CN101796186B - 喷墨基因打印 - Google Patents

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Abstract

本文提供了通过对细胞施加应力例如使用切应力来用目的化合物转染细胞的方法和设备。目的化合物可以是核酸、蛋白质、分子、纳米颗粒、药物等或其任何组合。还提供了用喷墨打印装置打印细胞的方法，其中至少一部分活细胞(优选至少1％)被目的化合物转染。优选，至少25％的细胞在打印后是活的。此外，提供了形成活细胞的阵列的方法，其中至少一部分活打印细胞(优选至少1％)被至少一种目的化合物转染。

Description

喷墨基因打印
相关申请
本申请要求保护2007年6月7日提交的美国临时专利申请系列号60/942,549的权益，其公开内容以其全文引用的形式合并入本文。
发明领域
本发明涉及目的化合物至活细胞内的递送。
发明背景
在组织工程的跨学科领域中，通过利用活细胞作为工程材料，有效的新型疗法正被开发来治疗人健康的结构和功能障碍。参见可在nsf.gov上获得的Viola等人，2003年10月14日为国家自然科学基金会准备的″TheEmergence of Tissue Engineering as a Research Field，″。在一些组织工程领域内，研究者正在通过细胞的组合产生二维和三维组织和器官以修复或取代患病或受损组织。
在其中正常组织不能用可获得的细胞进行工程，或需要增强的细胞功能的情况下，备选方法例如生长因子补充给药法、大分子治疗或基因修饰可以是获得期望的功能性所必需的。此外，在组织工程中，为了促进功能性组织和器官的形成，基因、蛋白质、分子、纳米颗粒、药物等的转染或递送日益变得至关重要。
基因转染技术已在不同的研究领域用以改善细胞和组织功能。虽然在本领域内存在用于将基因递送入细胞的已建立的方法，但现有技术在组织工程中的应用不太理想。基因转染的重要目的是获得至靶细胞群体的有效率基因递送，同时保持细胞成活力。目前，用于基因转染的最广泛使用的方法是病毒转染、显微注射、电穿孔和基因枪。
使用病毒载体的转染是其中将待递送的核酸插入病毒的技术。在病毒载体通过停靠(docking)机制进入被靶向的细胞后，核酸被转运入细胞核。虽然病毒转染具有高效率，但其也具有许多缺点，例如残留的病原性以及在插入诱变后瘤生长(neoplastic growth)的潜在诱导。这些担忧已限制了其在药物和生物医学领域，特别地临床基因治疗中的应用。
显微注射是另一种可采用的技术。可使用显微注射针头将遗传物质直接注射入培养的细胞或细胞核。其在将特定遗传物质转移入细胞中是非常有效的，并且已广泛地用于干细胞核移植应用中。然而，其效率不高并且不适合需要转染大量细胞的研究和应用。
电穿孔，受控电场用于帮助细胞透化的应用，也用于增强基因至细胞内的吸收。进入的机制基于电脉冲对细胞膜进行的扰动，该扰动形成了允许DNA通过的小孔。该技术需要针对所使用的各类型细胞就脉冲的持续时间和强度进行最优化，以及需要允许有效递送和杀死细胞之间的临界平衡。低细胞成活力是通过电穿孔进行的转染的主要限制。
最后，基因枪可通过将用DNA包被的金颗粒射向细胞来实现将基因直接递送入组织或细胞。该技术允许直接穿透细胞膜进入细胞质和甚至细胞核，从而避开了细胞的内体区室。然而，该方法受限于低转染率。
因此，存在对用核酸、蛋白质、分子、纳米颗粒药物等有效且有效率地转染细胞同时保护它们的成活力的新方法的需要。也存在对将转染与细胞递送组合，以及进一步将此类技术组合入一个平台或装置从而在组织工程应用中进行有效且有效率的转染的需要。
发明概述
在本发明的一个方面中，提供了用目的化合物转染细胞的方法，包括：1)在液体载体中提供包含目的化合物和细胞的组合物；和2)迫使所述组合物通过喷嘴，以便在目的化合物存在的情况下对细胞施加应力。在一些实施方案中，至少1％的活细胞被转染(例如，通过计数，将活转染细胞的数目与活细胞(转染的和未转染的)的总数相比较)。在一些实施方案中，进行迫使步骤1至100微秒的时间。在一些实施方案中，细胞是真核细胞或原核细胞，目的化合物选自：核酸、蛋白质、分子、纳米颗粒和药物。在另外的实施方案中，通过用喷墨打印装置喷墨打印细胞来进行迫使步骤。
在本发明的另一个方面，提供了打印细胞的方法，其中至少一部分细胞被目的化合物转染，包括步骤：1)提供包括至少一个喷墨打印机墨盒的喷墨打印装置；2)将待打印的组合物装载入打印机墨盒，以便组合物在装载后在目的化合物存在的情况下包含细胞；和3)将所述装载的组合物打印至基质上。在一些实施方案中，例如用琼脂或胶原包被基质。在其他实施方案中，将组合物在体内打印至组织基质上。优选，至少1％的活打印细胞被转染(例如，通过计数，将活转染细胞的数目与活细胞(转染的和未转染的)的总数相比较)，和至少25％的打印细胞在打印后是活的(通过将打印前活细胞的总数与打印后活细胞的总数相比较)。可被打印的细胞包括真核细胞和原核细胞，目的化合物包括核酸、蛋白质、分子、纳米颗粒和药物。
本发明的其他方面是形成活细胞的阵列的方法，包括：1)提供包含至少一个喷墨打印机墨盒的装置；2)将组合物装载入打印机墨盒，以便组合物在至少一种目的化合物存在的情况下包含细胞；和3)将组合物以有组织的模式打印在基质上。在一些实施方案中，用例如琼脂或胶原包被基质。在其他实施方案中，组合物被在体内打印至组织基质上。优选至少1％的活打印细胞被转染(例如，通过计数，将活转染细胞的数目与活细胞(转染的和未转染的)的总数相比较)，并且至少25％的打印细胞在所述打印步骤后是活的(通过将打印前活细胞的总数与打印后活细胞的总数相比较)。可被打印的细胞包括真核细胞和原核细胞，目的化合物包括核酸、蛋白质、分子、纳米颗粒和药物。
还提供了用于打印细胞的设备，其包括具有至少一个喷墨打印机墨盒和待打印的被装载入打印机墨盒的组合物，所述组合物在至少一种目的化合物存在的情况下包含细胞。
本发明的另一个方面是如本文所述的方法用于制备组合物或药剂的用途，所述组合物或药剂用于治疗或用于进行如本文所述的治疗方法，或用于制造如本文所述的制品。
附图概述
图1.通过共打印进行的基因转染的潜在机制的示意图。当细胞和质粒载体在打印过程中通过打印头的墨水通道时，喷口喷射时产生的高切应力和热可引起细胞膜的短暂微小破坏(micro-disruption)，从能允许质粒转染入细胞。
