腺组织，脂肪组织和肿瘤疾病模型
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年4月4日提交的美国申请第61/975640号和2014年4月8日提交的美国申请第61/976895号的权益，其中的每一篇通过引用以其整体并入。
背景技术
在美国，癌症是死亡的第二大原因，仅次于心脏疾病，在每4例死亡中占近1例。在他们的一生中，8分之一的美国女性将患乳腺癌。美国癌症协会估计，在美国，2014年期间将在女性中诊断出232670例新的浸润性乳腺癌病例；在男性中预计有约2360例新病例。迫切需要有针对性的，安全的乳腺癌疗法，特别是针对屈光疾病。
发明内容
癌细胞与由成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞和免疫细胞组成的周围的间质细胞之间的相互作用在癌症开始、发展和转移中发挥关键作用。间质细胞调节细胞信号传导，发挥对癌细胞的结构支撑作用，并影响血管生成和转移到远处的靶组织。这样，间质细胞影响癌症治疗的功效。例如，为了更精确地模拟乳腺癌的开始和进展以及更有效地确定靶向治疗剂，必须解决三维组织微环境。由成纤维细胞、内皮细胞和脂肪细胞组成的乳腺间质在癌变和转移过程中起关键作用。这些细胞类型分泌影响治疗剂如何访问和靶向癌细胞的细胞外基质、生长因子以及激素。
二维癌细胞系培养物作为用于测试抗癌剂的模型具有几个不足之处。首先，目前的二维癌症模型不能准确地模拟疾病开始和发展。其次，目前的二维癌症模型不能提供生理相关的间质环境。其结果是，当前的二维癌症模型不能充分地表现出对抗癌治疗剂的天然样反应。例如，相比于临床观察，二维细胞培养物模型通常表现出对治疗剂的过度反应。
此外，许多相关组织的天然间质包括脂肪细胞。在许多情况下，具有生理相关的间质环境的天然样肿瘤疾病模型包括存活的脂肪细胞。现有的组织制造方法缺乏产生包括存活的脂肪细胞的工程化组织的充足能力。差异化的脂肪细胞是脆弱的，并且以前没有技术能够沉积这些重要的间质细胞而不破坏或摧毁它们。
存在这样的未满足的需要，即改进临床前肿瘤模型以克服对有效的药物开发的障碍，包括弥补二维细胞系和三维动物模型的使用之间的差距。具体地，存在这样的未满足的需要，即开发这样的模型体系，所述模型体系包含了与癌症如乳腺癌的发展生理学相关的多种细胞类型，所述模型体系能够更精确和有效地筛选靶向治疗剂以及开发新的用于早期检测的成像方式。本公开的目的包括：1)提出这样的发明，其中人类癌细胞由间质细胞，包括成纤维细胞、脂肪细胞和内皮细胞包围，目的是筛选靶向癌症疗法和开发新的显像剂；和2)提出这样的发明，其中从正常上皮产生的人乳腺癌细胞由间质细胞，包括成纤维细胞、脂肪细胞和内皮细胞包围，目的是筛选靶向癌症疗法和开发新的显像剂。
本文所公开的肿瘤疾病模型相比于目前的筛选工具具有几个优点，其中包括同时测量小分子对癌细胞以及组织微环境中的不同的细胞类型的影响的能力。本文所公开的生物打印的新组织(neotissues)的组织形态学分析证明它们是稳定的并且在培养基中可存活至少14天，而且它们的特征在于脂肪、间质和上皮组分的明确区室化(compartmentalization)。在生物打印过程中，采用内皮细胞创建稳健的微血管网络作为三维组织设计的一个组成部分。
在一方面，本文公开的是三维的，工程化的，生物学肿瘤模型，其包括：间质组织；和肿瘤组织；所述肿瘤组织包括癌细胞，所述肿瘤组织由间质组织从各个侧面包围以形成三维的，工程化的，生物肿瘤模型；条件是该间质组织是从间质生物墨水生物打印的，肿瘤组织是从肿瘤生物墨水生物打印的，或间质组织和肿瘤组织两者都是从它们各自的生物墨水生物打印的。在一些实施方案中，该模型基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，间质组织包括：内皮细胞，成纤维细胞和脂肪细胞，前脂肪细胞，或脂肪细胞和前脂肪细胞两者。在进一步的实施方案中，间质组织包含55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞，和1％-20％的脂肪细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织包括肿瘤细胞系的细胞。在其他实施方案中，肿瘤组织包括来自患者肿瘤的原发癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织包括内皮细胞。在进一步的实施方案中，肿瘤组织包括65-85％的癌细胞和15％-35％的内皮细胞。在一些实施方案中，肿瘤模型在其最小维度为约250μm至约5mm。在一些实施方案中，间质组织是人乳腺癌间质且肿瘤组织是人乳腺肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤组织完全由间质组织从各个侧面包围，以形成三维的，工程化的，生物肿瘤模型。
在另一个方面，本文公开的是一种制造三维的，工程化的生物肿瘤模型的方法，所述方法包括：制备间质生物墨水，所述间质生物墨水含有挤出化合物和多个间质细胞类型；制备肿瘤生物墨水，所述肿瘤生物墨水包含挤出化合物和癌细胞类型；沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水嵌入间质生物墨水中并从各个侧面接触间质生物墨水；以及在细胞培养基中使沉积的生物墨水熟化以除去挤出化合物并允许细胞凝集以形成三维的，工程化的生物肿瘤模型。在一些实施方案中，通过生物打印沉积生物墨水。在一些实施方案中，挤出化合物包括藻酸盐。在一些实施方案中，可通过酶消化除去挤出化合物。在进一步的实施方案中，该方法还包括交联所沉积的生物墨水以在细胞凝聚之前物理地稳定肿瘤模型结构。在更进一步的实施方案中，该方法进一步包括在细胞凝聚后通过酶促降解除去交联的生物墨水。在一些实施方案中，间质细胞类型包括内皮细胞，成纤维细胞和脂肪细胞或前脂肪细胞。在进一步的实施方案中，间质生物墨水包括55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞，以及1％-20％的脂肪细胞。在一些实施方案中，癌细胞类型包括癌细胞系。在其他实施方案中，所述癌细胞类型包括来自患者肿瘤的原发癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤生物墨水还包含内皮细胞。在一些实施方案中，间质生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约300百万个细胞。在一些实施方案中，肿瘤生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约300百万个细胞。在一些实施方案中，细胞培养基包含支持人成纤维细胞、人内皮细胞，脂肪细胞和癌细胞的生长，维持或分化的可溶性组分。在一些实施方案中，沉积该间质生物墨水和肿瘤生物墨水还包括：在表面上沉积第一片间质生物墨水；在第一片间质生物墨水上沉积间质生物墨水的连续边界以限定一个隔室，隔室的一侧开口；在隔室中沉积肿瘤生物墨水的结(node)；和沉积第二片间质生物墨水以关闭隔室的开口侧。在一些实施方案中，肿瘤模型是乳腺癌模型。
在另一个方面，本文公开的是三维的，工程化的生物乳腺癌模型，包括：乳腺间质组织，所述间质组织包括人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞和人脂肪细胞；和乳腺癌肿瘤组织；所述肿瘤组织包括乳腺癌细胞和人内皮细胞，所述肿瘤组织由所述间质组织从各个侧面包围，以形成三维的，工程化的生物乳腺癌模型；条件是所述间质组织是从间质生物墨水生物打印的，肿瘤组织是从肿瘤生物墨水生物打印的，或间质组织和肿瘤组织两者都从它们各自的生物墨水生物打印的。在一些实施方案中，所述模型基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，乳腺间质组织包含55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞，以及1％-20％的脂肪细胞。在一些实施方案中，乳腺癌细胞源自乳腺癌细胞系。在其他实施方案中，乳腺癌细胞是来自患者肿瘤的原发癌细胞。在一些实施方案中，乳腺癌肿瘤组织包括65-85％的癌细胞和15％-35％的内皮细胞。在一些实施方案中，乳腺癌模型的最小维度是250μm至5mm。在一些实施方案中，乳腺癌肿瘤组织完全由乳腺间质组织从各个侧面包围，以形成三维的，工程化的生物乳腺癌模型。
在另一方面，本文公开的是制造三维的，工程化的生物乳腺癌模型的方法，所述方法包括：制备间质生物墨水，所述间质生物墨水包括多个间质细胞类型，所述间质细胞类型包括：挤出化合物，人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞和人脂肪细胞；制备肿瘤生物墨水，所述肿瘤生物墨水包括：挤出化合物，乳腺癌细胞类型和人内皮细胞；沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水嵌入在间质生物墨水中并与从各个侧面与间质生物墨水接触；并且使细胞培养基中的沉积的生物墨水熟化以去除挤出化合物从而允许细胞凝集，以形成三维的，工程化的生物乳腺癌模型。在一些实施方案中，通过生物打印沉积生物墨水。在一些实施方案中，挤出化合物包括藻酸盐。在一些实施方案中，挤出化合物通过酶消化除去。在进一步的实施方案中，所述方法还包括交联所沉积的生物墨水以在细胞凝聚之前帮助维持乳腺癌模型结构。在又进一步的实施方案中，该方法还包括在细胞凝聚后通过酶促降解除去交联的生物墨水。在一些实施方案中，间质生物墨水包括55％-75％的人乳腺成纤维细胞，15％-35％的人内皮细胞和1％-20％的人脂肪细胞。在一些实施方案中，乳腺癌细胞类型包括乳腺癌细胞系。在其他实施方案中，所述癌细胞类型包括来自患者肿瘤的原发乳腺癌细胞。在一些实施方案中，间质生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约300百万个细胞。在一些实施方案中，肿瘤生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约300百万个细胞。在一些实施方案中，细胞培养基包含支持人成纤维细胞、人内皮细胞、脂肪细胞和癌细胞的生长、维持或分化的可溶性组分。在一些实施方案中，沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水还包括：在表面上沉积第一片间质生物墨水；在第一片间质生物墨水上沉积间质生物墨水的连续边界以限定一个隔室，隔室的一侧开口；在隔室中沉积肿瘤生物墨水的结；和沉积第二片间质生物墨水以关闭隔室的开口侧。在一些实施方案中，脂肪细胞是前体脂肪细胞，并且该方法还包括提供脂肪细胞分化信号到前脂肪细胞。
在另一个方面，本文公开了鉴定用于个体中的癌症的治疗剂的方法，该方法包括：制备间质生物墨水，所述间质生物墨水包括多个间质细胞类型；制备肿瘤生物墨水，所述肿瘤生物墨水包含来自个体的原发癌细胞；沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水嵌入在间质生物墨水中并从各个侧面与间质生物墨水接触；在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的，工程化的生物构建体；对构建体施加候选治疗剂；测量癌细胞的生存能力；和基于癌细胞的测量的生存能力为个体选择治疗剂；条件是通过生物打印沉积构建体的至少一种组分。在一些实施方案中，间质生物墨水和肿瘤生物墨水通过生物打印沉积。在一些实施方案中，生物墨水进一步包括挤出化合物。在进一步的实施方案中，挤出化合物可通过酶消化除去。在更进一步的实施方案中，该方法还包括交联所沉积的生物墨水以在细胞凝聚之前物理地稳定肿瘤模型结构。在又进一步的实施方案中，该方法还包括在细胞凝聚后通过酶促降解除去交联的生物墨水。在一些实施方案中，间质细胞类型包括内皮细胞，成纤维细胞和脂肪细胞或前脂肪细胞。在进一步的实施方案中，间质生物墨水包括55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞，以及1％-20％的脂肪细胞。在一些实施方案中，肿瘤生物墨水还包含内皮细胞。在一些实施方案中，间质生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约300百万个细胞。在一些实施方案中，肿瘤生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约300百万个细胞。在一些实施方案中，细胞培养基包括支持人成纤维细胞、人内皮细胞、脂肪细胞和癌细胞的生长、维持或分化的可溶性组分。在一些实施方案中，沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水还包括：在表面上沉积第一片间质生物墨水；在第一片间质生物墨水上沉积间质生物墨水的连续边界以限定一个隔室，隔室的一侧开口；在隔室中沉积肿瘤生物墨水的结；和沉积第二片间质生物墨水以关闭隔室的开口侧。在一些实施方案中，三维的，工程化的生物构建体是乳腺癌构建体。
