CN112444530A - 一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置及其制样方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置和制备方法，包括：具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件；分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；对支撑网组件上样品溶液进行冷冻操作的冷冻模块；驱动支持网组件在制样操作状态与冷冻操作状态之间进行转移的快速转移装置。本发明可实现具有超微量样品消耗的冷冻电镜样品制备实验，单个样品液滴的消耗量在纳升级及纳升级以下。样品消耗量较常规制样机器人减少了1000倍以上，显著降低了实验成本，缩短了蛋白质样品纯化周期。显著提高冷冻电镜制样的成功率和实验的重现性。

Description

一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置及其制样方法

技术领域

本发明所涉及的领域为微流控、自动化和冷冻电镜领域，特别是涉及一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置及其制样方法。

背景技术

冷冻电镜技术是当前生物大分子物质结构解析的主流技术，它通过拍摄镶嵌在铜网碳膜孔的无定型冰中的生物大分子颗粒照片，然后通过三维重构技术解析得到生物大分子的精细三维结构。用冷冻电镜技术解析蛋白质等生物大分子三维结构的主要流程包括：冷冻电镜样品制备、图像采集、数据处理和三维重构。冷冻电镜样品制备是冷冻电镜实验的第一步，其目的是将待分析的样品溶液铺展在铜网上，使样品溶液在铜网表面的碳膜上形成数十至数百纳米厚的液层，然后将铜网快速投入液态乙烷中冷冻，使样品由液态转变为冷冻电镜观测所需的玻璃态。除了生物样品本身的性质外，铜网碳膜孔中的无定型冰厚度是决定冷冻电镜能否采集到高清晰生物大分子颗粒的关键因素。此外对于一些珍贵的生物样品，其在制样实验中的样品消耗量也是必须要考虑的因素，样品消耗量越少意味着实验成本越低、实验效率越高。因此理想的冷冻电镜制样方法需要具备样品冰层厚度可控、样品消耗量小的特点。

冷冻电镜样品制备的常规方法为用商品化机器人进行制样。FEI公司的Vitrobot系统是当前主流的冷冻电镜制样机器人，被各大冷冻电镜中心广泛采用。但Vitrobot系统需人手工将4μL以上样品通过移液枪注射到固定在机器制样室中的铜网表面，然后Vitrobot系统制样室内的两片环形滤纸会被按压在铜网表面，吸走近99％的样品，以制备得到纳米级厚度的样品液层，最后仪器会将铜网插入液态乙烷中完成冷冻电镜样品制备实验。目前商品机器人用于冷冻电镜制样的主要缺点为样品消耗量较大(绝大部分样品被滤纸吸走)、铜网碳膜上的样品冰层厚度不可控、实验成功率低和重现性差。

除商品机器人外，也有少量文献报道了一些研究组自制的冷冻电镜制样装置，这些装置主要分为基于压电喷墨原理的冷冻电镜制样装置和基于气体喷射的微流控芯片。基于压电喷墨原理的冷冻电镜制样装置利用压电喷头将样品喷射到铜网表面，然后将铜网插入液态乙烷中快速冷冻完成制样。这类系统的局限性是其喷头的死体积较大(>30μL)，单次实验耗费的样品体积远超常规的制样机器人，样品液滴喷射在铜网的单一区域，对铜网的利用率不高，且仪器运行速度慢，铜网上的样品在插入液态乙烷的过程中容易变干。基于气体喷射的微流控芯片也已被应用到冷冻电镜制样中，其原理为在微流控芯片中加工微通道和喷嘴，将样品和高压气体(通常为氮气)持续通入芯片并在通道中混合，样品在高压气体的带动下从喷嘴出喷出，喷射在铜网表面，然后完成样品冷冻。微流控芯片用于冷冻电镜样品制备的主要缺点是连续喷射的样品流会消耗大量样品，体积在数十微升，对喷射到上的样品的体积可控性差，且高压气体会使铜网表面的碳膜破裂。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有纳升(10^-9升)及纳升以下样品消耗量，且样品冰层厚度可控的冷冻电镜样品制备装置。

为实现上述发明目的，可以采用如下技术方案：

一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置，包括：

具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件；

分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；

驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；

对支撑网组件上样品溶液进行冷冻操作的冷冻模块；

驱动支持网组件在制样操作状态与冷冻操作状态之间进行转移的快速转移装置。

本发明中，在制样操作状态，可以实现制样探针对待检测样品溶液在支持网组件上的制样；在冷冻操作状态，可以完成对支持网组件上待检测样品冷冻，进而实现最终冷冻样品的制作。通过快速转移装置实现支持网组件在两种工作状态的切换和转移。

