CN112574851B - 一种单细胞筛选器、筛选组件、筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种单细胞筛选器、筛选组件、筛选方法及应用，该单细胞筛选器包括本体、多个喷孔、加热部及流道，其中，喷孔位于本体中，加热部位于喷孔中用于加热进入喷孔中的液体以产生气泡将细胞喷出，流道位于本体中并按照预设路径延伸至喷孔，以将细胞悬浮液输送至喷孔内。本发明的单细胞筛选器具有设计简单、制作简易的特点，采用本发明的筛选组件进行细胞打印(喷出)，其细胞打印速度远高于传统方法，使得细胞分选过程迅速，大大减少一个个筛检分类的时间，并且本发明的细胞筛选器打印细胞对细胞本身的伤害很微小。本发明的细胞筛选器还可以有其他扩展应用，例如细胞打印过程中细胞膜表面产生可复原性的孔洞可作为细胞染色体传染的应用工具。

Description

一种单细胞筛选器、筛选组件、筛选方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种单细胞筛选器、筛选组件及筛选方法。
背景技术
传统上用于单细胞筛选与隔离的方法有微流控方法和极限浓度稀释法。微流控方法包含用微流体夹取通过的单细胞并隔离到单一液滴里收集，或是用流道内的微小结构抓取捕获单个细胞等。极限浓度稀释法是将细胞悬浮液经过多次稀释之后分散至孔板等容器中，使浓度低至一个孔少于单个细胞，则某些孔内则能刚好有单个细胞。然而这些单细胞筛选隔离方法的制作过程与使用多由人工操作，操作复杂，并具有耗时长、通量低、效率低的缺点，其中，极限浓度稀释法还有空泡率高的缺点，在药筛和单克隆抗体生产等应用上有着明显的限制与障碍。
因此，如何提供一种设计更为简单、制作更为简易的单细胞筛选器并利用其进行单细胞的快速筛选，成为本领域技术人员亟待解决的一个重要技术问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单细胞筛选器、筛选组件、筛选方法及应用，用于解决目前的单细胞筛选隔离方法的制作过程与使用多由人工操作，流程复杂、耗时长、通量低、效率低，且极限浓度稀释法还有空泡率高的缺点的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种单细胞筛选器，包括：
本体，包括相对设置的第一表面与第二表面；
多个喷孔，位于所述本体中，所述喷孔自所述第二表面开口，并往所述第一表面方向延伸，但未贯穿所述第一表面；
加热部，位于所述喷孔中，并与所述喷孔的顶面连接，所述加热部用于加热进入所述喷孔中的液体以产生气泡，将进入所述喷孔中的细胞喷出；
流道，位于所述本体中，所述流道自所述第一表面开口，并按照预设路径延伸至所述喷孔，以将细胞悬浮液输送至所述喷孔内。
可选地，所述流道包括主流道及与所述主流道连通的多条子流道，每一所述喷孔分别与一所述子流道连通。
可选地，多条所述子流道分布于所述主流道的相对两侧。
可选地，所述主流道中设有柱体阵列，用以在所述细胞悬浮液进入所述子流道之前，对细胞进行排队。
可选地，所述柱体阵列中的各个柱体与最近的所述子流道之间的最短距离小于所要筛选单细胞的直径的两倍。
可选地，所述喷孔的直径小于所要筛选单细胞的直径的两倍。
本发明还提供一种单细胞筛选器组件，包括如上任意一项所述的单细胞筛选器，并包括：
储液装置，用于储存细胞悬浮液，所述储液装置设有出液口，用以输出细胞悬浮液至所述单细胞筛选器的所述流道；
细胞收集器，位于所述单细胞筛选器下方，用以接收所述喷孔喷出的目标单细胞；
废液收集器，位于所述单细胞筛选器下方，用以接收所述喷孔喷出非目标细胞及液体；
光学系统，位于所述单细胞筛选器下方，用以识别含有目标单细胞的所述喷孔的位置和编号。
可选地，所述光学系统包括明场光源系统，用以识别出细胞的数量和大小。
可选地，所述明场光源系统包括按照预设路径设置的显微镜头、同轴光光路、明场光源、聚光镜筒及CCD相机。
可选地，所述光学系统包括荧光光源系统，用以识别出具有特异性抗体标记的细胞。
可选地，所述荧光光源系统包括按照预设路径设置的显微镜头、同轴光光路、荧光滤光片、荧光光源、聚光镜筒及CCD相机。