在另一方面，本文公开的是三维的，工程化的生物组织，其包括存活的分化的脂肪细胞。在一些实施方案中，所述组织是生物打印的。在一些实施方案中，所述组织基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，所述组织包括至少5％的存活的，分化的脂肪细胞。在进一步的实施方案中，所述组织包含至少10％的存活的，分化的脂肪细胞。在一些实施方案中，至少50％的脂肪细胞在制造后24小时存活。在进一步的实施方案中，至少75％的脂肪细胞在制造后24小时存活。在一些实施方案中，脂肪细胞在制造后分泌瘦素至少1周。在一些实施方案中，所述组织是脂肪组织。在一些实施方案中，脂肪细胞是皮下脂肪细胞。在其他实施方案中，脂肪细胞源自前脂肪细胞或间充质干细胞。
在另一个方面，本文公开的是制造三维的，工程化的，含有脂肪组织的生物构建体的方法，所述方法包括：提供脂肪细胞分化信号到前脂肪细胞；制备前脂肪细胞生物墨水，所述生物墨水包含前脂肪细胞和至少一种其他的细胞类型；在表面上沉积生物墨水；并在细胞培养基中熟化生物墨水以使细胞凝聚以形成三维的，工程化的生物构建体，所述构建体包含存活的，分化的脂肪细胞。在一些实施方案中，通过生物打印沉积生物墨水。在一些实施方案中，所述构建体包含至少5％的存活的，分化的脂肪细胞。在进一步的实施方案中，构建体包含至少10％的存活的，分化的脂肪细胞。在一些实施方案中，至少50％的脂肪细胞在制造后24小时存活。在进一步的实施方案中，至少75％的脂肪细胞在制造后24小时存活。在一些实施方案中，脂肪细胞在制造后分泌瘦素至少1，2，3，4，5，6或7天。在一些实施方案中，脂肪细胞在制造后分泌瘦素至少1，2或3周。在一些实施方案中，所述构建体是脂肪组织。在一些实施方案中，所述前脂肪细胞是皮下前脂肪细胞。
在另一个方面，本文公开的是三维的，工程化的生物乳腺组织，其包括：人乳腺成纤维细胞、人内皮细胞、人乳腺上皮细胞和人脂肪细胞；条件是所述细胞是从生物墨水生物打印的并且凝聚以形成三维的，工程化的生物乳腺组织；条件是该组织基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，组织包括55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞，和1％-20％的脂肪细胞。在一些实施方案中，所述组织的最小维度是约250μm至约5mm。在一些实施方案中，将所述组织暴露于致病剂以创建乳腺组织疾病模型。在进一步的实施方案中，所述致病剂包括病毒、细菌、化学化合物或它们的组合。
在另一个方面，本文公开的是制造三维的，工程化的生物乳腺组织的方法，所述方法包括：提供脂肪细胞分化信号到人前脂肪细胞；制备生物墨水，所述生物墨水包括多个乳腺细胞类型，所述乳腺细胞类型包括人乳腺成纤维细胞、人内皮细胞、人乳腺上皮细胞和人前脂肪细胞；在生物相容性表面上沉积生物墨水；并在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的，工程化的生物乳腺组织。在一些实施方案中，通过生物打印沉积生物墨水。在一些实施方案中，生物墨水包含55％-75％的人乳腺成纤维细胞，15％-35％的人内皮细胞和1％-20％的人前脂肪细胞。在一些实施方案中，生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约300百万个细胞。在一些实施方案中，细胞培养基包括支持人成纤维细胞、人内皮细胞和脂肪细胞的生长、维持或分化的可溶性组分。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述三维的，工程化的生物乳腺组织暴露于致病剂以创建乳腺组织疾病模型。在进一步的实施方案中，所述致病剂包括病毒、细菌、化学化合物或它们的组合。
在另一方面，本文公开的是三维的，工程化的生物肿瘤模型的阵列，每个肿瘤模型包括：间质组织和肿瘤组织；所述肿瘤组织包括癌细胞，所述肿瘤组织由间质组织从各个侧面包围，以形成每个三维的，工程化的生物肿瘤模型；条件是间质组织，肿瘤组织，或间质组织和肿瘤组织两者都是生物打印的；条件是所述阵列适于在高通量测定法中使用。在一些实施方案中，每个肿瘤模型基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，每个肿瘤模型在多孔板的孔中。在一些实施方案中，所述间质组织包括：内皮细胞，成纤维细胞和脂肪细胞，前脂肪细胞，或脂肪细胞和前脂肪细胞两者。在一些实施方案中，间质组织包含55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞，以及1％-20％的脂肪细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织包括来自患者肿瘤的原发癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织包括内皮细胞。在进一步的实施方案中，肿瘤组织包括65-85％的癌细胞和15％-35％的内皮细胞。在一些实施方案中，每个肿瘤模型的最小维度是约250μm至约5mm。在一些实施方案中，间质组织是人乳腺间质且肿瘤组织是人乳腺肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤组织由间质组织从各个侧面完全包围，以形成每个三维的，工程化的生物肿瘤模型。
在另一方面，本文公开的是三维的，工程化的生物乳腺癌模型的阵列，每个乳腺癌模型包括：间质组织，所述间质组织包括人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞和人脂肪细胞；和肿瘤组织；所述肿瘤组织包括乳腺癌细胞和人内皮细胞，肿瘤组织由间质组织从各个侧面包围，以形成每个三维的，工程化的生物乳腺癌模型；条件是间质组织，肿瘤组织，或间质组织和肿瘤组织两者都是生物打印的；条件是所述阵列适于在高通量测定法中使用。在一些实施方案中，每个乳腺癌模型基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，每个乳腺癌模型在多孔板的孔中。在一些实施方案中，间质组织包含55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞，以及1％-20％的脂肪细胞。在一些实施方案中，乳腺癌细胞是来自患者肿瘤的原发癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织包括65-85％的癌细胞和15％-35％的内皮细胞。在一些实施方案中，每个乳腺癌模型的最小维度是约250μm至约5mm。在一些实施方案中，肿瘤组织由间质组织从各个侧面完全包围，以形成每个三维的，工程化的生物乳腺癌模型。
在另一个方面，本文公开的是三维的，工程化的生物肿瘤组织，其包含人癌细胞；条件是所述细胞被凝聚以形成三维的，工程化的生物肿瘤组织；条件是所述肿瘤组织基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，从癌细胞生物墨水生物打印肿瘤组织。在一些实施方案中，肿瘤组织还包含成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞和免疫细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述肿瘤组织的最小维度是约250μm至约5mm。在一些实施方案中，肿瘤组织暴露于致癌物质以转化细胞。在进一步的实施方案中，致病剂包括病毒、细菌、化学化合物或它们的组合。在一些实施方案中，可交联的挤出化合物用于在制造之后和在细胞凝聚以形成肿瘤组织之前物理稳定所述肿瘤组织。
附图说明
本专利或申请文件包含以彩色展示的至少一个附图。当请求和支付必要费用时，具有(多个)彩色绘图的本专利或专利申请公布文本的副本将由专利局提供。
图1示出描绘生物打印的乳腺组织构建体的结构的示意图的非限制性示例；在这种情况下，所述构建体基本上是六层立方体，其具有由成纤维细胞，内皮细胞和骨髓来源的间充质干细胞的外部区域包围的上皮细胞的内部区域。
图2示出图1的构建体的代表性显微照片的非限制性系列；在这种情况下，显微照片描绘苏木精&伊红(H&E)染色标本。
图3A-3D示出图1的构建体的代表性显微照片的非限制性系列(制造后第7天)；在这种情况下，显微照片描绘经染色以通过针对波形蛋白(绿色)和TE7的抗体可视化人乳腺成纤维细胞的构建体。
图4示出图1的构建体的代表性显微照片的非限制性系列(制造后第7天)；在这种情况下，显微照片描绘经染色以通过针对波形蛋白(红色)和泛细胞角蛋白(绿色)的抗体以及DAPI(蓝色)可视化正常人乳腺成纤维细胞和人乳腺上皮细胞的相对位置的构建体。
图5示出图1的构建体的代表性显微照片的非限制性系列(制造后第7天)；在这种情况下，显微照片描绘经染色以通过针对波形蛋白(红色)和CD31(绿色)的抗体以及DAPI(蓝色)可视化正常人乳腺成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的相对位置的构建体。
图6示出图1的构建体的代表性显微照片的非限制性系列；在这种情况下，显微照片描绘由Masson三色染色法染色的构建体。
图7示出生物打印的乳腺组织构建体的非限制性实例(示意图及照片)；在这种情况下，构建体具有骨髓来源的间质干细胞(在制造后分化为脂肪细胞)和人脐静脉内皮细胞的边界，所述边界围绕一条人乳腺上皮细胞，其中边界和条之间的空间充满了正常的人乳腺成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞。
图8示出图7的构建体的代表性显微照片的非限制性系列；在这种情况下，显微照片描绘苏木精&伊红(H&E)染色标本。
图9示出图7的构建体的代表性显微照片的非限制性系列；在这种情况下，显微照片描绘经染色以通过针对CD31、波形蛋白、FABP4以及泛细胞角蛋白的抗体以及DAPI可视化内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和上皮细胞的构建体。
图10示出生物打印的乳腺癌肿瘤模型的非限制性实例(示意图及照片)；在这种情况下，肿瘤模型具有由间质组织从各个侧面包围的肿瘤组织核心，所述肿瘤组织核心包括乳腺癌细胞和人脐静脉内皮细胞，所述间质组织包括正常的人乳腺成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞和皮下前脂肪细胞，其被分化形成存活的脂肪细胞。
图11示出预分化的皮下前脂肪细胞的一个非限制性实例；在这种情况下，皮下前脂肪细胞在图10的肿瘤模型制作之前暴露于脂肪细胞分化培养基中三天并显示脂滴的早期形成。
图12示出描绘图10的肿瘤模型随着时间的瘦素分泌的线图的一个非限制性实例，其表明在生物打印的构建体内脂肪细胞的持续分化。
图13示出图10的肿瘤模型的非限制性示例性显微照片；在这种情况下，显微照片描绘生物打印的区室化的结构的保留以及模拟天然组织中的观察结果的药物化合物的渗透。
图14示出描绘在用各种药物化合物和对照处理之后图10的肿瘤模型的构建体生存能力的柱状图的一个非限制性实例。
图15示出了生物打印的乳腺癌肿瘤模型的非限制性实例(示意图及照片)；在这种情况下，肿瘤模型具有由间质隔室包围的人乳腺癌细胞的结节，所述间质隔室包括内皮细胞，成纤维细胞和脂肪细胞。
图16示出图15的肿瘤模型的非限制性示例性显微照片；在这种情况下，显微照片描绘了组织结构的组织学分析和细胞类型的相对位置，其中乳腺癌细胞被标记绿色。
图17示出图15的肿瘤模型的非限制性示例性显微照片；在这种情况下，显微照片描绘了组织结构的组织学分析，所述组织结构包括ECM、细胞类型、间质隔室和微脉管。
图18示出描绘图15的肿瘤模型随着时间的瘦素分泌(制造后第2天至制造后第8天)的柱状图的一个非限制性实例，其表明在生物打印的构建体内脂肪细胞的持续分化。
图19示出描绘图15的三个肿瘤模型的两个代谢测定的柱状图的非限制性实例，两个代谢测定都证实低构建体至构建体可变性。