本发明中，制样探针主要具有两个功能，一是完成样品溶液的取样，二是完成制样，第二个功能是其最核心的功能，通过制样探针可以实现对样品量和样品厚度的控制。

本发明中，所述支持网组件包括支持网以及设置在支撑网上的微孔膜，该微孔网上加工有微米级直径的多个微孔。

作为优选，还包括所述支撑网组件可进出的制样室，在该制样室内所述制样探针完成所述的制样操作；所述制样室壳体上设有避让制样探针或支持网组件的避让孔结构。

作为进一步优选，还包括对所述制样室进行恒温恒湿控制的控湿模块和控温模块。

作为优选，还包括对制样操作过程中支撑网组件上样品溶液状态以及制样位置或者制样量进行监控的监控模块。通过监控模块，可以实现更加方便的对制样液滴量和制样液滴厚度以及制样位置的控制，进一步增加了装置的可控性。

作为优选，所述制样探针为实心探针或者具有流道结构的毛细管结构；为实心探针结构时，制样探针取样端具有对待检测溶液具有亲和力的取样面或者取样微结构；为具有流道结构的毛细管结构时，还包括对所述毛细管结构提供取样动力的液体驱动装置。

作为优选，制样探针在制样操作时，输出的样品液滴的体积范围是10纳升至1纳升。

作为优选，制样探针对微量样品溶液的操纵体积范围为0.1飞升到10微升。

作为优选，对所述支持网组件用于承接样品溶液的一侧表面经过亲水性处理。通过上述表面处理，保证支持网组件用于承接样品溶液的一侧表面对待检测样品具有更好的亲和力。

一种利用上述任一项技术方案所述的装置制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，包括如下步骤：

(1)制样探针进行取样操作，完成对待检测样品溶液的取样；

(2)三维平移台驱动下，完成取样的制样探针转移至处于制样操作状态的支持网组件的对应位置；

(3)制样探针对支持网组件上设定制样位置进行制样，在支持网组件表面的亲和力作用下得到具有不同液层厚度的梯度的样品液滴，完成待检测样品溶液在支持网组件上的制样操作；

(4)快速转移装置驱动处于制样操作状态的支持网组件移动至冷冻模块，完成对支持网组件表面待检测样品的冷冻，制备得到用于冷冻电镜的微量样品。

下面对上述技术方案做进一步说明：

本发明的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置由支持网组件、制样室模块、制样探针模块、冷冻模块、监控模块和系统控制模块构成；

所述的支持网组件由固定有微孔膜的支持网、支持网夹持装置和支持网快速移动装置组成。支持网起到支撑微孔膜的作用。微孔膜上加工有微米级直径的多个微孔，用于承载样品溶液所形成的样品液滴，微孔膜的厚度在纳米级。本发明的微孔膜可以采用碳膜。支持网由支持网夹持装置固定并安装在支持网快速移动装置上，支持网快速移动装置负责将支持网-微孔膜移至冷冻剂中完成快速冷冻。作为优选，所述支持网夹持装置可以采用镊子或采用与镊子具有等同功能的夹持件(比如弹性卡合件、螺纹件、磁吸件或者具有过盈配合结构的夹持件等)，用于实现对支持网组件的固定。所述支持网快速移动装置可以选择多种具有转移输送功能的结构，比如可以采用电机以及受电机驱动的输送臂结构，或者也可以采用电机以及电机驱动的同步带滑台结构，或者是气缸或者液压缸等作为驱动件驱动的快速移动装置等。

本发明中，所述的制样室模块由制样室、控湿模块、控温模块组成，制样室为支持网-微孔膜表面的微量样品制备提供一个控温控湿的环境。制样室模块中的控湿模块由加湿/除湿装置(加湿可以采用现有的加湿组件，比如喷雾组件、脱附加湿，等等实现加湿；除湿也可以采用现有的组件，比如可以采用吸附除湿等等实现除湿；当然作为最为简便的方式，可以直接采用目前检测领域通常采用的湿度和温度控制机构，以实现湿度或者温度的控制)、高精度湿度传感器、湿度控制器(可以是计算机或者控制芯片、控制电路等)组成，可维持制样室内的湿度在0-100％湿度之间。控温模块由制冷/制热装置、温度传感器、温度控制器组成(可以是计算机或者控制芯片、控制电路等)，可维持制腔室内的温度在-20-100℃之间。