图2.通过使用改进的商业喷墨打印机共打印进行的使用pmaxGFP质粒的细胞的体外喷墨转染。(a)-(c)转染细胞的形态。PAEC细胞在打印后第2天在胶原凝胶上展示正常的形态学(a)。在GFP荧光显微镜下，在这些打印细胞当中看到GFP表达(b)。利用DAPI和GFP荧光显微镜可看到打印细胞的细胞核(较浅的点)和转染细胞的基因表达(更亮的点)(c)。(d)-(e)喷墨转染法与基于脂质体的方法和电穿孔法的比较。与脂质体化学试剂(LipofectamineTM2000试剂)或电穿孔(Nucleofection)法相比较，喷黑转染法在转染后具有更高的细胞成活力(d)。喷墨法的总转染效率比Nucleofection法的低，但比LipofectamineTM试剂法的高(e)。(f)-(h)打印参数和条件对基因转染的影响。更高浓度的质粒展示更高的转染效率(f)。HP 51629a(″HP 29″)喷黑墨盒(更小的喷口直径)展示比HP 51626a(″HP 26″)墨盒(更大的喷口直径)更高的基因表达(g)。与含有lacZ和GFP-VEGF的更大的pIRES质粒相比较，更小的pmaxGFPTM质粒展示更高的转染效率。
图3.用pmaxGFPTM质粒打印的细胞组(HP695C打印机)在第1天的荧光显微镜和相差显微镜图像。在对照组中，手工操作细胞和质粒的混合物。
图4.用pmaxGFPTM质粒打印的两组细胞(HP550C打印机)在第2天的荧光显微镜和相差显微镜图像。在对照组中，手工操作细胞和质粒的混合物。
图5.用pmaxGFPTM质粒打印的两组细胞(HP550C打印机)在第4天的荧光显微镜和相差显微镜图像。在对照组中，手工操作细胞和质粒的混合物。
图6.用GPF和VEGF打印的两组细胞(HP550C打印机)在第2天的荧光显微镜和相差显微镜的图像。在对照组中，手工操作细胞和质粒的混合物。
图7.原位直接打印(direct printing)和体内喷墨基因转染。(a)在1周的植入后从裸小鼠的皮下组织取回植入片。在小鼠的皮下组织中看到原位装配的血纤蛋白层，并且在血纤蛋白层中发现血管系统。(b)取回的血纤蛋白层在培养皿中的总体检查。血纤蛋白凝胶展示矩形形状，其与预先设计的用于原位直接打印的模式相匹配。(c)-(d)血纤蛋白层内的细胞的荧光显微镜检查。不仅可以看到被DAPI染成蓝色的血纤蛋白层内的细胞的细胞核(更浅的点)，而且还在血纤蛋白层内捕获的细胞中发现GFP表达(更亮的点)(c)。转染的细胞还显现红色荧光(图(d)中更亮的点)，这表明转染的细胞是来自体内定喷墨打印的移植细胞(d)。
优选实施方案的详述
本发明涉及将目的化合物转染入活细胞的方法。所有引用的美国专利参考资料的公开内容通过以达到它们与本文的公开内容一致的程度引用的方式合并入本文。
如本发明的说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文清楚地指出，否则单数形式“a”、“an”或“the”旨在也包括复数形式。此外，如本文所使用的，术语“大约”和“大致”当指可测量的值例如化合物的量、剂量、时间、温度等，其表示包括指定量的20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。同样，如本文所使用的，“和/或”是指和包括一个或更多个关联列出的项的任何和任何可能的组合，以及当在二选一(“或”)的情况下解释时，不包括组合。
如本文所使用的，“转染”或“转化”是指目的化合物至细胞内的递送。例如，术语“转染”在本文中用于针对真核和原核细胞。“目的化合物”包括但不限于包含核酸(例如，基因、质粒、siRNA等)的化合物、蛋白质、小分子、纳米颗粒(即，至少一维小于200nm的微小颗粒)、药物或有待递送入活细胞的其他化合物。在一些实施方案中，目的化合物包含在组合物中，所述组合物还包含待转染的细胞。组合物中目的化合物的理想浓度可根据经验来确定。根据一些实施方案使用的组合物中目的化合物浓度包括但不限于0.01至50μg/μL、0.05至10、15或20μg/μL、0.1至5μg/μL、0.1至2.0μg/μL，和1至2μg/μL的组合物。细胞的理想浓度也可根据经验，通过考虑不同细胞类型的相对大小来确定。根据一些实施方案的组合物中细胞的浓度包括但不限于大约105、106、107、108或109个细胞/mL。
在一些实施方案中，在载体(即，用于递送的媒介物)中提供目的化合物。可使用任何适当的载体，包括但不限于，核酸载体、基于脂质体(例如，阳离子脂质)的载体，例如季铵去污剂、胆固醇和二酰基甘油的阳离子衍生物，和多胺的脂质衍生物；基于肽的载体，例如Cys-Trp-Lys等；聚合物介导的载体，例如聚乙烯亚胺(PEI)、生物可降解的聚合物(例如，聚[a-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸])、热敏聚合物(例如，聚(N-异丙烯酰胺(IPAAm)-共-2-(二甲氨基)乙基异丁烯酸酯(DMAEMA)-共聚-甲基丙烯酸丁酯(BMA))、PEG-聚(D，L乳酸-共聚-乙醇))；二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖；磷酸钙；活化的树枝状大分子(activatedDendrimer)；非脂质体的脂质；和功能性纳米颗粒，例如量子点纳米颗粒、金纳米颗粒、硅纳米颗粒、磁纳米颗粒、脂质纳米颗粒、聚阳离子纳米颗粒、聚合物纳米颗粒等。
常用核酸载体的实例包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒，已知其全都用于在细胞中表达异源核酸。参见例如美国专利6,392,118、6,309,883、6,258,354和4,959,313。载体应当包含与核酸有效连接以在细胞中表达一个或更多个编码区的适当的启动子(例如，SV40启动子、逆转录病毒LTR-启动子或细胞巨化病毒CMV)启动子)。可根据一些实施方案使用的质粒的实例包括但不限于pmaxGFPTM(Amaxa Biosystems，Gaithersburg，Maryland)、pIRES-VEGF-GFP(BD Biosciences，Bedford，MA)、pIRES-lacZ(BCCM/LMBP，Belgium)和pMACSKKII-PDX(Miltenyi Biotec，Germany)。在一些实施方案中，编码区包括报告基因例如绿色荧光蛋白(GFP)和/或功能性蛋白例如生长因子(例如血管内皮生长因子(VEGF))或分化因子。参见例如美国专利申请公开号2007/0031384，通过以引用的方式合并入本文。还可以以裸露的或以与阳离子脂质复合的形式提供核酸。参见，例如，美国专利号5,676,954、5,589,466、5,693,622、5,580,859、5,703,055和6,413,942。