图20示出了描绘相对于二维乳腺癌细胞培养物图15的肿瘤模型的药物反应测定(他莫昔芬)的柱状图的非限制性例子。
图21示出描绘在用化疗化合物治疗之后相比于单独的MCF7细胞图15的肿瘤模型的代谢活性的柱状图的非限制性实例。
图22示出图15的肿瘤模型的非限制性的示例性显微照片；在这种情况下，显微照片描绘在用顺铂治疗之后凋亡的评估。
图23示出生物打印的脂肪组织的非限制性的示例性显微照片，在这种情况下，显微照片描绘对于脂类的油红O染色。
具体实施方案
在一些实施方案中，本文所公开的肿瘤疾病模型是由两个主要部分1)包含人乳腺成纤维细胞、内皮细胞和骨髓来源的间充质细胞或前脂肪细胞的间质隔室；和2)包含人乳腺上皮细胞和/或乳腺腺癌细胞的上皮隔室组成的乳腺癌肿瘤模型。在进一步的实施方案中，用Novogen生物打印机(Organovo)沉积细胞，以这种方式，所述上皮/腺癌隔室由间质隔室从各个侧面包围。在更进一步的实施方案中，通过生物墨水的空间受控的沉积或与随后降解或除去的支撑生物材料例如水凝胶混合的细胞创建结构。
在某些实施方案中，本文所描述的是三维的，工程化的生物肿瘤模型，其包括：间质组织；和肿瘤组织；所述肿瘤组织包括癌细胞，所述肿瘤组织由间质组织从各个侧面包围以形成三维的，工程化的生物肿瘤模型；条件是所述间质组织是从间质生物墨水生物打印的，所述肿瘤组织是从肿瘤生物墨水生物打印的，或间质组织和肿瘤组织两者都是从它们各自的生物墨水生物打印的。
在某些实施方案中，本文还描述了制造三维的，工程化的生物肿瘤模型的方法，所述方法包括：制备间质生物墨水，所述间质生物墨水包含挤出化合物和多个间质细胞类型；制备肿瘤生物墨水，所述肿瘤生物墨水包含挤出化合物和癌细胞类型；沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水嵌入在间质生物墨水中并从各个侧面与间质生物墨水接触；和在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以除去挤出化合物，并允许细胞凝聚以形成三维的，工程化的生物肿瘤模型。
在某些实施方案中，本文还描述三维的，工程化的生物乳腺癌模型，其包括：乳腺间质组织，所述间质组织包括人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞和人脂肪细胞；和乳腺癌肿瘤组织；所述肿瘤组织包括乳腺癌细胞和人内皮细胞，所述肿瘤组织由间质组织从各个侧面包围，以形成三维的，工程化的生物乳腺癌模型；条件是间质组织是从间质生物墨水生物打印的，肿瘤组织是从肿瘤生物墨水生物打印的，或间质组织和肿瘤组织两者都从它们各自的生物墨水生物打印的。
在某些实施方案中，本文还描述了制造三维的，工程化的生物乳腺癌模型的方法，所述方法包括：制备间质生物墨水，所述间质生物墨水包括多个间质细胞类型，所述间质细胞类型包括：挤出化合物，人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞和人脂肪细胞；制备肿瘤生物墨水，所述肿瘤生物墨水包括：挤出化合物，乳腺癌细胞类型和人内皮细胞；沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水嵌入间质生物墨水中并从各个侧面与间质生物墨水接触；并在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以去除挤出化合物，从而使细胞凝聚以形成三维的，工程化的生物乳腺癌模型。
在某些实施方案中，本文还描述了鉴定用于个体中的癌症的治疗剂的方法，所述方法包括：制备间质生物墨水，所述间质生物墨水包括多个间质细胞类型；制备肿瘤生物墨水，所述肿瘤生物墨水包含来自个体的原发癌细胞；沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水嵌入间质生物墨水中并从各个侧面与间质生物墨水接触；在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的，工程化的生物构建体；对构建体施加候选治疗剂；测量癌细胞生存能力；和基于癌细胞的测量的生存能力选择用于个体的治疗剂；条件是通过生物打印沉积构建体中的至少一种组分。
在某些实施方案中，本文还描述包括存活的，分化的脂肪细胞的三维的，工程化的生物组织。
在某些实施方案中，本文还描述了制造三维的，工程化的含有脂肪组织的生物构建体的方法，所述方法包括：提供脂肪细胞分化信号到前脂肪细胞；制备前脂肪细胞生物墨水，所述生物墨水包含前脂肪细胞和至少一种其他细胞类型；在表面上沉积生物墨水；并在细胞培养基中熟化生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的，工程化的生物构建体，所述构建体包含存活的分化的脂肪细胞。
在某些实施方案中，本文还描述了三维的，工程化的生物乳腺组织，其包括：人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞，人乳腺上皮细胞和人脂肪细胞；条件是细胞是从生物墨水生物打印的并凝聚以形成三维的，工程化的生物乳腺组织；条件是该组织基本上不含预成型支架。
在某些实施方案中，本文还描述了制造三维的，工程化的生物乳腺组织的方法，所述方法包括：提供脂肪细胞分化信号至人前脂肪细胞；制备生物墨水，所述生物墨水包括多个乳腺细胞类型，所述乳腺细胞类型包括人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞，人乳腺上皮细胞以及人前脂肪细胞；在生物相容性表面上沉积生物墨水；并在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的，工程化的生物乳腺组织。
在某些实施方案中，本文还描述了三维的，工程化的生物肿瘤模型的阵列，每个肿瘤模型包括：间质组织和肿瘤组织；所述肿瘤组织包括癌细胞，所述肿瘤组织由间质组织从各个侧面包围，以形成每个三维的，工程化的生物肿瘤模型；条件是间质组织，肿瘤组织，或间质组织和肿瘤组织两者都是生物打印的；条件是所述阵列适于在高通量测定法中使用。
在某些实施方案中，本文还描述了三维的，工程化的生物乳腺癌模型的阵列，每个乳腺癌模型包括：间质组织，所述间质组织包括人乳腺成纤维细胞，人内皮细胞和人脂肪细胞；和肿瘤组织；所述肿瘤组织包括乳腺癌细胞和人内皮细胞，所述肿瘤组织由间质组织从各个侧面包围，以形成每个三维的，工程化的生物乳腺癌模型；条件是间质组织，肿瘤组织，或间质组织和肿瘤组织两者都是生物打印的；条件是所述阵列适于在高通量测定法中使用。
在某些实施方案中，本文还描述了三维的，工程化的生物肿瘤组织，其包括人类癌细胞；条件是细胞被凝聚以形成三维的，工程化的生物肿瘤组织；条件是肿瘤组织基本上不含预成型支架。
某些定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有如本发明所属的领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。在本文中任何提及“或”旨在包括“和/或”，除非另有说明。
如本文所用，“脂肪细胞(adipocyte)”(也称为“肥粒血球(lipocyte)”或“脂细胞(fat cell)”)是指主要构成脂肪组织的细胞，其专门储存能量为脂肪。
如本文所用，“前脂肪细胞”是指可被刺激以形成脂肪细胞的任何细胞。
如本文所用，“间质”是指生物细胞，组织或器官的连接，支持框架。
如本文所用，“组织”是指细胞的聚集体。
如本文所用，“生物墨水”是指在生物打印中使用的液体，半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包括细胞溶液，细胞聚集体，包括细胞的凝胶，多细胞体或组织。在一些实施方案中，生物墨水还包含提供实现生物打印的特定的生物力学性能的非细胞物质。在一些实施方案中，生物墨水包括挤出化合物。
如本文所用，“生物打印”是指通过与自动化或半自动化的，计算机辅助的，三维成型装置(例如，生物打印机)兼容的方法利用细胞(例如，细胞溶液，含细胞的凝胶，细胞悬液，细胞浓缩物，多细胞聚集体，多细胞体等)的三维的，精确的沉积。
如本文所用，“支架”是指合成的支架，如聚合物支架和多孔水凝胶，非合成的支架，例如预成型细胞外基质层，死细胞层和脱细胞组织，和对于工程化组织的物理结构不可或缺并且在不损害/破坏组织的情况不能从所述组织去除的任何其它类型的预成型支架。在进一步的实施方案中，脱细胞组织支架包括由培养的细胞以任何方式产生的脱细胞天然组织或脱细胞细胞物质；例如，允许死亡或脱细胞的细胞层，存活的同时留下它们产生的ECM。因此，术语“无支架”意在暗示在使用时支架不是工程化组织的不可分割的部分，无论是已被去除或保留作为工程化组织的惰性组分。“无支架”与“不含支架”和“不含预成型支架”互换使用。
如本文所用，“测定法”是指用于测试或测量有机或生物样品(例如，细胞聚集体，组织，器官，生物体等)中的物质(例如，化学，分子，生物化学，蛋白质，激素或药物等)的存在或活性的程序。
生物打印
在一些实施方案中，工程化组织，构建体，或其阵列中的至少一种组分是生物打印的。在进一步的实施方案中，用这样的方法制备生物打印的构建体，所述方法利用快速原型技术，所述快速原型技术基于细胞，包括细胞溶液、细胞悬液、含有细胞的凝胶或糊剂、细胞浓缩物、多细胞体(例如，圆柱体，球体，带状物等)以及，任选地，限制材料通过三维递送装置(例如，生物打印机)三维地，自动化地，计算机辅助地沉积到生物相容性支撑表面(例如，由水凝胶和/或多孔膜组成)上。如本文所用，在一些实施方案中，术语“工程化”当用于指组织或构建体时意味着细胞、细胞溶液、细胞悬液、含有细胞的凝胶或糊剂、细胞浓缩物、多细胞聚集体和它们的层被定位以通过计算机辅助设备(例如，生物打印机)根据计算机脚本形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本是，例如，一个或多个计算机程序、计算机应用或包括可执行指令的计算机模块。在更进一步的实施方案中，三维组织结构通过细胞或多细胞体的打印后融合形成，在一些情况下，其类似于早期形态发生的自组装现象。
虽然有许多方法可用于在生物相容性表面上布置细胞、细胞聚集体和含细胞材料以产生三维结构，包括手动放置，通过自动的、计算机辅助机诸如生物打印机定位是有利的。采用这种技术递送细胞，细胞聚集体和含细胞材料的优点包括细胞或多细胞体的快速，准确和可重复的放置，以产生这样的构建体，所述构建体呈现具有各种组成的细胞、细胞聚集体和/或它们的层的有计划的或预先确定的取向或模式。优点还包括保证高细胞密度，同时最大限度地减少细胞损伤。脂肪细胞特别容易受到剪切力和其它生物力学应力的损害；因此本文描述的生物打印方法提供了相对于替代技术的明显优势，如实施例2-4所强调的生物打印的组织中的脂肪细胞的良好生存能力所强调的。
在一些实施方案中，生物打印的方法是连续的和/或基本上连续的。连续生物打印方法的一个非限制性实例是经由连接到生物墨水的贮存器的分配尖端(例如，注射器，针，毛细管等)从生物打印机分配生物墨水(即，细胞，与赋形剂或挤出化合物组合的细胞，或细胞的聚集体)。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是以功能单元的重复模式分配生物墨水。在各种实施方案中，重复功能单元具有任何合适的几何形状，包括，例如，圆形，正方形，矩形，三角形，多边形和不规则的几何形状，从而导致经由不同的生物墨水和/或空隙空间的空间模式实现的具有平面几何结构的一个或多个组织层。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的重复模式包括相邻(例如，堆叠)地生物打印一层和多个层以形成具有层状几何结构的工程化组织。在各种实施方案中，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多层被相邻(例如，堆叠)地生物打印以形成工程化组织。在进一步的实施方案中，具有层状几何结构的组织中的一个或多个层也具有平面几何结构。
在一些实施方案中，连续生物打印便于从大的生物墨水贮存器打印较大的组织，任选使用注射器装置。连续生物打印也是使用挤出化合物、水凝胶、聚合物、生物墨水或能够在打印后保持其形状的任何可打印材料共同打印空间限定的边界的便捷方法，其中所创建的边界被任选地通过一种或多种生物墨水的生物打印填充，由此产生具有空间限定的平面几何形状的镶嵌组织(a mosaic tissue)。