可选地，所述细胞收集器包括多孔板，所述多孔板中的各个孔分别用以接收一个目标单细胞。
本发明还提供一种单细胞筛选方法，其采用如上任意一项所述的单细胞筛选器组件进行单细胞筛选，包括以下步骤：
采用所述储液装置供应细胞悬浮液至所述单细胞筛选器；
采用所述光学系统识别出所述单细胞筛选器中含有目标单细胞的所述喷孔的位置；
将所述细胞收集器移至所述单细胞筛选下方预设位置，并通过控制电路驱动含有目标单细胞的所述喷孔中的所述加热部，将相应所述喷孔中的单细胞依序喷出至所述细胞收集器；
将所述废液收集器移至所述单细胞筛选器下方预设位置，并通过控制电路驱动含有非目标细胞的所述喷孔中的所述加热部，将相应所述喷孔中的内容物喷出至所述废液收集器。
可选地，同时将所有含有非目标细胞的所述喷孔中的内容物喷出至所述废液收集器。
可选地，同时将所述细胞收集器及所述废液收集器移至所述单细胞筛选器下方，且所述废液收集器位于所述细胞收集器下方，当所有目标单细胞被喷出后，将所述细胞收集器移开，并将所述废液收集器上升到所述细胞收集器之前所在位置。
可选地，采用机械臂移动所述细胞收集器及所述废液收集器。
本发明还提供一种单细胞筛选器的应用，该应用采用如上任意一项所述的细胞筛选器将细胞喷出，以使细胞膜表面产生可复原性的孔洞，并利用所述孔洞进行细胞染色体传染。
如上所述，本发明的单细胞筛选器具有设计简单、制作简易的特点，采用包含所述单细胞筛选器的筛选组件进行细胞打印(喷出)，其细胞打印速度远高于传统方法，使得细胞分选过程迅速，其中，光学系统显微镜的摄像机依次扫描所有样品，用影像快速找出目标细胞的位置，依序进行目标细胞的释放，而非目标细胞可同时释放，从而大大减少一个个筛检分类的时间，并且本发明的细胞筛选器打印细胞对细胞本身的伤害很微小。本发明的细胞筛选器还可以有其他扩展应用，例如细胞打印过程中细胞膜表面产生可复原性的孔洞可作为细胞染色体传染的应用工具。
附图说明
图1显示为本发明的单细胞筛选器自所述第一表面往所述第二表面的第一剖面结构示意图。
图2显示为本发明的单细胞筛选器自所述第一表面往所述第二表面的第一剖面结构示意图。
图3显示为本发明的单细胞筛选器沿图2中B-B’向的局部剖面示意图。
图4显示为本发明的单细胞筛选器沿图2中A-A’向的局部剖面示意图。
图5显示为单细胞、多细胞及空泡分布于本发明的单细胞筛选器中的示意图。
图6显示为所述主流道中设置的柱体阵列对细胞进行排队的示意图。
图7显示为本发明的筛选组件的剖面结构示意图。
图8显示为本发明的筛选组件的立体结构示意图。
图9-图10显示为利用本发明的筛选组件将筛选出来的单细胞依序喷出至单细胞收集器的各个孔内的示意图。
图11显示为利用本发明的筛选组件同时将所有含有非目标细胞的所述喷孔中的内容物喷出至所述废液收集器的示意图。
元件标号说明
1 本体
2 喷孔
2a 第一喷孔
2b 第二喷孔
3 加热部
4 流道
4a 主流道
4b 子流道
4b-1 第一子流道
4b-2 第二子流道
5 细胞
6 柱体
d 距离
7 储液装置
8 细胞悬浮液
9 细胞收集器
10 废液收集器
11 光学系统
12a、12b 机械臂
13 孔
14 气泡
15 废液收集槽
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
请参阅图1至图11。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
实施例一
本实施例中提供一种单细胞筛选器，所述单细胞筛选器包括本体及设置于所述本体中的喷孔与流道，所述本体包括相对设置的第一表面与第二表面，请参阅图1及图2，其中，图1显示为所述单细胞筛选器自所述第一表面往所述第二表面的第一剖面结构示意图，图2显示为所述单细胞筛选器自所述第一表面往所述第二表面的第二剖面结构示意图，所述第一剖面经过所述流道4及所述喷孔2，所述第二剖面未经过所述流道4。
具体的，所述本体1中设有多个所述喷孔2，所述喷孔2自所述第二表面开口，并往所述第一表面方向延伸，但未贯穿所述第一表面。