取决于所选择的特定的系统，核酸的表达可以是稳定表达或瞬时表达。就术语核酸编码序列的“表达”或“表现(expression)”而言，其意指序列被转录和任选地翻译。通常，根据本发明，编码区的表达将导致产生编码多肽。
在一些实施方案中可以在液体载体中提供目的化合物。液体载体的实例包括但不限于水、水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐溶液(PBS))、转染溶例如NucleofectorTM溶液(Amaxa Biosystems，Gaithersburg，Maryland)等等，并且必要时可包含额外的成分。
可在目的化合物“存在的情况下”提供细胞。如本文所使用的，当在相同的组合物中包含细胞和目的组合物时，细胞在目的化合物“存在的情况下”存在，并且目的化合物在物理上存在于细胞外面，但能够在例如转染前通过扩散或其他方式与细胞相互作用。在目的化合物存在的情况下的细胞在使用本文公开的方法转染之前，可以在之前已用相同的或不同的目的化合物进行了转染或之前可以未进行所述转染。在一些实施方案中，可预先混合化合物和/或组合物以形成包含目的化合物和细胞的组合物。在其他实施方案中，可在即将转染前向含有细胞的组合物中加入目的化合物来形成包含目的化合物和细胞的组合物。
如本文所使用的，“细胞”可以是任何类型的真核或原核细胞而无任何限制。哺乳动物细胞(包括小鼠、大鼠、狗、猎、猴子和人细胞)在一些实施方案中例如对于组织工程应用是优选。在其中将通过本文中的方法产生的组织植入受试者的应用中，在一些实施方案中，细胞是与其中将植入所述组织的受试者相同的物种的细胞。在一些实施方案中，细胞包括为自体的(即，来自待治疗的受试者的)、等基因的(isogeneic)(即，遗传上相同但受试者不同，例如来自相同的双胞胎)、同种异体的(即，来自相同物种的遗传上不同的成员)或异种的(即，来自不同种的成员)的细胞。在一些实施方案中，真核细胞可获自供体(活的或尸体的)或来自已建立的细胞系。为了从供体(例如，生物支架移植物的潜在受者)获得细胞，可使用本领域内已知的标准活检技术(biopsy technique)。
可使用本文中的方法转染的真核细胞的实例包括但不限于哺乳动物细胞，包括干细胞、祖细胞和分化细胞而无限制。干细胞具有通过许多次群体倍增(例如，至少60-80次)(在一些情况下基本上是无限的)而复制的能力，并且还具有分化成多种细胞类型的能力(例如，为多能性的(pluripotent)或多能的)。用目的化合物转染细胞还可能导致细胞变成永生化的(即，能够倍增50次以上)。例如，已报导，使用端粒酶逆转录酶(hTERT)的哺乳动物细胞转染可使神经元祖细胞永生化(参见授予Goldman等人的美国专利7,150,989)。
一些细胞类型对严格的转染技术例如电穿孔或基于脂质体的转染非常敏感。例如，最近我们已发现人羊水干细胞(AFS)，在用电穿孔或基于脂质体的试剂转染后，通常会停止生长并且经历细胞凋亡。根据本发明的一些实施方案，如本文中教导的转染对更敏感的细胞例如AFS细胞的成活力、增殖和基本功能不具有显著的影响。
在一些实施方案中，在液体载体中提供细胞。液体载体可以以悬浮液、溶液或任何适当的形式存在。液体载体的实例包括但不限于水、水溶液(例如，磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等)、液体介质(例如，改良伊格尔氏培养基(″MEM″)、Hank′s平衡盐等)、凝胶等，并且必要时可包含额外的成分。在一些实施方案中，在细胞组合物中使用液体载体可确保足够的水合作用和使打印后蒸发减少至最少。然而，在一些实施方案中，在任何给定的打印滴中获得活细胞的概率随着细胞浓度不断减小也在减小。参见授予Boland等人的美国专利7,051,654。
在一些实施方案中，可通过例如使用张应力或切应力或压缩或惯性载荷或液体运动对细胞“施加应力”来进行转染。在一些实施方案中，应力可以是法向应力或切应力。在法向应力中，应力垂直于材料表面。切应力(″τ″)是指其中应力(例如摩擦力)基本上与材料的表面(例如，细胞膜)平行或相切的应力状态。在一些实施方案中，迫使细胞通过喷口，以便细胞经历切应力。在一些实施方案中，切应力是0.5至500ms-1、或1至100ms-1或5至15ms-1。在一些实施方案中，对细胞施加应力，进行有限的时间，例如10-5至10-7秒。在一些实施方案中，有限的时间是0.5至10微秒。
喷嘴的理想大小将取决于打算转染的细胞类型。作为一般指导，真核动物细胞和植物细胞直径通常为10至100μm，原核细胞直径通常为0.1至10μm。打印前，在一些实施方案中，可通过酶促作用使细胞例如从培养板或外植体组织分离。当酶促处理时，细胞通常收缩成更小的球。作为一般指导，在酶促处理后，动物细胞通常为数微米至30微米。例如，在胰蛋白酶处理后，猪主动脉内皮细胞系的细胞(PAEC细胞)为大约10-20μm。
在一些实施方案中，喷嘴直径为10至200，或直径为20至100μm，或30至70μm。在其他实施方案中，喷嘴直径为大约40或50μm。可提供复数个具有相同或不同直径的喷嘴。虽然在一些实施方案中，喷嘴具有圆形开口，但可使用其他适当的形状，例如椭圆形、正方形、矩形，而不背离本发明的精神。
以另一种方式来说，在一些实施方案中喷嘴大小不超过待转染的细胞的平均直径1、1.5、2、3、5、8、10或12倍。在其他实施方案中，喷嘴与待转染的细胞的平均直径大小相同或比之更小，例如待转染的细胞的平均直径大小的1/8、1/4、1/2、3/4或7/8。一些实施方案包括范围在待转染的细胞的平均直径的1/8和12倍之间，或1/4和10倍之间，或1/2和8倍之间的大小。
在另外的实施方案中，可将细胞暴露于高热，例如高于50、80或100摄氏度。在其他实施方案中，将细胞暴露于高于120、150、180或200摄氏度的热。在另一个实施方案中，将细胞暴露于高于220、250、280或300摄氏度的热。例如，如下所论述的，将细胞和/或其中包含细胞的组合物与打印头的加热的板接触，为了喷射细胞/组合物的小滴，加热该板。在一些实施方案中，将细胞暴露于热，进行有限的时间例如10-5至10-7秒。在一些实施方案中，有限的时间是0.5至10微秒。