在一些实施方案中，连续生物打印中的方法涉及独立地或相对于彼此地优化和/或平衡参数，如打印高度，泵速度，机器人速度或它们组合。在一些情况下，用于沉积的生物打印机头速度为3mm/s，第一层的分配高度为0.5mm，且对于每个后续层分配高度增长0.4mm。在一些实施方案中，分配高度大约等于所述生物打印机分配尖端的直径。不受限制，合适的和/或最佳分配距离不会导致材料压扁或附着到分配针。在各种实施方案中，生物打印机分配尖端具有约20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或者更大的内径，包括其中的增量。在各种实施方案中，生物打印机的生物墨水贮存器具有约0.05、0.1、.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 100立方厘米或更大的体积，包括其中的增量。在一些情况下，当系统中的残余压力积聚低时泵速是合适和/或最佳的。在一些情况下，有利的泵速度取决于贮存器的横截面面积与分配针之间的比率，其中较大的比率需要较低的泵速度。在一些实施方案中，合适的和/或最佳的打印速度能够实现均匀线的沉积，而不会影响该材料的机械完整性。
本文公开的发明包括商业方法。在一些实施方案中，利用本文公开的技术和方法的速度和可扩展性设计，建造和操作工业和/或商业设施用于生产在用于研究和开发诸如体外测定的基于细胞的工具的生成中使用的工程化乳腺组织和/或肿瘤疾病模型。在进一步的实施方案中，工程化组织和/或模型及其阵列作为例如，用于生物测定和高通量药物筛选的细胞阵列(如微阵列或芯片)、组织阵列(例如，微阵列或芯片)以及试剂盒生产、存储、分发、销售、宣传以及出售。在其它实施方案中，生产和使用工程化组织和/或模型及其阵列以进行作为服务的生物测定和/或药物筛选。
生物墨水
在某些实施方案中，本文所公开的是三维的活组织，包括脂肪组织、乳腺组织、肿瘤模型、其阵列，以及包括生物打印细胞的方法。在一些实施方案中，通过从生物打印机沉积或挤出生物墨水来生物打印细胞。在一些实施方案中，“生物墨水”包括包含多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包括液体或半固体细胞溶液、细胞悬液或细胞浓缩物。在进一步的实施方案中，细胞溶液、悬浮液或浓缩物包含液体或半固体(例如，粘性)的载体和多个细胞。在仍然进一步的实施方案中，载体是合适的细胞营养培养基，如本文所述的那些。在一些实施方案中，生物墨水包括在生物打印之前任选地凝聚成多细胞聚集体的多个细胞。在进一步的实施方案中，生物墨水包含多个细胞，并且被生物打印以产生特定的平面和/或层状几何结构；其中所述生物墨水内的各个细胞的凝聚在生物打印之前，期间和/或之后发生。
在一些实施方案中，通过收集固定体积的多个细胞产生生物墨水；其中(多个)细胞组分表示总体积的至少约30％和至多约100％。在一些实施方案中，生物墨水包含半固体或固体多细胞聚集体或多细胞体。在进一步的实施方案中，生物墨水通过以下步骤产生：1)以预先确定的比率混合多个细胞或细胞聚集体以及生物相容性液体或凝胶以导致生物墨水，和2)压缩所述生物墨水以产生具有期望的细胞密度和粘度的生物墨水。在一些实施方案中，通过离心、切向流过滤(“TFF”)或它们的组合来实现生物墨水的压缩。
在一些实施方案中，本文公开的生物墨水的特征在于按体积计的高细胞性，例如，高浓度的活细胞。在进一步的实施方案中，生物墨水包含至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400或更多百万个细胞每毫升溶液。在一个具体的实施方案中，生物墨水包含约50至约300百万个细胞/mL。在一些实施方案中，按体积计具有高细胞性的生物墨水被用于生物打印具有高细胞密度的工程化组织和构建体。在进一步的实施方案中，工程化组织和构建体至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多的细胞。
在一些实施方案中，生物墨水的压缩导致可挤出的组合物，允许形成多细胞聚集体或多细胞体。在一些实施方案中，“可挤出的”是指能够通过喷嘴或孔口(例如，一个或多个孔或管)迫使(例如，在压力下)成形。在一些实施方案中，生物墨水的压缩由生长细胞到适当的密度导致。生物墨水所需的细胞密度将随着所使用的细胞以及所产生的组织或器官变化。
在一些实施方案中，生物墨水的细胞凝聚和/或粘附。在一些实施方案中，“凝聚(cohere)”，“凝聚的(cohered)”和“凝聚(cohesion)”是指结合细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层的细胞-细胞粘附性能。在进一步的实施方案中，这些术语可与“融合(fuse)”，“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。在一些实施方案中，生物墨水还包括支撑材料、细胞培养基(或其补充剂)、细胞外基质(或其组分)、细胞粘附剂、细胞死亡抑制剂、抗细胞凋亡剂、抗氧化剂、挤出化合物和它们的组合。
在一些实施方案中，生物墨水包括癌细胞(例如，肿瘤细胞)。在进一步的实施方案中，癌细胞是一种或多种细胞系的细胞。在其他实施方案中，所述癌细胞是源自患者的肿瘤的原发癌细胞。在一些实施方案中，生物墨水包括间质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和脂肪细胞和/或前脂肪细胞。
在一些实施方案中，生物墨水是适合非生物打印制造方法的生物凝胶。在一些实施方案中，生物凝胶包括癌细胞(例如，肿瘤细胞)。在进一步的实施方案中，癌细胞是一种或多种细胞系的细胞。在其他实施方案中，所述癌细胞是源自患者的肿瘤的原发癌细胞。在一些实施方案中，生物凝胶包括间质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和脂肪细胞和/或前脂肪细胞。
挤出化合物
在一些实施方案中，生物墨水包含挤出化合物(即，改变生物墨水的挤出性质的化合物)。挤出化合物的实例包括，但不限于凝胶、水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇(例如，普朗尼克F-127或PF-127)、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、细胞外基质组分(和其衍生物)、胶原、明胶、其它生物相容性天然或合成聚合物、纳米纤维和自组装的纳米纤维。在一些实施方案中，在生物打印之后，在生物打印细胞凝聚之后，或在生物打印的构建体熟化之后通过物理，化学或酶促方法除去挤出化合物。
合适的水凝胶包括从胶原蛋白、透明质酸盐、透明质酸、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖以及它们的组合衍生的那些。在其他实施方案中，合适的水凝胶是合成的聚合物。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括由聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈以及它们的组合衍生的那些。在各种具体实施方案中，限制材料选自：水凝胶、
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琼脂糖、藻酸盐、明胶、MatrigelTM、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、蚕丝或它们的组合。
在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是可交联的凝胶。在进一步的实施方案，可交联的凝胶包括可通过化学方法交联的那些。例如，在一些实施方案中，合适的水凝胶包括含有藻酸盐的可交联水凝胶。在各种实施方案中，合适的水凝胶包括约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多百分比的藻酸盐。在一些实施方案中，在生物打印之后，可任选地用试剂如CaCl2的溶液孵育构建体以化学交联水凝胶，以便在细胞凝聚之前保存生物打印的结构。此外，在一些实施方案中，任选地用藻酸盐裂解酶孵育生物打印的构建体以酶促降解水凝胶。在进一步的实施方案中，任选地用浓度为约0.2-0.5mg/ml的藻酸盐裂解酶孵育生物打印的构建体以酶促降解水凝胶。
在一些实施方案中，合适的水凝胶包括明胶。在各种实施方案中，合适的水凝胶包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多百分比的明胶。
在一些实施方案中，在挤出化合物或水凝胶中明胶的浓度是约5-15％和藻酸盐的浓度是约0.5-5％。在一个具体的实施方案中，在挤出化合物或水凝胶中明胶的浓度为10％和藻酸盐的浓度是1％。
在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热可逆凝胶(也称为热响应性凝胶或热凝胶)。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在室温下不为液体。在具体实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(T凝胶)为约10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的T凝胶是约10℃至约40℃。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的T凝胶为约20℃至约30℃。在一些实施方案中，本文描述的生物墨水(例如，包括水凝胶，一种或多种细胞类型以及其它添加剂等)在室温下不为液体。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在哺乳动物体温下不为液体。在具体实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(T凝胶)为约22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、41℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的T凝胶是约22℃至约52℃。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的T凝胶是约32℃至约42℃。在一些实施方案中，本文描述的生物墨水(例如，包括水凝胶，一种或多种细胞类型，以及其它添加剂等)在哺乳动物体温下不为液体。在具体的实施方案中，本文描述的生物墨水的胶凝温度(T凝胶)是约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃，包括其中的增量。
由聚氧丙烯和聚氧乙烯组成的聚合物当掺入到水溶液中时形成热可逆凝胶。这些聚合物具有在生物打印机装置可维持的温度下从液态改变至凝胶状态的能力。液态到凝胶状态相变取决于聚合物浓度和溶液中的成分。
在一些实施方案中，通过所描述的任何手段测定本文中呈现的水凝胶和生物墨水的粘度。例如，在一些实施方案中，LVDV-II+CP锥板式粘度计(Cone Plate Viscometer)和锥轴式(Cone Spindle)CPE-40用于计算水凝胶和生物墨水的粘度。在其他实施方案中，Brookfield(轴式和杯式)粘度计用于计算水凝胶和生物墨水的粘度。在一些实施方案中，在室温下测量本文所指的粘度范围。在其他实施方案中，在体温(例如，在健康人的平均体温)下测量本文所指的粘度范围。
在进一步的实施方案中，水凝胶和/或生物墨水的特征在于具有介于约500至1,000,000厘泊之间，约750至1,000,000厘泊之间；约1000至1,000,000厘泊之间；约1000至400,000厘泊之间；约2000和100,000厘泊之间；约3000至50,000厘泊之间；约4000至25000厘泊之间；约5000和20000厘泊之间；或约6000和15,000厘泊之间的粘度。
在一些实施方案中，在使用前去除生物墨水的非细胞组分(例如，挤出化合物等)。在进一步的实施方案中，非细胞组分是，例如，水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原或其他生物相容性天然或合成聚合物。在仍然进一步的实施方案中，通过物理，化学或酶促方法去除非细胞组分。在一些实施方案中，在使用时非细胞组分的比例保持与细胞组分相关联。
预成型支架
