JP2010530221A - インクジェット遺伝子印刷法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2007年6月7日に出願された米国特許仮出願第60/942,549号の恩典を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、当該の化合物の生きている細胞内への送達に関する。
一部の実施形態では、細胞は、対象となる化合物を用いた同時印刷によってトランスフェクトされる。生存細胞のインクジェット印刷法のための方法および組成物は、公知であり、例えば、Bolandet et al.米国特許第7,051,654号、Wilsonet et al.(2003)The Anatomical Record Part A 212 A:491−496に記載されている。細胞は、例えばWarrenet et al.米国特許第6,986,739号に記載された生存細胞の沈着によって三次元構造を形成するための方法および組成物などの他の手段によって印刷することもできる。
本発明者らの研究所において成体ブタ大動脈の酵素的拡散によって以前に確立されたブタ大動脈内皮細胞系(PAEC)を使用し、さらに遺伝子トランスフェクションのために第15、16および17継代の細胞系を使用した。PAEC細胞は、10%ウシ胎児血清(GIBCO)、ならびに100IUのペニシリンおよび100mg/mLのストレプトマイシンが補給されたF12培地(GIBCO、Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド)中において37℃の加湿5% CO2(95%空気)雰囲気下で維持した。
本発明者らはさらに、インクジェット印刷法の細胞生存率およびトランスフェクション効率を組織工学において一般に使用される他の化学的および物理的トランスフェクション法と比較した。このために、一般的なリポソームをベースとする物質およびエレクトロポレーションアプローチを実施した。一般的なリポソームをベースとする物質であるLipofectamine(商標)2000(Invitrogen社)、およびエレクトロポレーションアプローチであるNucleofectionを、PAEC細胞培養を用いる印刷法と比較した。
相違するHPカートリッジについても、インクジェット遺伝子トランスフェクションについて試験した。図2gに示したように、HP51629aカートリッジは、HP51626aカートリッジより高い遺伝子トランスフェクション効率を示した。HP51629aおよびHP51626aカートリッジは、多数の類似の印刷パラメータおよびメカニズムを共有するが、ノズルサイズが相違する。HP51629aカートリッジは、HP51626aカートリッジより比較的小さなノズル径を有し、これはより高い応力を引き起こし、したがってより高いトランスフェクション効率をもたらすことができる。トリプシン処理後に、PAEC細胞は、約10〜20μmである。HP51629aおよびHP51626aカートリッジのノズルは、各々約40および50μmである(例Xuet et al.(2006)Biomaterials 27(19):3580−88を参照されたい)。
インクジェット遺伝子トランスフェクションをインビボで実施できるかどうかを評価するために、フィブリンゲルをヌードマウスの皮下組織内へ直接的に印刷し、次にPAEC細胞をpmaxGFP(商標)プラスミドと一緒に事前に形成したフィブリンゲル上へ直接的に印刷した。宿主動物内で移植細胞を天然細胞から識別するために、PAEC細胞はPKH67赤色蛍光色素(Sigma−Aldrich社、ミズーリ州セントルイス)を用いて標識した。全動物実験は、Wake Forest大学保健科学学科のACUCプロトコールにしたがって実施した。
Claims (61)
- 対象となる化合物を用いて細胞をトランスフェクトする方法であって、前記細胞の少なくとも一部が前記化合物を用いてトランスフェクトされ、前記方法は、
液体担体中に前記化合物の存在下で前記細胞を含む組成物を調製する工程と、
前記組成物をオリフィスへ通過させて、前記化合物の存在下で前記細胞に応力を加える工程とを含み、
それにより前記化合物を用いて前記細胞の少なくとも一部をトランスフェクトする方法。 - 前記細胞の少なくとも一部が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である細胞の少なくとも1%である請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも一部分が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である細胞の少なくとも5%である請求項1に記載の方法。
- 前記細胞の少なくとも一部分が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である細胞の少なくとも10%である請求項1に記載の方法。
- 前記調製工程における前記細胞の少なくとも25%が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調製工程における前記細胞の少なくとも50%が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調製工程における前記細胞の少なくとも75%が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調製工程における前記細胞の少なくとも90%が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリフィス通過工程が、1〜100マイクロ秒間の時間で実施される請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリフィスが0.01〜300μmの直径を有し、前記細胞が0.01〜200μmの直径を有する請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調製工程における前記細胞が、真核細胞である請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調製工程における前記細胞が、原核細胞である請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物が、核酸、タンパク質、分子、ナノ粒子および薬物からなる群から選択される請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物が、核酸を含む請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリフィス通過工程が、前記細胞に1〜100ms−1の剪断応力が加えられるように実施される請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記調製工程の前記組成物が、プレミックスされる請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリフィス通過工程が、インクジェット印刷器具を用いた前記細胞のインクジェット印刷法によって実施される請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インクジェット印刷器具が、熱インクジェットプリンタおよび圧電インクジェットプリンタからなる群から選択される請求項17に記載の方法。
- 前記インクジェット印刷器具が、少なくとも1つのインクジェットカートリッジを含み、前記インクジェットカートリッジが、熱インクジェットプリンタカートリッジおよび圧電インクジェットプリンタカートリッジからなる群から選択される請求項17に記載の方法。
- 細胞を印刷する方法であって、前記細胞の少なくとも一部が対象となる化合物を用いてトランスフェクトされ、前記方法は、
少なくとも1つのインクジェットプリンタカートリッジを含むインクジェット印刷器具を用意する工程と、
印刷対象の組成物を前記プリンタカートリッジ内へ装填する工程であって、装填後の前記組成物が前記化合物の存在下で前記細胞を含む工程と、
前記組成物を基質上に印刷する工程とを含み、