根据一些实施方案，在目的化合物存在的情况下，当对细胞施加应力和/或加热时至少一部分细胞被转染。可通过计算活细胞或贴壁细胞的转染百分比或比率(例如，分别根据GFP-阳性或lacZ-阳性细胞与DAPI-阳性细胞之间的关系计算的)来测定转染的活细胞的部分。如本文中所使用的，“活的”包括附着至培养皿或其他基质和/或能够存活(例如，增殖的)的细胞。在一些实施方案中，至少0.5、1或2％的活细胞被转染。在其他实施方案中，至少3、4或5％的活细胞被转染。在其他实施方案中，至少6、7、8、10或12％的活细胞被转染。在其他实施方案中，至少15、20或30％或更多的活细胞被转染。
此外，可通过将活活细胞或贴壁细胞的转染率乘以各培养样品的存活率(即，装载的总细胞中在转染步骤后是活的百分比)来测定总转染率。在一些实施方案中，至少15、20或25％的装载的总细胞在转染至少一部分细胞后是活的。在其他实施方案中，至少30、40或50％的所提供的总细胞是活的，在其他实施方案中，至少60、70、80或90％或更多的所提供的总细胞在转染至少一部分细胞后是活的。细胞存活率可通过任何常规方法例如MTS测定法来测量。根据一些实施方案的总转染率是至少1、2、4或8％，或至少10、15、20或30％或更多。
在一些实施方案中，用目的化合物转染的细胞可被递送入基质，包括3D支架，和可促进工程组织和器官的形成和功能化。其他应用的实例包括但不限于用至少一个目的化合物转染的细胞的2-维或3-维阵列。
通过喷墨打印进行的转染
在一些实施方案中，通过与目的化合物共打印来转染细胞。用于活细胞的喷墨打印的方法和组合物是已知的并且描述于例如授予Boland等人的美国专利7,051,654；Wilson等人(2003)The Anatomical RecordPart A 272A：491-496中。细胞还可通过其他方法打印，例如通过沉积活细胞来形成三维结构的方法和组合物，如授予Warren等人的美国专利6,986,739中所描述的。
不期望受任何特定理论的束缚，假设借以通过喷墨打印转染细胞的可能机制包括可在喷墨打印过程中发生的高切应力(在一些实施方案中达到10ms-1)，和/或高热(在一些实施方案中达到300摄氏度)，这导致细胞的细胞膜的物理-机械变化，该变化促进目的化合物至细胞内的转移(图1)。
可通过喷墨打印转染的细胞的实例包括真核细胞和原核细胞而无限制，如上所述。可使用本文中的方法转染的真核细胞的实例包括但不限于哺乳动物细胞，包括干细胞、祖细胞和分化细胞。在一些实施方案中，通过喷墨打印进行的转染是比较温和的转染条件。例如，在一些实施方案中打印后相对高的百分比的细胞是活的(例如，70、80或90％或更多)。这对于更敏感的细胞例如干细胞和祖细胞的转染是特别重要的。祖细胞被称为具有高增殖能力、自我更新能力和多谱系分化(multilineagedifferentiation)潜能的未分化细胞。关于祖细胞在基因转染中的主要考虑问题是此类细胞在被转染后是否可以仍然保持它们的干细胞或未分化状态。温和的喷墨打印转染可保持祖细胞的该重要状态。
再例如，最近我们已发现人羊水干细胞(AFS)，在通过电穿孔或基于脂质体的试剂转染后，会停止生长或甚至其大部经历细胞凋亡。相反地，根据本发明的一些实施方案的喷墨打印对AFS干细胞的成活力、增殖和基本功能不具有显著影响。
在一些实施方案中，如上所述，可在液体载体中提供细胞和/或目的化合物。根据一些实施方案使用的目的化合物的浓度包括但不限于0.01至50μg/μL、0.05至10、15或20μg/μL、0.1或5μg/μL、0.1至2.0μg/μL和1至2μg/μL的组合物。根据一些实施方案的组合物中细胞的浓度包括但不限于大约105、106、107、08或109个细胞/mL。
可通过例如使用张应力或切应力，包括在喷墨打印过程中发生的压缩或惯性载荷或液体运动对细胞施加应力来进行转染。在一些实施方案中，切应力为0.5至500ms-1、或1至100ms-1或5至15ms-1。参见Okamoto等人(2000)Nature Biotechnology 18：438-441。
在一些实施方案中，可将细胞暴露于高热，例如高于50、80或100摄氏度。在其他实施方案中，将细胞暴露于高于120、150、180或200摄氏度的热。仍在其他实施方案中，将细胞暴露于高于220、250、280或300摄氏度的热。在某些涉及喷墨打印的实施方案中，通过打印机墨盒的加热的板来产生热。在一些实施方案中，将细胞暴露于热，进行有限的时间例如10-5至10-7秒。在其他实施方案中，有限的时间是0.5至10微秒。参见Calvert(2001)Chem.Mater.13：3299-3305。
在一些实施方案中，可用改进的喷墨打印机通过喷墨打印来转染目的化合物。改进可以包括但不限于指，控制温度、湿度、切应力、打印速度和喷射频率的方式，通过例如改进打印机驱动程序和/或打印机的物理构造来实现。参见，例如，Pardo等人(2003)Langmuir 19：1462-1466；授予Boland等人的美国专利7,051,654。并非每一个这些参考资料中提及的改进都将适合于给定的应用，这对本领域技术人员来说应该是可理解的。例如，在一些实施方案中，不使用具有更紧的公差(tolerance)(通过加入横向支持物(horizontal support)，将电路中的晶体管改变换成具有更高放大倍数的晶体管，然后再加入水平位置编码器(horizontalposition encoder)产生)的齿轮固定柱(gear mount pillar)来改进打印机。同样，在一些实施方案中，不通过改进打印机程序以降低电阻式电压来避免使溶液加热超过37℃。
在一些实施方案中，可如下改进打印机(例如，商业打印机HP695C和HP550C)。可去掉打印机顶盖(top cover)，停用(disable)用于顶盖的感应器。可停用纸机械装置以允许将细胞打印至固体基质(例如，玻璃盖玻片)上。可去掉墨水吸收垫(ink absorbing pad)(在HP695C和HP550C打印机的右侧上)(例如，以避免垫子在打印过程中污染打印墨盒的底部)。为了给打印机提供打印3D结构的能力，可为改进的打印机加入具有受控升降室(elevator chamber)的定制的Z轴组件。
在打印头中喷口喷射过程中，可将目的化合物转染入活细胞。“打印头”是喷墨打印机中喷射微滴(例如，墨水)的装置。在一些实施方案中，将目的化合物与打算转染的细胞一起装载入墨水墨盒中。在其他实施方案中，在装载之前将细胞与目的化合物预先混合。在其他实施方案中，相继装载细胞和目的化合物，以便装载的组合物包含细胞和目的化合物。