在一些实施方案中，本文公开的是不含或基本上不含任何预成型支架的工程化组织和肿瘤模型。在进一步的实施方案中，“支架”是指合成的支架，如聚合物支架和多孔水凝胶，非合成的支架，例如预成型细胞外基质层、死细胞层和脱细胞组织，以及工程化组织和/或器官的物理结构不可或缺的且不从组织和/或器官去除的任何其它类型的预成型支架。在更进一步的实施方案中，脱细胞组织支架包括脱细胞的天然组织或以任何方式通过培养的细胞产生的脱细胞的细胞物质；例如，被允许死亡或脱细胞的细胞层，留下它们所产生的ECM同时存活。
在一些实施方案中，工程化组织和肿瘤模型(包括其阵列)不利用任何预成型支架，例如用于形成组织，组织的任何层，或形成组织的形状。作为非限制性实例，本公开的工程化乳腺和脂肪组织在制造或使用时不利用任何预成型的、合成的支架如聚合物支架，预成型的细胞外基质层，或任何其他类型的预成型支架。在一些实施方案中，工程化乳腺和脂肪组织基本上不含任何预成型支架。在进一步的实施方案中，组织的细胞组分含有可检测的，但痕量或微量的支架，例如，低于总组合物的2.0％，低于1.0％，低于0.5％或低于0.1％。在更进一步的实施方案中，痕量或微量的支架不足以影响组织或它们的阵列的长期行为，或干扰其主要的生物功能。在另外的实施方案中，在打印之后通过物理，化学或酶促方法去除支架组分，得到不含或基本上不含支架组分的工程化组织。
阵列
在一些实施方案中，本文公开的是工程化的乳腺组织的阵列和工程化的肿瘤模型(包括乳腺癌肿瘤模型)的阵列。在一些实施方案中，“阵列”是一种科学工具，其包括在空间上布置成允许对样品执行多个测试，对多个样品执行一个或多个测试，或两者的多个元件的关联。在一些实施方案中，阵列适于或与筛选方法和设备兼容，包括与中或高通量筛选相关联的那些。在进一步的实施方案中，阵列允许同时执行多个测试。在进一步的实施方案中，阵列允许多个样品被同时测试。在一些实施方案中，阵列是细胞微阵列。在进一步的实施方案中，细胞微阵列是一种实验室工具，其允许固体支持体的表面上的活细胞的多重询问(multiplex interrogation)。在其他实施方案中，阵列是组织微阵列。在进一步的实施方案中，组织微阵列包括在阵列中组装以允许执行多个生化、代谢、分子或组织学分析的多个独立的组织或组织样品。
在一些实施方案中，工程化组织和/或肿瘤模型均在生物相容性多孔容器的孔中存在。在一些实施方案中，将每个组织放置在孔中。在其它实施方案中，将每个组织生物打印到孔中。在进一步的实施方案中，涂覆孔。在各种其它实施方案中，用以下中的一种或多种涂覆孔：生物相容性水凝胶、一种或多种蛋白、一种或多种化学物质、一种或多种肽、一种或多种抗体和一种或多种生长因子，包括它们的组合。在一些实施方案中，用
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涂覆孔。在其他实施方案中，用琼脂糖涂覆孔。在一些实施方案中，每个组织存在于生物相容性多孔容器的孔内的多孔的生物相容性膜上。在一些实施方案中，多孔容器的各孔包含两种或更多种组织。
在一些实施方案中，将工程化组织和/或肿瘤模型在一个或多个侧面上固定到生物相容性表面上。许多方法适合于将组织固定到生物相容性表面。在各种实施方案中，将组织适当地固定到生物相容性表面上，例如，沿着一个或多个整个侧面，例如，仅在一个或多个侧面的边缘处，或仅在一个或多个侧面的中心处。在各种另外的实施方案中，用整合到表面中或与所述表面相关联的固定器或载体将组织适当地固定到生物相容性表面。在各种另外的实施方案中，用集成到表面或与所述表面相关联的一个或多个弹簧夹(pinch-clamp)或塑料小块将组织适当地固定到生物相容性表面。在一些实施方案中，通过细胞附着到多孔膜而将组织适当地固定到生物相容性表面。在一些实施方案中，通过在一个或多个侧面上附加到生物相容性表面而将工程化组织和/或肿瘤模型保持在阵列结构中。在进一步的实施方案中，在1，2，3，4或更多个侧面上将组织固定到生物相容性表面。在一些实施方案中，所述生物相容性表面是不对组织或接触组织的有机体带来伤害或毒性的显著风险的任何表面。在进一步的实施方案中，生物相容性表面是适用于传统的组织培养方法的任何表面。合适的生物相容性表面包括，通过非限制性的示例，处理过的塑料、膜、多孔膜、涂覆膜、涂覆塑料、金属、涂覆金属、玻璃、处理过的玻璃以及涂覆的玻璃，其中合适的涂层包括水凝胶、ECM成分、化学品、蛋白质等，并且涂层或处理提供刺激或防止细胞和组织粘附到生物相容性表面的方法。
在一些实施方案中，工程化组织和/或肿瘤模型的阵列包括两个或更多个元件的关联。在各种实施方案中，所述阵列包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个元件的关联，包括其中的增量。在进一步的实施方案中，每个元件包括一种或多种细胞、多细胞聚集体、组织、肿瘤模型或它们的组合。
在一些实施方案中，工程化组织和/或肿瘤模型的阵列包括以预定的模式(pattern)在空间上布置的多个元件。在进一步的实施方案中，所述模式是元件的任何合适的空间布置。在各种实施方案中，布置的模式包括，通过非限制性示例的方式，二维网格、三维网格、一个或多个线、弧或圆，一系列的行或列等等。在进一步的实施方案中，将模式选择成与中等或高通量的生物测定法或筛选方法或设备兼容。
在各种实施方案中，基于特定的研究目的或目标选择用于制造阵列中的一个或多个组织或肿瘤模型的细胞类型和/或细胞源。在进一步的各种实施方案中，基于特定研究目的或目标选择在阵列中的特定的组织或肿瘤模型。在一些实施方案中，将一个或多个特定的工程化组织包含在阵列中，以便于研究特定的疾病或病况。在一些实施方案中，将一个或多个特定的工程化组织包含在阵列中，以便于研究特定对象的疾病或病况。在进一步的实施方案中，用衍生自两个或更多个不同的人供体的一种或多种细胞类型生成阵列内的一个或多个特定的工程化组织。在一些实施方案中，关于细胞类型、细胞的来源、细胞的层，细胞的比率、构建方法、尺寸、形状等，阵列内的每个组织基本上类似。
在一些实施方案中，阵列中的每个组织和/或肿瘤模型在培养基中独立地维持。在进一步的实施方案中，阵列中的每个组织的培养条件，使得它们与其他组织隔离并且不能交换培养基或在培养基中可溶的因子。在其它实施方案中，阵列内的两个或更多个单独的组织交换可溶性因子。在进一步的实施方案中，阵列内的两个或更多个单独的组织的培养条件，使得它们与其它组织交换培养基和在培养基中可溶的因子。在各种实施方案中，阵列内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300个或更多个组织，包括其中的增量，交换培养基和/或可溶性因子。在其他各种实施方案中，阵列内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的组织，包括其中的增量，交换培养基和/或可溶性因子。
工程化的乳腺组织
在一些实施方案中，本文所描述的是三维的，工程化的包括乳腺细胞的生物乳腺组织。许多乳腺细胞适合包含在工程化的乳腺组织中。例如，在各种实施方案中，工程化的乳腺组织合适地包括以下中的一种或多种：成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞以及脂肪细胞。在各种实施方案中，细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或它们的组合。在进一步的实施方案中，工程化的乳腺组织合适地包括以下中的一种或多种：人乳腺成纤维细胞、人内皮细胞、人乳腺上皮细胞以及人脂肪细胞。在仍然进一步的实施方案中，工程化的乳腺组织适当地包括以下中的每一种：人乳腺成纤维细胞、人内皮细胞、人乳腺上皮细胞以及人脂肪细胞。
在一些实施方案中，人内皮细胞是人脐静脉内皮细胞。在一些实施方案中，脂肪细胞源自前体细胞如间充质干细胞，包括骨髓源间充质干细胞。在进一步的实施方案中，脂肪细胞源自前体细胞诸如前脂肪细胞。在这种情况下，脂肪细胞前体细胞在用于制备生物墨水或用于生物打印之前暴露于分化信号。在进一步的实施方案中，在用于制备生物墨水或用于生物打印之前脂肪细胞前体细胞暴露于分化信号以部分预分化所述细胞。在更进一步的实施方案中，脂肪细胞前体细胞或前脂肪细胞在生物打印后完成分化。在一些实施方案中，人脂肪细胞是人皮下脂肪细胞。
本发明人惊奇地发现，存活的分化的脂肪细胞是天然样工程化的乳腺组织的关键。在一些情况下，如果没有在组织的间质中存在这些细胞，则组织不成长，衰竭，并且所得的微结构不重述(recapitulate)天然组织。本发明人还认识到，现有的组织制造方法不适合于分化的脂肪细胞的沉积，因为这些细胞过于脆弱而不能承受所涉及的压缩和剪切力。本文所描述的主题对这两个问题提供了解决方案。
在一些实施方案中，将细胞生物打印。在进一步的实施方案中，将生物打印的细胞凝聚以形成工程化的乳腺组织。在仍然进一步的实施方案中，在制造或使用时，工程化的乳腺组织不含或基本上不含预成型的支架。在一些实施方案中，工程化的乳腺组织是非神经支配的。在进一步的实施方案中，工程化的乳腺组织缺少完整的神经系统和/或熟化的神经组织。在一些实施方案中，工程化的乳腺组织缺少完整的血管系统和/或熟化的脉管系统。在进一步的实施方案中，工程化的乳腺组织不含红血细胞。
许多细胞的组成和比率均适用于工程化的乳腺组织。在一些实施方案中，工程化的乳腺组织包含55％-75％的成纤维细胞，15％-35％的内皮细胞和1％-20％的脂肪细胞。在一个具体的实施方案中，工程化的乳腺组织包含65％的成纤维细胞，25％的内皮细胞和10％的脂肪细胞。在另一个具体实施方案中，工程化的乳腺组织包含65％的成纤维细胞，25％的内皮细胞和10％的脂肪细胞。
许多形状和大小适合于工程化的乳腺组织。以举例的方式，在一个实施方案中，以片的形式生物打印工程化的乳腺组织。通过进一步举例的方式，在其他实施方案中，以立方体或块的形式生物打印工程化的乳腺组织。通过进一步举例的方式，在另一实施方案中，以球体的形式生物打印工程化的乳腺组织。最后，在其他实施方案中，以圆柱体或带状的形式生物打印工程化的乳腺组织。在一些实施方案中，工程化的乳腺组织的最小维度是约250μm至约5mm。在一些实施方案中，工程化的乳腺组织的最大维度是约250μm至约5mm。在一个具体的实施方案中，以每边2或3mm的立方体的形式生物打印工程化的乳腺组织。在这样的实施方案中，在细胞培养条件中熟化一段时间之后所述组织形成球体。
在一些实施方案中，本文还描述了适于在中等或高通量测定，例如药物筛选测定、药物发现测定、药物安全性和毒性测定、药物功效测定等中使用的三维的，工程化的生物乳腺组织的阵列。在一些实施方案中，通过沉积工程化的乳腺组织到多孔板的每个孔中以形成组织的网格来创建阵列。
制造本文所公开的工程化乳腺组织的方法包括生物打印。在一些实施方案中，方法包括提供脂肪细胞分化信号到脂肪细胞前体细胞(如间充质干细胞，前脂肪细胞等)，使得它们可以在没有实质性损害的情况下沉积并稍后完全分化成脂肪细胞。
随后，在一些实施方案中，方法包括制备生物墨水，所述生物墨水包含挤出组合物(例如水凝胶)和乳腺细胞类型如人乳腺成纤维细胞、人内皮细胞、人乳腺上皮细胞和人前脂肪细胞，其已暴露于脂肪细胞分化信号。在一个具体的实施方案中，生物墨水包含，例如，55％-75％的人乳腺成纤维细胞，15％-35％的人内皮细胞，以及1％-20％的人前脂肪细胞。在进一步的实施方案中，生物墨水包含每毫升约50百万个细胞至每毫升约400百万个细胞。
此外，在一些实施方案中，方法包括通过自动化或半自动化沉积装置，如生物打印机沉积生物墨水到生物相容性表面上。在一些实施方案中，生物打印工程化的乳腺组织中的一个或多个组分。在其他实施方案中，生物打印工程化的乳腺组织的各组分。在一个具体的实施方案中，通过生物打印逐层建立工程化的乳腺组织以形成三维结构。
另外，在一些实施方案中，所述方法包括在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的，工程化的生物乳腺组织。在一些实施方案中，细胞培养基去除生物墨水的水凝胶，留下大致的细胞构建体。在一些实施方案中，细胞培养基包括适合于生物墨水中包含的细胞类型的培养基的混合物。例如，在一个特定的实施方案中，细胞培养基包括人成纤维细胞培养基、人内皮细胞培养基和人脂肪细胞分化培养基。
本文所述的工程化乳腺组织具有许多有利的用途。例如，将癌细胞任选地引入工程化的乳腺组织中以形成乳腺癌肿瘤模型。通过进一步举例的方式，对工程化的乳腺组织任选地施加致癌剂以引发事件，以便产生乳腺癌模型。通过进一步举例的方式，制造患病乳腺组织，以便产生患病的乳腺癌模型。此外，在这个例子中，患病乳腺组织任选地暴露于病原体例如一种或多种病毒(成为病毒负载的)或一种或多种细菌(成为细菌负载的)。这样的构建体可用于肿瘤学领域中的研究和用于治疗癌症的疗法的调查。
工程化的肿瘤模型