それにより前記化合物を用いて前記細胞の少なくとも一部をトランスフェクトする方法。 - 前記印刷工程の前記基質が、コラーゲンを用いて被覆される請求項20に記載の方法。
- 前記印刷工程が、インビボで組織基質上に前記組成物を印刷する工程によって実施される請求項20に記載の方法。
- 前記細胞の前記少なくとも一部が、前記印刷工程後に生存可能である細胞の少なくとも1%である請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記少なくとも一部が、前記印刷工程後に生存可能である細胞の少なくとも5%である請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記少なくとも一部が、前記印刷工程後に生存可能である細胞の少なくとも10%である請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞の少なくとも25%が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞の少なくとも50%が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞の少なくとも75%が、前記オリフィス通過工程後に生存可能である請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記用意する工程において前記プリンタカートリッジが複数のノズルを含み、前記ノズルが、0.01〜100μmの直径を有する請求項20〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞が、真核細胞である請求項20〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞が、原核細胞である請求項20〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記化合物が、核酸、タンパク質、分子、ナノ粒子および薬物からなる群から選択される請求項20〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記化合物が、核酸を含む請求項20〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記組成物が、プレミックスされる請求項20〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記用意する工程における前記インクジェット印刷器具が、熱インクジェットプリンタおよび圧電インクジェットプリンタからなる群から選択される請求項20〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記用意する工程における前記インクジェットプリンタカートリッジが、熱インクジェットプリンタカートリッジおよび圧電インクジェットプリンタカートリッジからなる群から選択される請求項20〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 生存細胞のアレイを形成する方法であって、前記細胞の少なくとも一部が少なくとも1つの対象となる化合物を用いてトランスフェクトされ、前記方法は、
少なくとも1つのインクジェットプリンタカートリッジを含むインクジェット印刷器具を用意する工程と、
印刷対象の組成物を前記プリンタカートリッジ内へ装填する工程であって、装填された前記組成物が前記化合物の存在下で前記細胞を含む工程と、
前記組成物を組織化されたパターンで基質上に印刷する工程とを含み、
それにより生存細胞のアレイが形成され、前記細胞の少なくとも一部は前記少なくとも1つの化合物を用いてトランスフェクトされる方法。 - 前記印刷工程の前記基質が、コラーゲンを用いて被覆される請求項37に記載の方法。
- 前記印刷工程が、インビボで組織基質上に前記組成物を印刷することにより実施される請求項37に記載の方法。
- 前記細胞の前記少なくとも一部が、前記印刷工程後に生存可能である細胞の少なくとも1%である請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記少なくとも一部が、前記印刷工程後に生存可能である細胞の少なくとも5%である請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の前記少なくとも一部が、前記印刷工程後に生存可能である細胞の少なくとも10%である請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞の少なくとも25%が、前記印刷工程後に生存可能である請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞の少なくとも50%が、前記印刷工程後に生存可能である請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程における前記細胞の少なくとも75%が、前記印刷工程後に生存可能である請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記用意する工程の前記プリンタカートリッジが複数のノズルを含み、前記ノズルが、0.01〜100μmの直径を有する請求項37〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程の前記細胞が、真核細胞である請求項37〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程の前記細胞が、原核細胞である請求項37〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程の前記化合物が、核酸、タンパク質、分子、ナノ粒子および薬物からなる群から選択される請求項37〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程の前記化合物が、核酸を含む請求項37〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記装填工程の前記組成物が、プレミックスされる請求項37〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記用意する工程における前記インクジェット印刷器具が、熱インクジェットプリンタおよび圧電インクジェットプリンタからなる群から選択される請求項37〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記用意する工程における前記インクジェットプリンタカートリッジが、熱インクジェットプリンタカートリッジおよび圧電インクジェットプリンタカートリッジからなる群から選択される請求項37〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を印刷するための装置であって、
少なくとも1つのインクジェットプリンタカートリッジを含むインクジェット印刷器具と、
前記プリンタカートリッジ内へ装填される印刷対象の組成物であって、少なくとも1つの対象となる化合物の存在下で細胞を含む組成物とを含む装置。 - 前記細胞が、真核細胞である請求項54に記載の装置。
- 前記細胞が、原核細胞である請求項54に記載の装置。
- 前記化合物が、核酸、タンパク質、分子、ナノ粒子および薬物からなる群から選択される請求項54〜56のいずれか一項に記載の装置。
- 前記化合物が、核酸を含む請求項54〜56のいずれか一項に記載の装置。
- 前記化合物が、プラスミドを含む請求項54〜56のいずれか一項に記載の装置。
- 前記インクジェット印刷器具が、熱インクジェットプリンタおよび圧電インクジェットプリンタからなる群から選択される請求項54〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インクジェット印刷器具が、少なくとも1つのインクジェットカートリッジを含み、前記インクジェットカートリッジが、熱インクジェットプリンタカートリッジおよび圧電インクジェットプリンタカートリッジからなる群から選択される請求項54〜58のいずれか一項に記載の方法。
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