在一些实施方案中，喷墨打印装置是感热式喷墨打印机。一般地，在感热式喷墨打印机中，电阻器在打印头中产生热，蒸发墨水以产生热泡。随着热泡膨胀，其中一些墨水被挤出喷口至纸上。当泡崩塌时产生真空，这将推动更多的墨水从墨盒进入打印头。在本发明中，用例如细胞和/或目的化合物(例如，液体载体中的)替换墨水，用适当的基质例如琼脂或胶原包被的基质替代纸。参见，例如，授予Niklasen等人的美国专利6,537,567。
在一些实施方案中，通过用喷墨打印头(例如，51626a或51629a，Hewlett Packard，Palo Alto，California)打印至基质上(例如，组织或支架)来转染目的化合物转染。在一些实施方案中，打印头具有拥有许多行和/或喷头的面板。在某些实施方案中，面板具有两行25喷嘴或喷口。
在一些实施方案中，喷口直径为0.05至200μm，或直径为0.5至100μm，或10至70μm，或直径为20至60μm。在其他实施方案中，喷口直径为大约40或50μm。可提供复数个具有相同或不同直径的喷口。虽然在一些实施方案中喷口具有圆形开口，但通过考虑打算转染的细胞的相对大小，也可使用其他适当的形状，例如，椭圆形、正方形、矩形等而不背离本发明的精神。作为一般指导，真核动物细胞和植物细胞直径通常为10至100μm，原核细胞直径通常为0.1至10μm。在打印前，在一些实施方案中，可通过酶促作用从例如培养板或外植体组织分离细胞。在酶促处理后，细胞通常收缩成更小的球形。作为一般指导，在酶促处理后，动物细胞通常为数微型米至30微米。例如，在胰蛋白酶处理后，猪主动脉内皮细胞系的细胞(PAEC细胞)为大约10-20μm。
换种方式说，在一些实施方案中喷嘴大小不超过待转染的细胞的平均直径1.5、2、3、5、7、10、15或20倍。例如，HP 51629a和HP 51626a墨盒的喷口分别为大约40和50微米(参见Xu等人(2006)Biomaterials27(19)：3580-88)。因此，在一些实施方案中，相对喷口大小是待转染的细胞的直径的1.3至10倍。在另外的实施方案中，相对喷口大小是待转染的细胞直径的0.8至20倍。
在其他实施方案中，喷嘴与待转染的细胞的平均直径大小相同或比之更小，例如为待转染的细胞的平均直径大小的1/8、1/4、1/2、3/4或7/8。一些实施方案包括范围在待转染的细胞的平均直径的1/8和12倍之间，或1/4和10倍之间，或1/2和8倍之间的大小。
在一些实施方案中，各喷嘴与打印头中的分离槽(separate chamber)连接。根据一些实施方案，在打印过程中，单个细胞和装载的目的化合物可以只通过众多喷口和槽中的一个，从而可在任何一个喷口内进行转染。在一些实施方案中，打印头能够每秒打印250,000个以上的小滴，从而提供了高通量基因转染的方法。
在其他实施方案中，通过用压电晶体振动打印头(piezoelectriccrystal vibration print head)打印来转染目的化合物。通常，压电晶体接收使其振动，从而将墨水压挤出喷口，并且将更多的墨水吸入贮液器(reservoir)的电荷。在本发明中，用例如存在于液体中的细胞和/或目的化合物替代墨水。与感热式喷墨打印相比较，基于压力的喷墨打印通常需要更大功率和更高的振动频率。典型商业压电式打印机(piezo-printer)使用高至30kHz的频率和范围在12至100W内的电源。通常使用范围在15至25kHz内的振动频率和10至375W的电源来破坏细胞膜。(See Xu等人(2005)Biomaterials 26：93-99)。因此，在一些实施方案中，使用压电晶体振动打印头，其振动频率为1、5、10或15，至20、25、30或35或更高的kHz，电源为5、10、20、50、100、120或150至200、250、300、350或375或更多瓦特。
根据一些实施方案，至少一部分活细胞在与目的化合物共打印时被转染。可通过计算活细胞或贴壁细胞的转染百分比或转染率(例如，分别根据GFP-阳性或lacZ-阳性细胞与DAPI-阳性细之间关系计算的)来测定转染的活细胞的的部分。“活细胞”包括粘附至培养皿或其他基质和/或能够存活(例如，增殖)的细胞。在一些实施方案中，至少0.5、1或2％的活细胞被转染。在其他实施方案中，至少3、4或5％的活细胞被转染。在其他实施方案中，至少6、7、8、10或12％的活细胞被转染。在另外的实施方案中，至少15、20或30％或更多的活细胞被转染。此外，总转染率可通过将活细胞或贴壁细胞的转染率乘以各培养样品的存活率(如上)来测定。在一些实施方案中，至少15、20或25％的装载的总细胞在转染至少一部分细胞后是活的。在其他实施方案中，至少30、40或50％的装载的总细胞是活的，在其他实施方案中，至少60、70、80或90％或更多的装载的总细胞在转染至少一部分细胞后是活的。细胞存活率可通过任何常规方法例如MTS测定法来测量。根据一些实施方案的总转染率是至少1、2、4或8％，或至少10、15、20或30％或更多。
可在打印过程中和/或之后将不同机制用于促进细胞的存活。特别地，可利用通过提供水合作用、营养物和/或结构支持来支持打印细胞的化合物。可使用常规技术例如通过手工在清洗或水浴中将此类化合物用于基质，通过蒸汽淀积(例如，物理或化学蒸汽淀积)等将此类化合物用于基质。此类化合物还可在打印之前和/或期间与细胞组合物组合，或被打印或否则应用至底物(例如，包被的)作为在细胞层下面、上面和/或之间的隔离层。例如，一种这样的支持性化合物是粘性低至足以在打印条件下通过打印头的喷口并且可在打印期间和/或打印后胶凝成稳定的形状的凝胶。这样的粘性通常在大约0.5至大约50厘泊的范围内，在一些实施方案中，大约1至大约20厘泊的范围内，以及在一些实施方案中，大约1至大约10厘泊。些可用于本发明的适当的凝胶的一实例包括但不限于琼脂、胶原、水凝胶等。
除了凝胶以外，还可在本发明中使用其他支持性化合物。例如可将细胞外基质与支持性凝胶组合来最优化或功能化凝胶。在一些实施方案中，还可将一种或更多种生长因子导入打印阵列。例如，可将以不同浓度和顺序包含一种或更多种生长因子的缓释微球与细胞组合物和/或目的化合物组合物组合以加速和指导细胞融合过程。其他适当的支持性化合物可包括有助于避免细胞凋亡和发育中结构的坏死的支持性化合物。例如，可加入存活因子(例如，基本的成纤维细胞生长因子)。此外，可在打印组合物中包含具有凋亡抑制(antiapoptotic)(例如，bcl-2和端粒酶)和/或阻断途径的细胞的瞬时遗传修饰。还可利用胶粘剂来在打印后帮助细胞的存活。例如，软组织粘合剂例如氰基丙烯酸酯、血纤蛋白粘合剂和/或组织粘合剂-雷锁辛-甲醛胶冻可用于约束新生结构以避免在层的打印后被洗去或移动。此外，粘合剂例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)配体可增强细胞至胶凝聚合物或其他支持化性合物的粘着。此外，还可利用细胞外蛋白、细胞外蛋白类似物等。