在一些实施方案中，本文所描述的是三维的，工程化的包括间质组织和肿瘤组织的生物肿瘤模型。在一些实施方案中，间质组织包括间质细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织包括癌细胞。本文所述的工程化的肿瘤模型具有区室化的结构。例如，在一些实施方案中，肿瘤模型的间质组织围绕肿瘤组织。在进一步的实施方案中，肿瘤模型的间质组织在例如，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个或六个或更多个侧面上围绕肿瘤组织。在更进一步的实施方案中，肿瘤模型的间质组织完全包围肿瘤组织，使得肿瘤组织嵌入在间质组织中以形成工程化的肿瘤模型。
许多间质细胞适合于包含在工程化的肿瘤模型中。例如，在各种实施方案中，工程化的肿瘤模型适当地包括以下中的一种或多种：成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、脂肪细胞和免疫细胞如巨噬细胞。在各种实施方案中，细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或它们的组合。许多癌细胞适合于包含在工程化的肿瘤模型中。例如，在各种实施方案中，工程化的肿瘤模型适当地包括以下中的一种或多种：癌细胞系和从患者的肿瘤切除的原发癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织还包含内皮细胞和/或免疫细胞如巨噬细胞。
在一些实施方案中，细胞生物是打印的。在进一步的实施方案中，生物打印的间质细胞凝聚以形成工程化的间质组织。在进一步的实施方案中，生物打印的癌细胞凝聚以形成工程化的肿瘤组织。在更进一步的实施方案中，间质组织和肿瘤组织凝聚以形成工程化的肿瘤模型。在一些实施方案中，工程化的肿瘤模型在制造或使用时不含或基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，工程化的肿瘤模型是非神经支配的。在进一步的实施方案中，工程化的肿瘤模型缺乏完整的神经系统和/或熟化的神经组织。在一些实施方案中，工程化的肿瘤模型缺乏完整的血管系统和/或熟化的脉管系统。在进一步的实施方案中，工程化的乳腺组织不含红血细胞。
在一些实施方案中，本文还描述的是适于在中等或高通量测定，例如药物筛选测定、药物发现测定、药物安全性和毒性测定、药物疗效测定等中使用的三维的、工程化的生物肿瘤模型的阵列。在一些实施方案中，通过沉积工程化的肿瘤模型到多孔板的每个孔中以形成肿瘤模型的网格来创建阵列。
在一些实施方案中，肿瘤模型是乳腺癌肿瘤模型。例如，在这样的实施方案中，间质组织包括人乳腺成纤维细胞、人内皮细胞和人脂肪细胞。在一些实施方案中，间质组织进一步包括人乳腺上皮细胞。在一些实施方案中，间质组织还包括免疫细胞如巨噬细胞。在一些实施方案中，人内皮细胞是人脐静脉内皮细胞。在一些实施方案中，人内皮细胞是人乳腺内皮细胞。在一些实施方案中，脂肪细胞是皮下脂肪细胞或由诸如间充质干细胞和/或前脂肪细胞的脂肪细胞前体衍生的脂肪细胞。此外，在这种实施方案中，肿瘤组织包括乳腺癌细胞。在一些实施方案中，乳腺癌细胞是乳腺癌细胞系的细胞。在其他实施方案中，乳腺癌细胞是从切除的患者肿瘤衍生的细胞。在一些实施方案中，肿瘤组织还包含内皮细胞和/或免疫细胞如巨噬细胞。
体内的多种组织具有特征“腺”或“分泌”结构和功能，其中该组织内的专门的上皮细胞产生激素、蛋白质、酶或对其它细胞和组织施加局部和/或全身作用的物质。分泌组织可以是外分泌的，其中所产生的物质通常从身体排出或通过互连管道系统从一个位置到另一个位置。这里的例子可包括由外分泌胰腺产生消化酶，由汗腺产生汗水和由皮脂腺产生油。分泌组织也可以是内分泌的-身体的产生激素的组织，包括内分泌胰腺、卵巢、睾丸、甲状腺、垂体和肾上腺。
在分泌组织中存在通用结构性“主题(theme)”，其中存在下面的属性。专门的上皮细胞共定位到聚集体或具有腔的空心结构内；这些细胞通过一种或多种机制分泌调节或排泄物质-上皮细胞的共关联形成“隔室”，其中上皮细胞的相对比例比其它细胞类型的相对比例大。上皮细胞的隔室由支持间质包围。取决于组织类型，间质的组成可以变化。最低限度地，组织间质通常包含一些血管细胞和成纤维细胞。在一些组织中，支持间质还可以包括平滑肌细胞、高度专门化的间充质细胞、神经细胞、免疫细胞、淋巴细胞和/或脂肪细胞。间质的特定细胞组分也可以被区室化，在于可能存在纤维间质、肌肉间质、纤维血管间质或脂肪组织的不同区域。含上皮细胞的肿瘤通常表现出与上述那些类似的空间组织模式；腺癌、导管癌、畸胎瘤以及肝胚细胞瘤是可以具有间质和上皮的特有的区室化模式的肿瘤类型的所有实例。同样地，在区室化的分泌组织中形成的肿瘤通常具有区室化的组织模式，其中，正常组织所固有的间质和上皮模式以某种方式被破坏，从而由于上皮：间质的整体比率相对于正常组织的一般干扰而导致整个组织模式改变。因此，在一些实施方案中，肿瘤模型是“腺”或“分泌”组织癌肿瘤模型。
本文所公开的制造工程化的肿瘤模型的方法包括生物打印。在一些实施方案中，方法包括制备含有挤出化合物例如水凝胶和多种间质细胞类型的间质生物墨水。在进一步的实施方案中，间质细胞类型包括，例如，内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和/或脂肪细胞、前脂肪细胞，或脂肪细胞和前脂肪细胞的组合。在前脂肪细胞的情况中，细胞预先暴露于分化信号。在一些实施方案中，该方法还包括制备包含水凝胶和癌细胞类型的肿瘤生物墨水。在一些实施方案中，癌细胞类型是癌细胞系。在其他实施方案中，癌细胞是源自切除的患者肿瘤或患者肿瘤的活组织检查的原发癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤生物墨水还包含内皮细胞和/或免疫细胞如巨噬细胞。
随后，在一些实施方案中，方法包括沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水由间质生物墨水围绕并与间质生物墨水接触。在进一步的实施方案中，肿瘤模型的间质组织从例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或六个或更多个侧面围绕肿瘤组织。在更进一步的实施方案中，肿瘤生物墨水完全由间质生物墨水围绕并从各个侧面与间质生物墨水接触。在一些实施方案中，生物墨水的沉积通过自动化或半自动化的沉积设备诸如生物打印机来实现。
在一些实施方案中，通过生物打印逐层地建立工程化的肿瘤模型以形成三维结构。在进一步的实施方案中，沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水还包括：在表面上沉积间质生物墨水的一个或多个层以形成第一片间质生物墨水；在第一片间质生物墨水上沉积间质生物墨水的连续边界的一个或多个层以限定在一侧开口的隔室；在隔室中沉积肿瘤生物墨水的一个或多个层以形成肿瘤生物墨水的结；并沉积间质生物墨水的一个或多个层以形成第二片间质生物墨水以关闭隔室的开口侧。
此外，在一些实施方案中，所述方法包括在细胞培养基中熟化沉积的生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的工程化的生物肿瘤模型。在一些实施方案中，细胞培养基中的熟化移除水凝胶，留下基本上为细胞的构建体。
在一些实施方案中，水凝胶是可交联的或可逆交联的并且方法包括交联沉积的生物墨水以在细胞凝聚之前促进肿瘤模型结构的维持。在进一步的实施方案中，该方法包括在细胞凝聚后通过酶促降解除去交联的水凝胶。本发明的发明人已经发现，使用这样的可交联挤出化合物(例如，水凝胶)最好地实现本文所述的肿瘤模型结构，如果没有这些，往往在肿瘤模型融合之前丢失区室化结构(compartmentalized architecture)。
本文描述的工程化的肿瘤模型，包括乳腺癌肿瘤模型，具有许多有利的用途。例如，从患者的肿瘤切除的原发癌细胞可以用于形成肿瘤组织，以创建定制的体外肿瘤模型以调查该患者的疾病。这样的个性化的肿瘤模型任选地用于评估潜在的疗法并确定疗法，如化疗化合物和生物制剂，其可有效地治疗患者的疾病。这样的构建体可用于肿瘤学领域中的研究和用于调查治疗癌症的疗法。
将乳腺肿瘤模型直接制作成多孔平板并用于建立对信号中介物如雌二醇、孕酮、催乳素和HGF以及标准化疗剂顺铂、紫杉醇、氨甲蝶呤和他莫昔芬的生物反应曲线。除了荧光活/死和细胞毒性测定法，通过用细胞类型特异性标记物染色来评估化学治疗药物对新组织内的特定细胞类型的效果。将三维乳腺癌肿瘤模型对生长因子，激素和化学治疗剂的响应与二维乳腺癌细胞系的响应进行比较。本文所描述的模型优于用于筛选新型抗癌靶标的现有模型，本文所描述的模型在体内微环境的背景下具有更好的靶向癌细胞的效率和准确性。
本文所述的工程化的肿瘤模型的优点包括，但不限于：
·该肿瘤模型保持具有间质细胞和癌细胞之间的相互作用的区室化结构。
·生物打印间质隔室之后，观察内皮细胞网络的形成和脂肪细胞的分化。
·肿瘤模型显示出类天然药物渗透和对化疗化合物的响应。当用相同剂量的他莫昔芬处理相同的持续时间时，分离的二维癌细胞相对于并入三维生物打印构建体内的细胞更易受他莫昔芬诱导的毒性的影响。
测定
在一些实施方案中，本文描述的工程化组织，包括乳腺组织和肿瘤模型，包括乳腺癌肿瘤模型用于体外测定。在一些实施方案中，“测定”是用于测试或测量有机或生物样品(例如，细胞聚集体、组织、器官、生物体等)中的物质(例如，化学、分子、生物化学、药物等)的存在或活性的程序。在进一步的实施方案中，测定包括定性测定和定量测定。在更进一步的实施方案中，定量测定测量样品中的物质的量。
在各种实施方案中，本文描述的工程化组织，包括乳腺组织和肿瘤模型，包括乳腺癌肿瘤模型用于，通过非限制性实例的方式，基于图像的测定、分泌的蛋白质的测量、标记物的表达和蛋白质的产生。在各种另外的实施方案中，本文描述的工程化组织，包括乳腺组织和肿瘤模型，包括乳腺癌肿瘤模型，用于检测或测量以下中的一个或多个的测定法：分子结合(包括放射性配体结合)、分子摄取、活性(例如，酶活性和受体活性等)、基因表达、蛋白质表达、受体激动、受体拮抗作用、细胞信号传导、细胞凋亡、化学疗敏感性、转染、细胞迁移、趋化性、细胞生存能力、细胞增殖、安全性、药效、代谢、毒性和滥用倾向。
在一些实施方案中，本文描述的工程化组织，包括乳腺组织，和肿瘤模型，包括乳腺癌肿瘤模型，用于免疫测定法。在进一步的实施方案中，免疫测定法是竞争性免疫测定法或非竞争性免疫测定法。在竞争性免疫测定法中，例如，样品中的抗原与标记抗原竞争与抗体结合，然后测量与抗体位点结合的标记抗原的量。在非竞争性免疫测定(也被称为“三明治测定”)中，例如，样品中的抗原与抗体位点结合；随后，标记的抗体与抗原结合，然后测量位点上的标记抗体的量。
在一些实施方案中，本文描述的工程化组织，包括乳腺组织，和肿瘤模型，包括乳腺癌肿瘤模型，用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。在进一步的实施方案中，ELISA是用于检测样品中的抗体或抗原的存在的生化技术。在ELISA中，例如，利用对特定抗原具有特异性的至少一种抗体。通过进一步举例的方式，非特异性地(通过吸附至表面)或特异性地(通过对相同抗原特异性的另一抗体捕获，在“三明治”ELISA中)将具有未知量的抗原的样品固定在固体载体(例如，聚苯乙烯微量滴定板)上。通过进一步举例的方式，抗原被固定后，加入检测抗体，形成与抗原的复合物。检测抗体，例如，共价连接到酶，或本身由通过生物缀合连接于酶的二级抗体检测。
例如，在一些实施方案中，细胞、多细胞聚集体或组织的阵列、微阵列、或芯片用于药物筛选或药物发现。在进一步的实施方案中，组织的阵列、微阵列或芯片用作用于药物筛选或药物发现的试剂盒的一部分。在一些实施方案中，每个血管壁段存在于生物相容性多孔容器的孔内，其中所述容器与一个或多个自动化的药物筛选程序和/或设备兼容。在进一步的实施方案中，自动化的药物筛选程序和/或设备包括任何适当的程序或计算机或机器人辅助的设备。
在一些实施方案中，用于药物筛选测定或药物发现测定的阵列用于研究或开发在任何治疗领域可能有用的药物。在更进一步实施方案中，适合的治疗领域包括，通过非限制性示例的方式，感染性疾病、血液学、肿瘤学、儿科学、心脏病学、中枢神经系统疾病、神经病学、胃肠病学、肝病学、泌尿学、不孕不育、眼科学、肾脏学、骨科、疼痛控制、精神病学、肺病学、疫苗、伤口愈合、生理学、药理学、皮肤病学、基因治疗、毒物学和免疫学。
在一些实施方案中，用于治疗筛选测定法或治疗发现测定法的阵列用于鉴定在特定的个体或个体组的疾病或病况中可能有用的疗法。例如，在一些实施方案中，本文描述的方法包括利用特定的个体的细胞来工程化组织、疾病模型或肿瘤模型。在进一步的实施方案中，该方法包括应用候选治疗剂到组织或模型；测量细胞的生存能力；和基于细胞的所测定的生存能力选择用于个体的治疗剂。在仍然进一步的实施方案中，候选治疗剂是一种或多种化疗化合物，一种或多种放射性药物化合物，放射治疗或它们的组合。因此，本文公开的是对个体或个体组个性化药物的方法。