作为示例，所述喷孔2的直径小于所要筛选单细胞的直径的两倍，以增加单细胞出现的概率。
具体的，所述喷孔2中设置有加热部3，所述加热部3与所述喷孔2的顶面连接，用于加热进入所述喷孔2中的液体以产生气泡，将进入所述喷孔中的细胞喷出。
具体的，所述流道4自所述第一表面开口，并按照预设路径延伸至所述喷孔2，以将细胞悬浮液输送至所述喷孔2内。
作为示例，如图1所示，所述流道4包括主流道4a及与所述主流道4a连通的多条子流道4b，每一所述喷孔2分别与一所述子流道4b连通。
作为示例，如图1所述，多条所述子流道4b分布于所述主流道4a的相对两侧。
请参阅图3及图4，其中，图3显示为所述单细胞筛选器沿图2中B-B’向的局部剖面示意图，图4显示为所述单细胞筛选器沿图2中A-A’向的局部剖面示意图。
作为示例，所有所述子流道4b的长度可以相同，也可以至少有两条所述子流道4b的长度不同，本实施例中，所述流道4包括与所述主流道4a一侧连通的第一子流道4b-1与第二子流道4b-2，所述第二子流道4b-2的长度大于所述第一子流道4b-1的长度，所述第一子流道4b-1与第一喷孔2a连通，所述第二子流道4b-2与第二喷孔2b连通。子流道长度不同的设计可以使喷孔的排布更为密集，提高空间利用率。
请参阅图5，显示为单细胞、多细胞及空泡分布于所述单细胞筛选器中的示意图，其中，细胞悬浮液依次通过所述主流道4a、所述子流道4b进入多个所述喷孔中，部分喷孔中会出现单个的细胞5，部分喷孔中会出现多个的细胞5，部分喷孔中仅有液体而无细胞进入，即空泡。
作为示例，所述主流道中可进一步设有柱体阵列，用以在所述细胞悬浮液进入所述子流道之前，对细胞进行排队，以增大单细胞在喷孔中出现的概率。其中，图6显示为所述主流道中设置的柱体阵列对细胞进行排队的示意图。
作为示例，所述柱体阵列中的各个柱体6与最近的所述子流道之间的最短距离d小于所要筛选单细胞的直径的两倍。
本发明的单细胞筛选器具有设计简单、制作简易的特点，可实现细胞的快速分选。
需要指出的是，所述单细胞筛选器可选用现有的热泡打印芯片，所述加热部3加热进入所述喷孔2中的液体以产生气泡，并将进入所述喷孔中的细胞喷出的过程也可称为打印细胞。
本发明的单细胞筛选器为热喷墨式筛选器(thermal Inkjet dispenser)，其利用了微喷孔中的微加热部加热流体表面，使微小体积的流体瞬间被加热至气化，产生气泡推进流体或流体中的物质。喷墨式喷头拥有快捷迅速的优势，每秒能打印100万滴以上的微小液滴，并且尺寸在20-60微米左右，能够实现单个细胞打印。并且此种喷头是可编程(programmable)的，能够以控制器(controller)精准控制打印的过程得出质量更好的成品。
实施例二
本实施例中提供一种单细胞筛选器组件，该组件包括实施例一种所述的单细胞筛选器。请参阅图7，显示为该所述单细胞筛选器组件的剖面结构示意图，该组件进一步包括储液装置7、细胞收集器9、废液收集器10及光学系统11，其中，所述储液装置7用于储存细胞悬浮液8，所述储液装置7设有出液口，用以输出细胞悬浮液8至所述单细胞筛选器的本体1内部的流道，并进一步输送至所述喷孔，所述细胞收集器9位于所述单细胞筛选器下方，用以接收所述喷孔喷出的目标单细胞，所述废液收集器10位于所述单细胞筛选器下方，用以接收所述喷孔喷出非目标细胞及液体，所述光学系统11位于所述单细胞筛选器下方，用以识别含有目标单细胞的所述喷孔的位置和编号。
作为示例，所述细胞收集器9通过机械臂12a移动，所述废液收集器10通过机械臂12b移动。
作为示例，所述光学系统包括明场光源系统，用以识别出细胞的数量和大小。本实施例中，所述明场光源系统包括按照预设路径设置的显微镜头、同轴光光路、明场光源、聚光镜筒及CCD(英文全称：charge coupled device，中文全称：电荷耦合器件)相机。
作为示例，所述光学系统包括荧光光源系统，用以识别出具有特异性抗体标记的细胞。本实施例中，所述荧光光源系统包括按照预设路径设置的显微镜头、同轴光光路、荧光滤光片、荧光光源、聚光镜筒及CCD相机。
作为示例，所述细胞收集器9包括多孔板，例如96孔板或其他数目的孔板，所述多孔板中的各个孔13分别用以接收一个目标单细胞。