如本文所使用的，“生长因子”可以是适合于将被打印的特定组织或阵列的任何天然发生的或合成的生长因子，包括其组合。许多生长因子对于本领域技术人员来说是已知的。实例包括但不限于胰岛素样生长因子(例如，IGF-1)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(FGF)(成员1、2和3)、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2)、生长激素例如促生长素、细胞引诱剂(cellular attractant)和附着剂(attachment agent)等和其混合物。参见例如美国专利7,019,192；6,995,013；和6,923,833例如，可在打印组合物中提供生长因子蛋白和/或由被转染入打印细胞的质粒编码其。
在一些实施方案中，取决于将要形成的特定组织(或组织替代物)，可从分开的喷口或通过相同喷口(当共同存在于组合物中时)打印目的化合物、细胞、支持性化合物和/或生长因子。打印可以是同时地、顺次地或其任何组合。一些成分可以以第一模式(例如，可腐蚀的或可降解的材料)的形式打印，一些成分可以以第二模式(例如，在与支持物不同的模式中的细胞，或在不同模式中的两种不同的细胞类型)的形式打印。打印的特定组合和方式将取决于将被打印的特定组织。
可将根据本发明转染的细胞用于例如组织工程应用。在一些实施方案中，将细胞和目的化合物打印入基质，例如生物相容性支架，所述基质随后可被植入有此需要的受试者。在其他实施方案中，可在之前已应用或未应用细胞可附着在其中的基质(例如，血纤蛋白层)的情况下，将细胞和目的化合物体内直接在体内打印至活组织上。
在下列非限定性实施例中更详细地解释本发明。
实施例
此处，我们报告了通过使用喷墨打印法进行的活哺乳动物细胞的基因转染的新型通用方法。我们假设当将目的基因与活细胞通过喷射式喷墨喷口被共打印时，目的基因可有效地递送入活细胞，并且被导入的基因可在体外和体内表达。此外，可在转染过程中，利用喷墨打印将细胞递送至预先指定的靶位点。
可能的转染机制示于图1中。不希望受任何特定理论的束缚，据认为，当细胞和质粒在打印过程中通过打印头的墨水通道时，当喷口喷射时发生的高切应力和/或热可引起细胞膜的短暂微小破坏，从而允许质粒转移入细胞。
实施例1.通过共打印进行的体外转染。使用猪主动脉内皮细胞系(PAEC)，该细胞系是之前在我们实验室通过酶促分散成体猪的主动脉而建立的，细胞系的第15、16和17代用于基因转染。将PAEC细胞在37℃下于潮湿的5％CO2(95％空气)气氛中维持在补充有10％胎牛血清(GIBCO)以及100IU青霉素和100mg/ml链霉素的F12培养(GIBCO，Invitrogen，Carlsbad，CA)中。
使用编码cDNA的细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子驱动的质粒。将pmaxGFPTM(Amaxa GmbH，Germany，和Gaithersburg，Maryland)、pIRES-VEGF-GFP(BD Biosciences，Bedford，MA)和pIRES-lacZ(BCCM/LMBP，Belgium)质粒各自在大肠杆菌的DH5α菌株中进行扩增，然后通过碱性裂解分离，利用离子交换柱层析(Qiagen Inc.，Valencia，CA)进行纯化。pmaxGFPTM质粒编码来自桡脚类动物羽小角水蚤(Potellinap.)的绿色荧光蛋白(GFP)。
为了进行基因转染，我们改进商业HP Desktop打印机(695C和550C)和墨盒(HP 51629a或51626a)。简而言之，去掉打印机顶盖，停用用于机盖的感应器。可停用进纸机械装置以允许将细胞打印至固体基质例如，玻璃盖玻片上。去掉打印机右侧上的墨水吸收垫以避免垫子在打印过程中污染打印盒的底部。为了给打印机提供打印3D结构的能力，可给改进的打印机中加入具有受控升降室的定制的Z轴组件。打印机使用允许打印不同粘性的溶液的打印驱动程序。打印机驱动程序持续地调整至喷口的电压以补偿不同的溶液阻抗(impedance)，从而使得能够分配适当量的溶液。也参见Pardo等人(2003)Langmuir 19：1462-1466)；授予Boland等人的美国专利7,051,654(注意，并非所有Pardo等人和Boland等人的参考资料中找到的改进都可使用，例如，不通过使用具有更紧的公差(通过加入水平位置编码器导致的)的新型齿轮固定柱来改进打印机，以及不通过降低电阻式电压来避免使溶液加热超过37℃。)。
在导入细胞打印悬浮液之前，用乙醇和无菌水充分漂洗墨盒。通过使用icrosoft PowerPoint为打印机编程来设计正方形的模式。通过使用之前报导的方案(Shea等人(1999)Nat Biotechnol 17，551-554)从大鼠尾巴I型胶原凝胶制备基质。在用胰蛋白酶处理后，收集PAEC细胞沉淀，然后以1.5-2×106个细胞/ml的浓度重悬浮于NucleofectorTM溶液(Amaxa)中。将质粒以0.1μg/μl至2μg/μl范围内的浓度加入细胞悬浮液中。
将含有PAEC细胞和质粒的打印悬浮液装载入墨盒。当喷口喷射时，细胞和质粒混合物被打印至胶原凝胶包被的基质上。在37℃下于潮湿的5％CO2(95％空气)气氛中温育30分钟后，小心地将培养基加至皿中以避免扰动打印的细胞模式。作为对照，将PAEC细胞和质粒混合在一起，然后手工接种在胶原凝胶包被的基质上。它们保持与打印组相同的细胞密度和质粒基因浓度。每天通过光学和荧光显微镜监控细胞的基因转染和生长。
我们发现在5-7小时后，打印细胞开始表达GFP。可在培养物中清晰地观察到绿色荧光，在10天的时期中持续看到强GFP表达(图2a-c)。然而，在非打印对照组中未看到GFP基因表达，或如果有的话，也是其极少的表达。
实施例2.与普通转染方法的比较。我们还将喷墨打印法的细胞存活率和转染率与组织工程中常用的其他化学和物理转染法相比较。为此目的，进行基于常用脂质体的试剂和电穿孔法。将LipofectamineTM2000(Invitrogen)(一种基于常用脂质体的试剂)和Nucleofection(一种电穿孔法)与使用PAEC细胞培养物的打印法进行比较。