工程化的含脂肪细胞的组织
如本文所述，以前的组织制造技术未能充分提供含有充分存活的，分化的脂肪细胞的工程化组织，这主要是由于脂肪细胞的脆弱和易受伤害。在一些实施方案中，本文所描述的是包括存活的分化的脂肪细胞的，三维的，工程化的生物肿瘤模型。存活的脂肪细胞是在一些组织中形成天然样微结构的一个重要因素。
在一些实施方案中，组织是脂肪丰富或脂肪依赖性组织。在进一步的实施方案中，组织是脂肪组织。在一些实施方案中，组织包括，例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多的存活的，分化的脂肪细胞。在一个特定的非限制性的实施方案中，组织包括至少约5％或至少约10％的存活的，分化的脂肪细胞。
在一些实施方案中，例如，在制造后，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多的脂肪细胞是存活的。在一个特定的，非限制性的实施方案中，在制造后，至少约50％或至少约75％的脂肪细胞是存活的。在各种实施方案中，脂肪细胞生存能力延伸至制造后约1、2、3、4、5、6、7、8或更多天。在进一步实施方案中，在制造后，脂肪细胞分泌检测量的瘦素。在各种实施方案中，瘦素分泌延伸至制造后约1、2、3、4、5、6、7、8或更多天。
在一些实施方案中，脂肪细胞是生物打印的。在进一步的实施方案中，生物打印的脂肪细胞凝聚以形成工程化组织。在一些实施方案中，在制造时或使用时含脂肪细胞的工程化组织不含或基本上不含预成型支架。在一些实施方案中，含脂肪细胞的工程化组织是非神经支配的。
在一些实施方案中，脂肪细胞是皮下脂肪细胞。在一些实施方案中，脂肪细胞源自脂肪细胞前体细胞，例如间充质干细胞(包括骨髓源间充质干细胞)或前脂肪细胞。
本文所述的方法允许生物打印含存活的，分化的脂肪细胞的组织，所述存活的，分化的脂肪细胞是许多组织和肿瘤模型中的关键间质组分。
制造本文所公开的工程化脂肪组织的方法包括生物打印。在一些实施方案中，方法包括提供脂肪细胞分化信号到脂肪细胞前体如干细胞或前脂肪细胞。在进一步的实施方案中，脂肪细胞前体如干细胞或前脂肪细胞在生物打印时至少部分地预分化。
随后，在一些实施方案中，方法包括制备生物墨水，其含有挤出化合物，例如水凝胶，前脂肪细胞，以及如内皮细胞的至少一种其他细胞类型。
此外，在一些实施方案中，方法包括通过自动化或半自动化的沉积装置，如生物打印机在表面上沉积生物墨水。在一个具体的实施方案中，通过生物打印逐层地建立工程化组织以形成三维结构。
此外，在一些实施方案中，方法包括在细胞培养基中熟化生物墨水以使细胞凝聚，以形成三维的，工程化的生物构建体，所述构建体包含存活的，分化的脂肪细胞。在进一步的实施方案中，细胞培养基中的熟化也除去水凝胶，留下基本上为细胞的构建体。
参见图23，通过本文描述的方法生物打印脂肪组织。在该实施方案中，脂肪细胞是分化的，存活的，并产生特征的脂质沉积，如通过用油红O染色所显示的。
实施例
以下说明性实施例代表本文描述的软件应用，系统和方法的实施方案，并且不意味着以任何方式进行限制。
实施例1-工程化的人乳腺组织模型
制造
根据图1所示的示意图将具有尺寸3mm×3mm×3mm的6层立方体生物打印到6孔组织培养板中的Transwell膜上(结构1)。底部的两个和顶部的两个层由75％的正常人乳腺成纤维细胞(NHMF)和25％的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)组成。中间两层由围绕在含藻酸盐和明胶的水凝胶(
Figure BDA0001171143550000381
2.0系统；Organovo，CA)中重悬浮的人乳腺上皮细胞(HMEC)的核心以产生包含50-300百万细胞/mL的生物墨水的75％NHMF/25％HUVEC的生物打印的正方形组成。生物打印之后，立即用50mM CaCl2孵育结构2分钟，并培养6天。在培养的第6天，将构建体用藻酸盐裂解酶孵育以降解水凝胶，并孵育另外24小时。
结果
通过对细胞类型特异性标记物的组织学染色进行结构1的评估。结构1的代表性H&E染色如图2所示。参见图2，在制造后第7天制备H&E染色的样本；顶行(A-D)显示2X放大率且底行(E-H)显示20X放大率；从左至右第一列(A和E)包括水凝胶，第二列(B和F)包括水凝胶并用裂解酶处理，第三列(C和G)包括ECM，和最后一列(D和H)包括ECM并用裂解酶处理。
为波形蛋白和TE7染色构建体(制造后第7天)，所述波形蛋白和TE7为人乳腺成纤维细胞的标记物，其定位于构建体的外部部分并从内部排除，在那里生物打印HMEC细胞。参见图3A-3D。在图3A-3D的每个图中，顶行(A-C)显示波形蛋白(绿色)且底行(D-F)显示TE7(绿色)；第一列(A和D)显示10X放大率，第二列(B和E)显示20X放大率，并且最后一列(C和F)显示60X放大率。图3A的构建体包括ECM，图3B的构建体包括水凝胶，图3C的构建体包括ECM并用裂解酶处理，和图3D的构建体包括水凝胶并用裂解酶处理。
为了显现构建体中的NHMF和HMEC细胞的相对位置，除了用DAPI(蓝色)还用抗波形蛋白(红色)和泛细胞角蛋白(绿色)的抗体染色组织。参见图4。正如预期的，上皮细胞朝向构建体的中心集中。参见图4，第一列(A，H和L)显示5X放大率，第二列(B，E，I和M)显示10X放大率，第三列(C，F，J和N)显示20X放大率，并且最后一列(D，G，和K)显示60X放大率；第一行(A-D)的构建体包括ECM，第二行(E-G)的构建体包括ECM并用裂解酶处理，在第三行(H-K)的构建体包括水凝胶，和最后一行(L-N)的构建体包括水凝胶并用裂解酶处理。
为了显现构建体中的NHMF和HUVEC细胞的相对位置，将组织用抗波形蛋白(红色)和CD31(绿色)抗体以及DAPI(蓝色)染色。参见图5。关于图5，第一列(A，D，G和J)显示10X放大率，第二列(B，E，H和K)显示20X放大率，并且最后一列(C，F，I，和L)显示60X放大率；第一行(A-C)的构建体包括ECM，第二行(D-F)的构建体包括ECM并用裂解酶处理，第三行(G-I)的构建体包括水凝胶，最后一行(J-L)的构建体包括水凝胶并用裂解酶处理。
在所有分析的构建体中发现CD31+细胞的稳健的网络，一些区域展示微脉管形成的证据。虽然据发现CD31+细胞主要朝向构建体的外表面，据发现细胞离构建体的内部约1-2mm。为了评估整体ECM沉积，进行Masson三色染色。参见图6。在用裂解酶处理过的组织中观察到显著的ECM沉积。参见图6，第一列(A和D)显示5X放大率，第二列(B和E)显示10X放大率，并且最后一列(C和F)显示20X放大率；第一行(A-C)的构建体包括ECM并用裂解酶处理，第二行(D-F)的构建体包括水凝胶并用裂解酶处理。
实施例2–具有脂肪组织的工程化的人乳腺组织模型
制造
将尺寸为5mm×5mm×500μm的盒子生物打印到6孔组织培养板中的Transwell膜上，如图7A所示(结构2)。首先，生物打印由90％的骨髓来源的间充质干细胞(bmMSC)和10％的HUVEC组成的500μm间质生物墨水圆柱体以形成盒形。将HMEC细胞与10％明胶水凝胶混合以形成上皮生物墨水并生物打印到间质生物墨水盒的中间，其中所述HMEC生物墨水不触及间质生物墨水边界。由75％NHMF和25％HUVEC组成的第三种生物墨水用于填充间质生物墨水边界和中间的HMEC生物墨水之间的空间。孵育构建体10天。图7B描述制造后的结构2和图7C和7D描绘制造后第10天的结构2。在孵育期间bmMSC被提供有脂肪细胞分化信号以产生存活的，分化的人类脂肪细胞。
结果
通过对细胞类型特异性标记物的组织学染色进行结构2的评估。结构2的代表性H&E染色如图8所示。参见图8，在制造后第10天制备H&E染色的样本；第一行(A和B)显示5X放大率，第二行(C和D)显示10X放大率，并且最后一行(E和F)显示20X放大率。
几种不同的细胞标记物的染色示于图9(CD31，内皮细胞；波形蛋白，成纤维细胞；FABP4，脂肪细胞；泛细胞角蛋白，上皮细胞)。油红O染色用于证明从构建体的外部上的bmMSC分化的脂肪细胞中的脂滴的存在。
参见图9，第一行(A-D)显示5X放大率，第二行(E-H)显示10X放大率，第三行(E-H)显示20X放大率，和最后一行(M)显示60X放大率；将第一列的构建体(A，E，和I)进行CD31(绿色)、波形蛋白(红色)染色以及用DAPI(蓝色)处理，将第二列的构建体(B，F和J)进行FABP4(绿色)染色以及用DAPI(蓝色)处理，将第三列的构建体(C，G和K)进行泛细胞角蛋白(绿色)、波形蛋白(红色)染色以及用DAPI(蓝色)处理，并且将最后一列的构建体(D，H，L和M)用油红O(冷冻切片)进行染色。
所有的细胞类型存在于结构中，其中CD31+内皮细胞的网络在整个构建体中形成。上皮细胞被局限于构建体的内部。脂肪细胞分化的标记物(油红O和FABP4)据发现朝向构建体的外部，与生物墨水中bmMSC衍生的脂肪细胞的存在一致。
实施例3-工程化的人乳腺癌肿瘤模型
生成生物打印的乳腺癌构建体，其中由MCF7乳腺癌细胞和人脐静脉内皮(HUVEC)细胞组成的癌细胞结由正常人乳腺成纤维细胞(NHMF)，HUVEC细胞和皮下前脂肪细胞(SPA)组成的间质隔室从各个侧面包围。通过结合细胞和可逆交联的含海藻酸盐的水凝胶(
Figure BDA0001171143550000411
3.0系统；Organovo，CA)产生生物墨水。
图10A显示示意图，其描绘了构建体的结构(结构3)。图10B显示生物打印和水凝胶交联后的构建体的即时照片。图10C显示酶处理以除去水凝胶后第2天的构建体，其中该构建体显示组织的凝结以及平滑的实性结节的产生。
细胞培养
正常人乳腺成纤维细胞(NHMF)购自ScienCell(卡尔斯巴德，CA)并根据制造商的说明培养。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自BD Biosciences(圣何塞，CA)并在EGM-2内皮细胞培养基(Lonza，Allendale，NJ)中培养。
皮下前脂肪细胞(SPA)购自Zen-Bio(Research Triangle Park，NC)并在用于扩张的皮下前脂肪细胞培养基中培养。在生物打印前三天，在脂肪细胞分化培养基(Zen-Bio)中培养细胞。图11显示在生物打印当天在细胞内可见积累的早期脂滴(箭头)。
MCF7细胞购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)或美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)并根据制造商的说明培养。
生物打印
构建体的间质隔室由65％NHMF，25％HUVEC和10％SPA(部分预分化)组成。该构建体的癌症隔室由75％MCF7，25％HUVEC组成。对于每一个隔室，将细胞以指定的比例混合在一起，并以150百万个细胞/ml的浓度重新悬浮于
Figure BDA0001171143550000421
3.0中。将构建体打印成尺寸为3mm×3mm×0.75mm的3层状结构。在生物打印之后，立即通过交联稳定构建体。2分钟后，将钙交联溶液吸出并用培养基代替。在培养基中2天后，用溶解在培养基中的酶处理构建体过夜，以除去
Figure BDA0001171143550000422
3.0。然后孵育构建体另外9天。
用化疗化合物处理构建体
将购自Sigma-Aldrich的所有化合物溶解在DMSO中。将化合物稀释至在培养基中的10μΜ或100μΜ的最终浓度。最终的DMSO浓度为0.1％，其用于载体处理。通过alamarBlue测定法(Life Technologies，卡尔斯巴德，CA)或CellTiter Glo测定法(Promega，麦迪逊，WI)评估构建体的代谢活性。处理构建体24小时用于标记的化合物摄取研究，或处理4天用于代谢活性的评估。
瘦素ELISA
每日收集来自构建体的条件培养基，持续9天。以1：2稀释培养基并根据制造商(Life Technologies)的说明评估瘦素分泌。
组织学