本发明中，所述的制样探针模块由制样探针、液体驱动装置和移动装置组成，可实现微量液体样品的操纵，包括量取、储存、转移、点样、混合、反应、融合、分裂、稀释、富集等操作，移动装置负责实现制样探针的移动，移动速度范围在1μm/s至10m/s。包括移动制样探针到制样室内部或外部的任意工作区域，辅助实现对微量液体样品的操纵。

本发明中，制样探针可以为有机材料、无机材料、或无机有机复合材料构成，探针的尖端形状为尖锥形、或平头、或球形、或者异形结构，探针的截面形状为圆形、矩形、或者其它多边形，探针构型为实心构型、或具有通道的毛细管构型、或在探针尖端加工有微结构的构型，探针的长度范围在1毫米至50厘米。探针的尖端的横截面直径或边长范围为10纳米到1厘米。制样探针操纵微量样品溶液的液体驱动装置采用流体动力、机械力、电动力、磁力、光动力、声波、离心力、或重力驱动，利用样品溶液本身的表面张力、毛细作用、润湿作用、或粘附作用驱动液体。制样探针对微量样品溶液的操纵体积范围为0.1飞升到10微升。作为优选，当采用具有通道的毛细管结构时，可以采用由微升注射器及精密注射泵组成的液体驱动装置。本发明中，三维平移台构成了所述的移动装置。三维平移台一般由X、Y、Z轴三个方向的轨道，及其驱动机构构成，可以选择常规的机构，利用计算机等实现对移动路径的控制。

作为进一步优选，所述制样探针为玻璃毛细管(内外表面均为疏水)或者实心金属针(尖端亲水处理)等。

本发明中，冷冻模块负责将支持网-微孔膜表面的微量样品液滴进行快速冷冻；一般由容器以及盛放容器的冷冻液组成。作为优选，冷冻模块采用液态乙烷作为冷冻剂，采用泡沫杜瓦储存冷冻剂。

本发明中，监控模块可实时监控支持网-微孔膜表面及微量液体样品的状态，辅助完成制样探针针对支持网-微孔膜表面的定位和微量样品溶液的操纵等操作。作为优选，本发明的监控模块由镜头和CCD相机组成，通过镜头和CCD相机实现对样品液滴的检测和对制样操作的控制。

利用本发明的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置进行样品的制备时，包括以下步骤：

(1)将经过表面亲水处理后的带有微孔膜的支持网固定在支持网组件的支持网夹持装置上，使支持网夹持装置移入制样室模块的制样室内，调节制样室内的温度和湿度达到设定条件；

(2)将样品溶液装载到制样探针上；

(3)将制样探针移入制样室内，将将微量体积的样品溶液从制样探针中转移到支持网-微孔膜表面，形成具有不同液层厚度的梯度的液滴；

(4)重复(3)的操作，在一片支持网上的微孔膜上的多个位置，制备体积或组成相同或不同的样品液滴。

(5)将带有样品液滴的支持网组件快速转移到冷冻模块中完成样品液滴的快速冷冻。

作为优选，支持网组件转移速度范围在1mm/s至10m/s之间。

本发明可以采用接触式，或半接触式，或非接触式方式将制样探针上装载的样品溶液转移到支持网-微孔膜上。接触式转移方法，是指在样品转移过程中，通过制样探针尖端与支持网-微孔膜表面的接触使得制样探针尖端的部分样品液体与支持网-微孔膜表面接触并浸润，当制样探针尖端脱离支持网-微孔膜表面后，部分样品液体残留于支持网-微孔膜表面而形成样品液滴。采用接触式转移方法需首先获得支持网-微孔膜和制样探针尖端位置的准确定位信息，并依靠此定位信息，操纵制样探针模块使得制样探针尖端只与支持网-微孔膜表面发生轻触而不会导致其表面破损而造成制样失败，或支持网-微孔膜在夹持装置上的固定具有一定的弹性，减弱触碰的强度。此外，制样探针的尖端采用平面结构，相对采用锥形结构，也有利于减弱或消除探针触碰对支持网-微孔膜表面造成的破坏。

半接触式转移方法，是指在样品转移过程中，制样探针尖端与支持网-微孔膜表面不发生接触，但制样探针尖端所携带的样品液体与支持网-微孔膜表面接触并浸润，然后探针制样尖端携带部分样品液体脱离支持网-微孔膜表面，另一部分样品液体残留于支持网-微孔膜表面而形成样品液滴。半接触式转移方法的优点是在样品转移过程中探针制样尖端与支持网-微孔膜表面不发生接触，对支持网-微孔膜表面造成破坏的风险较小。但这种方式仍需制样探针尖端所携带的样品液体与支持网-微孔膜表面接触并浸润，因此，在操作过程中，需要获得支持网-微孔膜和制样探针尖端位置的准确定位信息，并依靠此定位信息，对制样探针模块进行操作。