对于使用LipofectamineTM试剂的转染，在转染前一天，将PAEC细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在24孔板上。按照厂商的方案进行转染。简而言之，将0.8μg pmaxGFPTM(Amaxa)和等量的LipofectamineTM 2000试剂各自加至50μl的无血清F12培养基中。在于室温(RT)下温育5分钟后，将它们混合，然后再于室温(RT)下温育20分钟。向24孔板中加入该DNA/脂质体复合物，并且维持达到48小时。
在Nucleofection实验中，使用用于原代哺乳动物内皮细胞的BasicNucleofectorTM试剂盒(Amaxa)。为了帮助用户更有效地使用BasicNucleofectorTM试剂盒产品，提供商(Amaxa)已试验了细胞并且建立了含有帮助使用转染试剂盒的程序的数据库。W-023和Y-022的程序包括在数据库中，其为特别地针对原代哺乳动物内皮细胞设计的。在这些实验中用于喷墨打印的细胞也是哺乳动物内皮细胞。这两个程序都设计用于转染来自猪主动脉的原代内皮细胞。
程序W-023在PACE细胞的存活率和转染率方面显示更好的结果，从而用于进一步实验。按照厂商的方案对内皮细胞进行转染。在胰蛋白酶处理后，将分离的细胞在培养基中调整至5×105的体积。之后，离心细胞，除去培养基。将细胞重悬浮于含有3μg质粒DNA的100μl的NucleofectorTM溶液。在电脉冲后，立即加入500μl含有10％FBS的F12培养基(Gibco)以中和NucleofectorTM溶液。将细胞接种在装有预温热的培养基的6cm培养皿上，在进一步分析前于潮湿的37℃/5％CO2培养箱(95％空气)中温育24小时。
对于各基因转染方法，在转染后，通过按照厂商的方案，使用四唑盐化合物(MTS)测定法(Sigma-Aldrich)评估细胞存活率。简而言之，按每ml培养基向转染的样品和非转染样品加入500ml试剂。在单个转染实验中，使用上述转染方法制备转染样品，为了估计总细胞数目，也使用除了它们不经历转染过程外，与转染样品相同的条件来制备非转染样品。在样品于室温下黑暗处温育2小时后，使用分光光度计测量540nm处的吸光率。根据转染样品的吸光率与非转染样品的吸光率之间的关系来估计在3种不同的转染方法中裂解的百分比。
在24-48小时的培养后，用PBS充分清洗转染亲品以除去裂解的或非贴壁细胞，然后用4％多聚甲醛溶液进行固定。使用DAPI染色(10mg/ml)估计培养中物中活细胞的总数目。对于使用GFP(包括pmaxGFPTM和VEGF-GFP质粒)的转染，计数GFP-阳性绿色荧光细胞以测量转染率。对于使用lacZ的转染，使用X-gal染色(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)估量细胞β-半乳糖苷酶活性，表达lacZ基因的细胞被染成蓝色。计数lacZ-阳性蓝色染色的细胞以估计转染率。使用倒置Zeiss荧光显微镜(CarlZeiss，Inc.，Thornwood，New York)以10X放大倍数来计数细胞。在每一个孔中随机选择4个视野，对于每一个样品计数至少4至6个孔。根据GFP-阳性或lacZ-阳性细胞与DAPI-阳性细胞之间的关系计算活细胞的转染率。总转染率通过将活细胞的转染率乘以各培养样品的存活率来估计。
与两个常用的化学和物理方法相比较，喷墨法在打印和转染活细胞后展示显著更高的细胞存活率(图2d)。在打印和转染过程中多至90％以上的细胞未被裂解。这与之前报导的存活率结果一致(参见Xu等人(2005)Biomaterials 26，93-99；Nakamura等人(2005)Tissue Eng 11，1658-1666)并且也再次验证了喷墨打印法是引起打印细胞最少损害的温和处理(Xu等人(2006)Biomaterials 27，3580-3588)。
在1天的培养后，用HP695C打印机打印的活细胞+pmaxGFPTM在荧光显微镜下显现绿色，表明在打印过程中，GFP基因有效地在打印细胞中表达(图3)。用HP550C打印机打印的细胞+pmaxGFPTM质粒(Amaxa Biosystems，Gaithersburg，Maryland)在第2天(图4)和第4天(图5)也显示GFP表达。用HP550C打印机打印的细胞+编码GFP和VEGF的质粒在第2天(图6)显示GFP表达。
在转染过程中，一些细胞被裂解(死亡)，这些死亡的细胞大部分不粘附至培养皿并且可从培养皿中清洗掉。为了估计转染率，用PBS充分清洗转染样品以除去裂解的细胞。在给定的培养皿中，将清洗步骤后总细胞的数目计数为NC(该数目应当接近，但不等于活细胞的数目，因为死亡细胞不能被100％清洗掉，并且少量活细胞可被清洗掉)。转染细胞的数目(例如，对于GFP是阳性的)计数为NT。活细胞的转染率意指转染细胞对培养皿中的活细胞的百分比。活细胞的转染率＝NT/NC。总转染率意指转染细胞对一开始被打印在基质(培养皿)上的总细胞的百分比。总转染率＝活细胞的转染率X存活率(％)。
我们发现，多至12％的打印细胞已被质粒基因转染。喷墨基因转染数据表明喷墨打印法，包括热激法(heat shock)和剪切冲击法(shearshock)，促进了质粒进入打印细胞。然而，与喷墨转染法相关的确切机制需要进一步研究。如图2e中所示，喷墨转染法对使用pmaxGFPTM的转染的总效率显著少于基于电穿孔的方法，但高于基于脂质体的方法。
实施例3.墨盒、质粒的浓度和大小的比较。还就喷墨基因转染检测不同的HP墨盒。HP 51629a墨盒显示比HP 51626a墨盒更高的基因转染率，如图2g中所示。HP 51629a和HP 51626a墨盒共有许多相似的参数和机制，但在喷口大小上具有差异。据信，HP 51629a墨盒具有与比HP 51626a墨盒相对更小的喷口直径，这可引起更高的应力，从而导致更高的转染率。在胰蛋白酶处理后，PAEC细胞为大约10-20μm。HP51629a和HP 51626a墨盒的喷口分别为大约40和50微米(参见Xu等人，Biomaterials(2006)27(19)：3580-88)。
还发现，几种其他因此可影响转染。可试验打印悬浮液中不同的质粒浓度。如较图2f中所示，pmaxGFPTM在其更高浓度(1.0μg/μl和2.0μg/μl)上的基因表达水平显著高于在其在更低浓度(0.1μg/μl和0.5μg/μl)上的基因表达水平。这可能由于当墨水通道中存在更高基因质粒比率时，在喷口喷射过程中质粒接近细胞膜并且进入细胞的概率更高而导致。