在室温下在2％多聚甲醛溶液(2％多聚甲醛，l0mM氯化钙，50mM蔗糖，在PBS中)中原位固定构建体24小时。24小时后，除去固定溶液并用70％乙醇替换。使用自动组织处理器(Tissue-Tek，Sakura Finetek Europe BV，荷兰)处理构建体用于石蜡包埋。在用石蜡渗透之后，将构建体包埋在石蜡模中并使用旋转切片机(Jung Biocut 2035，LeicaMicrosystems，Buffalo Grove，IL)生成5μm切片。为了苏木精和伊红染色，将载玻片在二甲苯中脱蜡并通过100％，95％，70％和50％乙醇再水化并在蒸馏水中冲洗。将载玻片浸渍在吉尔的苏木精(Fisher Scientific，匹兹堡，PA)中。用蒸馏水冲洗之后，将载玻片短暂地浸渍在0.2％v/v的氢氧化铵中。在用蒸馏水冲洗后，将载玻片浸在伊红水溶液(美国MasterTech)中。然后通过乙醇梯度使载玻片脱水，在二甲苯中清洗，并用树脂封片剂(CytoSeal，Fisher Scientific)封片。根据制造商的说明(美国MasterTech)进行Masson三色染色。
为了免疫组织化学分析，将载玻片在二甲苯中脱蜡并通过按序地将其浸入100、95、70和50％的乙醇中最终在蒸馏水中洗涤再水化。使用标准微波炉加热该溶液和载玻片使再水化的切片在10mM柠檬酸钠pH 6.0中经历热介导的抗原修复，随后缓慢冷却30分钟。然后用Tris-缓冲的盐水(TBS)中的10％山羊血清封闭载玻片1小时，接着在4℃下用初级抗体孵育过夜。利用以下初级抗体：小鼠抗细胞角蛋白8(1：100；Abcam，剑桥，MA)；兔抗CD31(1：100；Abcam)；鼠抗TE7(1：250；EMD Millipore，Billerica，MA)；小鼠抗胶原4(1：250；Abcam)。然后在具有0.1％吐温20的TBS中洗涤切片三次并用在TBS中稀释1：200的AlexaFluor 488或AlexaFluor 568缀合的二级抗体(Life Technologies，卡尔斯巴德，CA)孵育。然后在TBS-0.1％吐温20中洗涤切片三次，用蒸馏水冲洗，并用含DAPI的封片剂(Vector Labs，伯林格姆，CA)进行封片。
用于冷冻切片的构建体的制备
将构建体用DPBS冲洗一次，浸渍在Tissue-Tek OCT化合物(Sakura FinetekEurope B.V.，荷兰)中，并快速冷冻。然后在低温恒温器上以5μm切片冷冻块(LeicaCryocut 1800，Leica Microsystems)。将切片的载玻片卡扣固定在-20℃的液体丙酮中并使其在室温下空气干燥20分钟。对于油红O染色，将载玻片在蒸馏水中再水化，并浸入60％的异丙醇中2分钟。在室温下用60％的异丙醇中的0.3％w/v油红O(Sigma-Aldrich)染色载玻片，然后用60％异丙醇冲洗1分钟。将载玻片在吉尔的苏木精中短暂地沉浸以复染。将载玻片用蒸馏水冲洗，并用水性封片剂(美国MasterTech)进行封片。对于荧光化合物的成像，将载玻片用含有DAPI的封片剂进行封片。
显微镜
使用Zeiss Axioskop显微镜(Zeiss，Jena，德国)成像H&E染色，三色染色和油红O染色切片。用Insight 2相机和Spot 5.0软件(Diagnostic Instruments公司，斯特灵海茨，MI)获取图像。用Zeiss Axiolmager显微镜成像荧光染色载玻片并用Zeiss ICM-1相机和Zen Pro软件获取图像。
结果
生物打印的乳腺癌肿瘤模型显示随着时间的推移的瘦素分泌。持续9天每日收集来自生物打印的乳腺癌构建体的条件培养基并通过ELISA测定评估其瘦素分泌。在整个9天的培养期均产生瘦素，这反映在生物打印之后前脂肪细胞的持续分化。参见图12。
用标记的化疗化合物处理生物打印的癌症肿瘤模型显示构建体结构的保留和药物渗透的天然样模式。用100μΜ化合物处理构建体24小时，并整个冷冻切片以评估标记的药物的渗透。图13A显示为作为MCF7乳腺癌细胞的标记物的细胞角蛋白8染色的组织切片，表明在构建体的中心处的癌细胞的保留。图13B显示仅用OregonGreen 488荧光团处理的构建体，并在整个构建体中观察到荧光。图13C显示用OregonGreen 488-紫杉醇处理的构建体，并且该化合物的渗透仅限于构建体的外部～200μm。
药物处理之后的构建体生存能力的评估显示天然样药物响应。将构建体用10μΜ化合物处理3天，接着用100μΜ化合物处理24小时。参见图14，通过AlamarBlue测定法评估生存能力，具有指示代谢活性细胞的较高的荧光强度。顺铂和紫杉醇相对于培养基或载体对照减少构建体的生存能力。
实施例4-工程化的人乳腺癌肿瘤模型
制造
根据图15A中所示的示意图生物打印乳腺癌肿瘤模型(结构4)。乳腺癌肿瘤模型包括由生理上相关的间质层围绕的人乳腺癌细胞的结节，所述生理上相关的间质层包括从人间充质干细胞分化的人脂肪细胞、人乳腺成纤维细胞和人内皮细胞。脂肪细胞源自在制备生物墨水和生物打印之前分离并且暴露于脂肪细胞分化信号的间充质干细胞。图15B显示生物打印后构建体的即时照片。
结果
通过对细胞类型特异性标记物进行染色实施结构4的组织学分析以评估组织结构和细胞类型的相对位置。参见图16，顶行显示H&E染色(A)和Masson三色染色(B)，其中乳腺癌细胞用CellTracker绿色CMFDA标记。图16C显示对内皮细胞(CD31，红色)，癌细胞(绿色)染色并进一步用DAPI处理的组织。图16D显示对成纤维细胞(TE7，红色)，癌细胞(绿色)染色并进一步用DAPI处理的组织。图16E显示对IV型胶原(红色)，癌细胞(绿色)染色并进一步用DAPI处理的组织。参见图17，顶行显示H&E染色(A)和Masson三色染色(B)，其中胶原蛋白由蓝色染色指示。在最底行，E-钙粘蛋白(绿色)和TE7(红色)染色分别指示癌细胞和成纤维细胞(C)，和CD31(绿色)染色指示在含有成纤维细胞的间质隔室中形成微脉管的区域(TE7，红色)(D)。
构建体中的脂肪细胞分泌瘦素，其表明生物打印的构建体内的脂肪细胞的持续分化。参见图18，每24小时收集来自构建体的条件培养基，并通过ELISA评估其瘦素分泌。显示的数据代表平均值±标准偏差。
为了评估构建体与构建变异性，对三个乳腺癌肿瘤模型实施代谢测定法。参见图19，对三个单独的肿瘤模型评价作为时间(A)的函数的alamarBlue底物的代谢并将三个单独的肿瘤模型溶解在CellTiter Glo试剂中并评估相对荧光素强度(B)。通过细胞代谢测定法观察到低的构建体与构建体变异性。
将乳腺癌肿瘤模型暴露于化疗化合物以便访问药物响应。参见图20，仅用培养基，DMSO或10μΜ他莫西芬处理在二维细胞培养物中生长的乳腺癌细胞(A)和生物打印的乳腺癌肿瘤模型(B)48小时并由ATP荧光素酶测定法评估存活率。对于每幅图，*表示与对照相比的处理的p<0.05。当用相同剂量的他莫昔芬处理相同的持续时间时，分离的二维癌细胞相比于结合到三维生物打印的构建体中的细胞更易受到他莫昔芬诱导的毒性影响。
参见图21，也评估用100μΜ化疗化合物处理之后的代谢活性。用化合物处理单独的MCF7细胞(黑色柱)或乳腺癌肿瘤模型(灰色柱)48小时(MCF7)或每天处理持续4天(三维生物打印的乳腺癌肿瘤模型)并通过CellTiter Glo ATP荧光素酶测定法评估存活率。所示数据代表载体对照的平均百分比±标准偏差。
参见图22，用载体(A-C)或100μΜ顺铂(D-F)处理生物打印的组织4天。第一列(A和D)和第二列(B和E)显示了通过TUNEL染色(绿色)评估细胞凋亡的组织和癌细胞的标记物(CK8，红色)。最后一列(B和E)显示通过TUNEL染色(绿)评估细胞凋亡的组织和成纤维细胞的标记物(TE7，红色)。图22表明相比于在癌症隔室中，顺铂在生物打印的组织的间质隔室中诱导更多的细胞凋亡。
实施例5-工程化的脂肪组织
制造
制备由90％骨髓来源的间充质干细胞(脂肪细胞的前体)和10％的HUVEC组成的生物墨水。用Novogen生物打印机(Organovo；圣地亚哥，CA)沉积生物墨水为盒，其中不存在其他细胞类型并且允许在脂肪细胞分化培养基中熟化10天。
结果
用油红O，中性脂类的标记物染色熟化的脂肪组织。图23显示了表明显著的脂质产生的染色的组织的显微照片。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选的实施方案，对于本领域技术人员将显而易见的是仅通过举例的方式提供这样的实施方案。本领域技术人员将会想到不脱离本发明的范围的许多变化、改变和替换。但是应当理解的是，在此描述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。

Claims (21)

1.一种三维的、工程化的生物肿瘤模型，其包括：
a.间质组织，其中所述间质组织包括在生物打印时分化的人前脂肪细胞，所述人前脂肪细胞在生物打印后分化成脂肪细胞；和
b.肿瘤组织；
所述肿瘤组织包括癌细胞，所述肿瘤组织与所述间质组织接触以形成三维的、工程化的生物肿瘤模型；
条件是所述间质组织是由间质生物墨水生物打印的，所述间质生物墨水包含暴露于分化信号的人前脂肪细胞；并且，所述肿瘤组织是由肿瘤生物墨水生物打印的。
2.如权利要求1所述的肿瘤模型，其中，所述肿瘤组织由所述间质组织在各个侧面包围以形成三维的、工程化的生物肿瘤模型。
3.如权利要求2所述的肿瘤模型，其中，所述肿瘤组织由所述间质组织在各个侧面完全包围以形成三维的、工程化的生物肿瘤模型。
4.如权利要求1所述的肿瘤模型，其中，所述模型基本上不含预成型支架。
5.如权利要求1所述的肿瘤模型，其中，所述间质组织还包括：
a.内皮细胞，和
b.成纤维细胞。
6.如权利要求1所述的肿瘤模型，其中，所述肿瘤组织包括内皮细胞。
7.如权利要求1所述的肿瘤模型，其中，所述肿瘤模型是人乳腺癌模型，所述间质组织是包含人乳腺成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞和在生物打印时分化的人前脂肪细胞的人乳腺间质，其中所述人前脂肪细胞在生物打印后分化成脂肪细胞，并且所述肿瘤组织是人乳腺肿瘤。
8.根据权利要求1所述的肿瘤模型，其中所述间质生物墨水和所述肿瘤生物墨水各自包含可逆交联的挤出化合物，所述挤出化合物用于在所述细胞凝聚之前物理稳定所述肿瘤模型结构，其中所述挤出化合物是含有藻酸盐的可交联水凝胶。
9.一种制造三维的、工程化的生物肿瘤模型的方法，所述方法包括：
a.向人前脂肪细胞提供脂肪分化信号；
b.制备间质生物墨水，所述间质生物墨水包含多种间质细胞类型，所述间质细胞类型包含人前脂肪细胞；
c.制备肿瘤生物墨水，所述肿瘤生物墨水包含癌细胞类型；
d.沉积间质生物墨水和肿瘤生物墨水，使得肿瘤生物墨水与间质生物墨水接触；以及
e.在细胞培养基中熟化所沉积的生物墨水，以使细胞凝聚，以形成三维的、工程化的生物肿瘤模型；
其中所述间质生物墨水包括在生物打印时分化的人前脂肪细胞，所述人前脂肪细胞在生物打印后分化成人脂肪细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述肿瘤组织由所述间质组织在各个侧面包围。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述肿瘤组织由所述间质组织在各个侧面完全包围。
12.如权利要求9所述的方法，其中，所述生物墨水通过生物打印沉积。
13.如权利要求9所述的方法，其中，所述间质细胞类型还包括内皮细胞和成纤维细胞。
14.如权利要求9所述的方法，其中，所述肿瘤生物墨水还包括内皮细胞。
15.如权利要求9所述的方法，其中，所述间质生物墨水包含5千万个细胞/mL至3亿个细胞/mL。
16.如权利要求9所述的方法，其中，所述肿瘤生物墨水包含5千万个细胞/mL至3亿个细胞/mL。
17.如权利要求9所述的方法，其中，所述细胞培养基包括支持人成纤维细胞、人内皮细胞、脂肪细胞和癌细胞的生长、维持或分化的可溶性组分。
18.如权利要求9所述的方法，其中，所述肿瘤模型是人乳腺癌模型，所述间质生物墨水是包含人乳腺成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞和在生物打印时分化的人前脂肪细胞的人乳腺间质生物墨水，其中所述人前脂肪细胞在生物打印后分化成脂肪细胞，并且所述肿瘤生物墨水是人乳腺肿瘤生物墨水。
19.根据权利要求9所述所述的方法，其中所述间质生物墨水和所述肿瘤生物墨水各自包含可逆交联的挤出化合物，并且在沉积所述间质生物墨水和所述肿瘤生物墨水之后，所述方法还包括交联所述挤出化合物以在细胞凝聚之前物理稳定肿瘤模型结构；并且其中使沉积的生物墨水在细胞培养基中熟化也是为了除去挤出化合物，其中所述挤出化合物是含有藻酸盐的可交联水凝胶。
20.一种三维的、工程化的生物肿瘤模型的阵列，其中所述阵列中的每个肿瘤模型包括权利要求1的三维的、工程化的生物肿瘤模型，条件是所述阵列适于在高通量测定法中使用。
21.如权利要求20所述的阵列，其中，每个肿瘤模型在多孔板的孔中。
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