也就是说，采用接触式或半接触式转移方法时，首先获得支持网-微孔膜和制样探针尖端位置的准确定位信息，并依靠此定位信息，操纵制样探针模块完成样品溶液的转移操作，避免因触碰导致微孔膜表面破损。作为优选，制样探针的尖端采用平面结构，减弱或消除探针触碰对支持网-微孔膜表面造成的破坏。

非接触式转移方法，是指在样品转移过程中，制样探针尖端与支持网-微孔膜表面不发生接触，制样探针尖端所携带的样品液体直接喷射至支持网-微孔膜表面形成样品液滴。非接触式转移方法的优点是在样品转移过程中探针制样尖端及其所携带的样品溶液均不与支持网-微孔膜表面发生接触，不会因触碰支持网-微孔膜表面而造成膜的破坏。

本发明中，可以通过控制制样探针模块的液体驱动装置的对样品溶液的驱动流速和驱动时间，控制在支持网-微孔膜上形成的样品液滴的体积。或者通过控制制样探针尖端所携带的样品液体与支持网-微孔膜的接触时间，控制在支持网-微孔膜上形成的样品液滴的体积。根据本发明，由转移到支持网-微孔膜上的样品溶液所形成的样品液滴的体积在纳升级(100纳升到0.1纳升)及纳升级以下，有利于形成能够满足制样需求的液层厚度梯度。作为优选，所述的样品液滴的体积范围是10纳升至0.1纳升。样品液滴体积过大，不易形成满足制样需求的液层厚度梯度。样品液滴体积过小，则容易因液体蒸发而造成液层厚度过薄甚至样品液滴蒸干。

本发明中，在制样前，对支持网-微孔膜的表面进行强亲水性处理(支持网-微孔膜的表面的接触角小于30o，即，待检测样品溶液液滴在支撑网组件表面的接触角小于30o)。所述的支持网-微孔膜的表面处理方法包括辉光放电、等离子体清洗、紫外光照射、化学腐蚀等。更好的支持网-微孔膜的表面亲水性，有利于样品液滴在支持网-微孔膜的表面的铺展。在样品液滴体积不变的条件下，样品液滴在支持网-微孔膜的表面的铺展面积越大，越有利于在液滴内形成能够满足制样需求的液层厚度梯度，即在较薄的厚度范围内形成较大范围的液层厚度梯度。

本发明中，在支持网-微孔膜的表面形成样品液滴后，可以采用利用探针拖曳或带动样品液滴在膜上移动的方法，或者气吹样品液滴的方法，或者利用超声、声波、电场、磁场、重力诱导的方法而使得样品液滴在支持网-微孔膜表面移动的方法，促使样品液滴在支持网-微孔膜的表面进一步的铺展，增加样品液滴在膜上的铺展面积，有利于在液滴内形成能够满足制样需求的液层厚度梯度。

本发明中，在样品液滴内形成液层厚度梯度的前提基础上，可以进一步控制样品液滴的蒸发速度和蒸发程度，以获得满足制样需求的纳米级液层厚度。

本发明中，通过精确控制制样室内的湿度和温度来控制样品液滴的蒸发速度，通过精确控制样品液滴在制样室内的放置时间(即样品液滴从在支持网-微孔膜上制备完成到其被转移至冷冻模块的时间，亦即蒸发时间)，来调节样品液滴的蒸发程度。通常常规冷冻电镜制样系统内的控温与控湿的目的是为防止在制样过程中样品溶液被蒸干，并不具有调节液层厚度的功能，因此这些系统对控温尤其是控湿的精度要求不高。而常规冷冻电镜制样系统能够获得纳米级的液层厚度，主要采用滤纸吸液的方式实现。而在本发明中，则是利用高精度控湿达到获得适合制样需求的纳米级液层厚度的目的。

本发明中，在制样室模块中，可以采用高精度的控湿模块在高湿度的范围内精确控制制样室内的湿度，使得样品液滴以缓慢的速度蒸发，进一步减小样品液滴的整体厚度，由此在样品液滴的液层厚度梯度范围内出现厚度在纳米级的液层，满足冷冻电镜制样对样品液层厚度的要求。根据本发明，所述的控湿模块的湿度控制精度在1％-0.1％之间，所述的高湿度范围是90％-100％之间。作为优选，制样室内的湿度控制在91％-94％之间。对于某一特定样品其湿度和温度的控制，可以根据预先是实验进行确定。