此外，还可试验不同大小的质粒。已看到，具有相对小的大小(3.2kb)的pmaxGFPTM质粒具有比其他两种相对较大的质粒(pIRES-VEGF-GFP和pIRES-lacZ)更高的转染率(图1h)。可能的原因是在本研究中具有相对较低功率的喷墨打印机只能在细胞膜中打开更小的微孔，从而更大的基因质粒难以进入细胞。为了用更大的质粒基因转染，可能需要进一步优化特定的打印参数和条件，例如温度、喷射频率和墨盒通道的结构设计。
实施例4.体内喷墨基因转染。为了评估喷墨基因转染是否可在体内进行，将血纤蛋白凝胶直接打印入裸小鼠皮下组织，然后直接将PAEC细胞和pmaxGFPTM质粒一起直接打印在预先形成的血纤蛋白凝胶上。为了区分移植细胞和宿主动物中的天然细胞，用PKH67红色荧光染料(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)标记PAEC细胞。按照ACUC方案在WakeForest University Health Sciences进行所有动物实验。
用胰蛋白酶处理PAEC细胞，然后用无血清DMEM进行清洗。将细胞以1×107个细胞/ml的浓度悬浮于2×10-6mM PKH67稀释剂C溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中，在室温下温育4小时。通过加入等体积的补充有10％FBS的DMEM淬灭染色反应，然后进行清洗。在培养基下培养过夜后，PKH67标记的PAEC细胞可直接用于下述的体内直接打印。
通过PAEC细胞与质粒DNA至无胸腺小鼠的皮下组织内的直接打印来估量由喷墨打印诱导的体内基因转染的能力。在打印前，用如上所述的PKH67荧光染料标记细胞以确定移植(打印的)细胞在宿主内的定位。将血纤蛋白原(20mg/ml，溶解于PBS中)(Sigma)和凝血酶(20IU/ml于40mM CaCl2中)(Sigma)交替地打印入小鼠皮下组织以产生血纤蛋白凝胶支架，然后将PAEC和pmaxGFPTM质粒共打印在血纤凝胶上。重复该步骤两次，从而产生具有某种结构的包含转染细胞的3D血纤蛋白层。在植入1周后，取回体内打印的血纤蛋白层，并且立即在荧光显微镜下进行检查。
在体内直接打印后，直接在小鼠皮下组织原位形成了具有某种结构的3D血纤蛋白凝胶，如图7a-b中所显示的。在绿色荧光显微镜(激发488nm；发射515 545nm)(图7c)下清楚地在血纤蛋白凝胶中看到表达GFP基因的打印细胞。此外，还在红色荧光显微镜(激发560nm；发射583nm)(图7d)下看见所述细胞呈现红色，从而确认GFP转染细胞不是来自天然组织而是来自通过喷墨打印机递送的移植细胞。
本研究显示了令人兴奋的使喷墨技术适合进行用于组织工程应用的转染的改造。除了具有精确递送细胞群体至它们的靶位点的能力以外，喷墨打印还可有助于对于活细胞的特定功能和作用。目的基因可被递送入细胞，并且细胞可在体外和体内表达所述基因。此外，通过使用喷墨法和如本研究中所示的体内直接打印进行的原位装配可提供在体内装配特定细胞池(cell reservoir)(其中转染细胞以正确的空间区划定位，并且产生组织形成和再生所需的持续和受控的生长因子)的可能性。
上述内容是本发明的举例说明，并且将不能理解为对其的限定。本发明由下列权利要求来定义，权利要求的等同物将包含在本文中。

Claims (24)

1.用核酸转染细胞的方法，其中至少一部分所述细胞被所述核酸转染，所述方法包括步骤：
在液体载体中在所述核酸存在的情况下提供包含所述细胞的组合物；和
迫使所述组合物通过喷嘴，以便在所述核酸存在的情况下使所述细胞经历0.5至500ms-1的切应力，其中所述喷嘴的直径在所述细胞平均直径的1/8和12倍之间，并且其中对所述细胞施压0.1至10微秒；
其中通过用喷墨打印装置喷墨打印所述细胞来进行所述迫使步骤，
从而用所述核酸转染至少一部分所述细胞。
2.权利要求1的方法，其中在所述迫使步骤后存活的、至少1％的细胞被所述核酸转染。
3.权利要求1的方法，其中在所述迫使步骤后存活的、至少5％的细胞被所述核酸转染。
4.权利要求1的方法，其中在所述迫使步骤后存活的、至少10％的细胞被所述核酸转染。
5.权利要求1至4的任一项的方法，其中在所述提供步骤中至少25％的细胞在所述迫使步骤后是活的。
6.权利要求1至4的任一项的方法，其中在所述提供步骤中至少50％的细胞在所述迫使步骤后是活的。
7.权利要求1至4的任一项的方法，其中在所述提供步骤中至少90％的细胞在所述迫使步骤后是活的。
8.权利要求1至4的任一项的方法，其中进行所述迫使步骤1至100微秒的时间。
9.权利要求1至4的任一项的方法，其中所述提供步骤的所述细胞是真核细胞。
10.权利要求1至4的任一项的方法，其中所述提供步骤的所述细胞是原核细胞。
11.权利要求1至4的任一项的方法，其中进行所述迫使步骤，以便所述细胞经历1至100ms-1的切应力。
12.权利要求1至4的任一项的方法，其中预先混合所述提供步骤的所述组合物。
13.权利要求1的方法，其中所述喷墨打印装置选自感热式喷墨打印机和压电式喷墨打印机。
14.权利要求1的方法，其中所述喷墨打印装置包括至少一个喷墨打印机墨盒，以及其中所述喷墨打印机墨盒选自感热式喷墨打印机墨盒和压电式喷墨打印机墨盒。
15.权利要求1的方法，其中在所述迫使步骤中使所述细胞暴露于高于50摄氏度的热。
16.权利要求1的方法，其中在所述迫使步骤中使所述细胞暴露于高于120摄氏度的热。
17.权利要求1的方法，其中在所述迫使步骤中使所述细胞暴露于高于220摄氏度的热。
18.权利要求1的方法，其中进行所述迫使步骤，使得所述细胞经历1至100ms-1的切应力，对所述细胞施压0.5至10微秒，并且使所述细胞暴露于高于220摄氏度的热。
19.权利要求1的方法，其中所述喷嘴的直径是30-70微米。
20.权利要求1的方法，其中通过将所述组合物打印至体内组织基质上来进行所述打印。
21.权利要求1的方法，其中所述打印是通过将所述组合物打印在以有组织的模式存在的基质上而进行的。
22.权利要求20的方法，其中所述打印是通过将所述组合物打印在以有组织的模式存在的所述基质上而进行的。
23.权利要求21的方法，其中所述基质是用胶原包被的。
24.权利要求22的方法，其中所述基质是用胶原包被的。
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