采用本实施例的单细胞筛选组件进行细胞打印(喷出)，其细胞打印速度远高于传统方法，使得细胞分选过程迅速，其中，光学系统显微镜的摄像机依次扫描所有样品，用影像快速找出目标细胞的位置，然后单细胞筛选器依序进行目标细胞的释放，而非目标细胞可同时释放，从而大大减少一个个筛检分类的时间，并且本发明的细胞筛选器打印细胞对细胞本身的伤害很微小。具体筛选过程可参见实施例三。
实施例三
本实施例中提供一种单细胞筛选方法，其采用实施例二中所述的单细胞筛选器组件进行单细胞筛选，包括以下步骤：
S1：采用所述储液装置供应细胞悬浮液至所述单细胞筛选器；
S2：采用所述光学系统识别出所述单细胞筛选器中含有目标单细胞的所述喷孔的位置；
S3：将所述细胞收集器移至所述单细胞筛选下方预设位置，并通过控制电路驱动含有目标单细胞的所述喷孔中的所述加热部，将相应所述喷孔中的单细胞依序喷出至所述细胞收集器；
S4：将所述废液收集器移至所述单细胞筛选器下方预设位置，并通过控制电路驱动含有非目标细胞的所述喷孔中的所述加热部，将相应所述喷孔中的内容物喷出至所述废液收集器。
请参阅图8，显示为所述筛选组件的立体结构图，其中，为了显示所述单细胞筛选器的本体1及所述细胞悬浮液8，所述储液装置7的部分侧面省却未图示。
请参阅图9及图10，显示为利用所述筛选组件将筛选出来的细胞5(目标单细胞)依序喷出至单细胞收集器9的各个孔13内的示意图，其中，细胞5是被喷孔内的加热部加热液体产生的气泡14喷出。
作为示例，细胞被喷射出来后，带细胞的溶液会源源不断重新进入释放的喷孔中直到所有喷孔中都不包含目标单细胞。
请参阅图11，同时将所有含有非目标细胞的所述喷孔中的内容物喷出至所述废液收集器10的废液收集槽15。
废液收集完毕后，将所述废液收集器向旁边移出，目标单细胞和非目标细胞(多细胞、空泡)分选完成。若要继续分选，则更换新的细胞收集器或废液收集器后重复以上步骤。
作为示例，同时将所述细胞收集器及所述废液收集器移至所述单细胞筛选器下方，且所述废液收集器位于所述细胞收集器下方，当所有目标单细胞被喷出后，将所述细胞收集器移开，并将所述废液收集器上升到所述细胞收集器之前所在位置。
作为示例，采用机械臂12a移动所述细胞收集器，采用机械臂12b移动所述废液收集器。
采用本实施例的单细胞筛选组件进行细胞打印(喷出)，其细胞打印速度远高于传统方法，使得细胞分选过程迅速，其中，光学系统显微镜的摄像机依次扫描所有样品，用影像快速找出目标细胞的位置，然后单细胞筛选器依序进行目标细胞的释放，而非目标细胞可同时释放，从而大大减少一个个筛检分类的时间，并且本发明的细胞筛选器打印细胞对细胞本身的伤害很微小。
本发明的单细胞筛选组件适用于各种细胞的分选，包括但不限于循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，简称CTC)分选。
作为示例，本实施例中从细胞溶液中，利用荧光分子与生物标记(Bio-marker)结合法做CTC细胞分选，其中，利用光学系统扫描全部样品后检出含有单细胞的喷孔，然后利用单细胞筛选器依序将单细胞打印在细胞收集器内，所有单细胞样本皆打印出去之后，继续利用单细胞筛选器同时将所有非目标喷孔内的东西(包含多细胞和空泡液滴)打印在废液收集器内，分选流程结束后，细胞收集器里仅含有一孔一个单细胞，废液收集器里含有多细胞和液滴。
实施例四
本发明中提供一种单细胞筛选器的应用，该应用采用实施例一中所述的细胞筛选器将细胞喷出，以使细胞膜表面产生可复原性的孔洞，并利用所述孔洞进行细胞染色体传染。
需要指出的是，细胞膜上的孔洞恢复是一个比较随机的事件，孔洞大约尺寸15分钟，细胞染色体传染需要在孔洞复原之前进行。
综上所述，本发明的单细胞筛选器具有设计简单、制作简易的特点，采用包含所述单细胞筛选器的筛选组件进行细胞打印(喷出)，其细胞打印速度远高于传统方法，使得细胞分选过程迅速，其中，光学系统显微镜的摄像机依次扫描所有样品，用影像快速找出目标细胞的位置，依序进行目标细胞的释放，而非目标细胞可同时释放，从而大大减少一个个筛检分类的时间，并且本发明的细胞筛选器打印细胞对细胞本身的伤害很微小。本发明的细胞筛选器还可以有其他扩展应用，例如细胞打印过程中细胞膜表面产生可复原性的孔洞可作为细胞染色体传染的应用工具。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (13)

1.一种单细胞筛选器，其特征在于，包括：
本体，包括相对设置的第一表面与第二表面；
多个喷孔，位于所述本体中，所述喷孔自所述第二表面开口，并往所述第一表面方向延伸，但未贯穿所述第一表面；
加热部，位于所述喷孔中，并与所述喷孔的顶面连接，所述加热部用于加热进入所述喷孔中的液体以产生气泡，将进入所述喷孔中的细胞喷出；
流道，位于所述本体中，所述流道自所述第一表面开口，并按照预设路径延伸至所述喷孔，以将细胞悬浮液输送至所述喷孔内；
其中，所述流道包括主流道及与所述主流道连通的多条子流道，每一所述喷孔分别与一所述子流道连通，所述主流道中设有柱体阵列，用以在所述细胞悬浮液进入所述子流道之前，对细胞进行排队；
所述柱体阵列中的各个柱体与最近的所述子流道之间的最短距离小于所要筛选单细胞的直径的两倍；
所述喷孔的直径小于所要筛选单细胞的直径的两倍。
2.根据权利要求1所述的单细胞筛选器，其特征在于：多条所述子流道分布于所述主流道的相对两侧。
3.一种单细胞筛选器组件，其特征在于，包括如权利要求1～2任意一项所述的单细胞筛选器，并包括：
储液装置，用于储存细胞悬浮液，所述储液装置设有出液口，用以输出细胞悬浮液至所述单细胞筛选器的所述流道；
细胞收集器，位于所述单细胞筛选器下方，用以接收所述喷孔喷出的目标单细胞；
废液收集器，位于所述单细胞筛选器下方，用以接收所述喷孔喷出非目标细胞及液体；光学系统，位于所述单细胞筛选器下方，用以识别含有目标单细胞的所述喷孔的位置和编号。
4.根据权利要求3所述的单细胞筛选器组件，其特征在于：所述光学系统包括明场光源系统，用以识别出细胞的数量和大小。
5.根据权利要求4所述的单细胞筛选器组件，其特征在于：所述明场光源系统包括按照预设路径设置的显微镜头、同轴光光路、明场光源、聚光镜筒及CCD相机。
6.根据权利要求3所述的单细胞筛选器组件，其特征在于：所述光学系统包括荧光光源系统，用以识别出具有特异性抗体标记的细胞。
7.根据权利要求6所述的单细胞筛选器组件，其特征在于：所述荧光光源系统包括按照预设路径设置的显微镜头、同轴光光路、荧光滤光片、荧光光源、聚光镜筒及CCD相机。
8.根据权利要求3所述的单细胞筛选器组件，其特征在于：所述细胞收集器包括多孔板，所述多孔板中的各个孔分别用以接收一个目标单细胞。
9.一种单细胞筛选方法，其特征在于，采用如权利要求3～8任意一项所述的单细胞筛选器组件进行单细胞筛选，包括以下步骤：
采用所述储液装置供应细胞悬浮液至所述单细胞筛选器；
采用所述光学系统识别出所述单细胞筛选器中含有目标单细胞的所述喷孔的位置；将所述细胞收集器移至所述单细胞筛选下方预设位置，并通过控制电路驱动含有目标单细胞的所述喷孔中的所述加热部，将相应所述喷孔中的单细胞依序喷出至所述细胞收集器；
将所述废液收集器移至所述单细胞筛选器下方预设位置，并通过控制电路驱动含有非目标细胞的所述喷孔中的所述加热部，将相应所述喷孔中的内容物喷出至所述废液收集器。
10.根据权利要求9所述的单细胞筛选方法，其特征在于：同时将所有含有非目标细胞的所述喷孔中的内容物喷出至所述废液收集器。
11.根据权利要求9所述的单细胞筛选方法，其特征在于：同时将所述细胞收集器及所述废液收集器移至所述单细胞筛选器下方，且所述废液收集器位于所述细胞收集器下方，当所有目标单细胞被喷出后，将所述细胞收集器移开，并将所述废液收集器上升到所述细胞收集器之前所在位置。
12.根据权利要求9所述的单细胞筛选方法，其特征在于：采用机械臂移动所述细胞收集器及所述废液收集器。
13.一种单细胞筛选器的应用，其特征在于：采用如权利要求1～2任意一项所述的细胞筛选器将细胞喷出，以使细胞膜表面产生可复原性的孔洞，并利用所述孔洞进行细胞染色体转染。
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