本发明中，这种在高湿度范围内精确控制制样室湿度的方法，可以实现受控的样品液滴蒸发，可以控制体积在纳升级及纳升级以下的样品液滴以缓慢的速度蒸发，在样品液滴整体被蒸发的情况下，液滴内各液层的厚度也同时降低，由于液滴内存在着从接近零厚度到其最大厚度(液滴最高点的厚度)的梯度式液层厚度分布，使得在样品液滴的液层厚度梯度范围内高概率能够出现部分厚度在纳米级的且能满足冷冻电镜制样对该样品液层厚度要求的液层。同时，采用这种受控的样品液滴蒸发方法还可以避免出现在常规体系内，纳升级及纳升以下的体积的液滴因其液滴体积微小而被快速蒸发至蒸干，导致制样失败的情况。因此，在高湿度的范围内(90％-100％)精确(1％-0.1％)控制制样室内的湿度，可以进一步提高制样的成功率。因不同样品溶液的性质不同而导致其蒸发速度有所差异，不同分子量的蛋白质颗进行冷冻电镜分析时其最适合的液层厚度也不尽相同，可以将湿度控制方法与液滴梯度液层方法相配合，形成包含有纳米级液层厚度的不同厚度分布的众多液层，在这些液层中高概率地包含能满足制样需求的液层。

根据本发明，对制样室内的温度进行控制，以减缓样品液滴蒸发速度，并保持蛋白质活性。综合考虑温度对蛋白质稳定性和蒸发速度的影响，制样室内温度设定范围为2℃至25℃，对于性质稳定的样品，温度值可设置为15-25℃，对于不稳定的样品，温度值可设置为4℃。选择较低的制样室温度，有利于降低液滴的蒸发速度。

本发明中，通过控制样品液滴从制备完成到转移至冷冻模块的时间，来控制液滴的蒸发时间，进而调节液滴的蒸发程度。为进一步提高制样实验的成功率，在一个支持网-微孔膜上，顺序形成同一样品的多个液滴，进行样品的制样实验。在上述顺序形成同一样品的多个液滴过程中，因不同液滴的形成时序不同，而导致前后形成的液滴的蒸发时间有所不同(先形成的液滴蒸发时间长，后形成的液滴蒸发时间短)，使得不同的液滴之间也会形成蒸发时间的“梯度”，这种将蒸发时间的“梯度”与液滴本身不同液层厚度的梯度组合起来的方法，在多个液滴中所获得的液层厚度分布更为丰富，进一步增加了获得合适液层厚度的概率，有利于提高制样实验的成功率。

本发明中，可以采用在一个支持网-微孔膜上顺序形成同一样品的多个液滴的方法时，利用监控模块观察最开始形成的数个液滴的蒸发情况，当这些液滴被蒸干而开始变得不可见时，迅速将将支持网-微孔膜及携带的微量样品液滴转移至冷冻模块进行快速冷冻。

本发明中，在支持网-微孔膜表面制备的样品液滴数量由用户根据微孔膜大小和样品液滴体积决定，在一张微孔膜上制备的样品液滴数量范围为1-1000个。通过自动完成清洗，制样探针也可依次操作多种不同的样品溶液，在一片微孔膜的指定位置进行多种不同样品液滴的制备。

本发明的优点是：可实现具有超微量样品消耗的冷冻电镜样品制备实验，单个样品液滴的消耗量在纳升级及纳升级以下。样品消耗量较常规制样机器人减少了1000倍以上，显著降低了实验成本，缩短了蛋白质样品纯化周期。本发明采用液滴厚度梯度和液滴受控蒸发的方法，获得超薄的厚度呈梯度变化的样品液层，显著提高冷冻电镜制样的成功率和实验的重现性。本发明可在单片支持网-微孔膜上制备多种不同样品的液滴，使一片支持网-微孔膜能收集多套数据，提高了其利用率和实验效率，降低了实验成本，减少了冷冻电镜机时消耗。本发明系统兼容常规的实验设备和耗材，如商品化铜网、泡沫杜瓦、铜网转移工具等，不需要特殊实验耗材，降低了实验成本。本发明系统可以自动化控制操作，也可以采用手动方式进行操作，实验成功率和重现性高，样品消耗量少，有利于推广应用。

附图说明

图1为实施例1的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置结构和样品制备操作示意图。

图2为实施例2的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置的结构和样品制备操作示意图。

图3为实施例3的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置的结构和样品制备操作示意图。

图4为实施例1中支持网-微孔膜和制样探针的照片(左)及在铜网表面生成的5nL样品液滴阵列的照片(右)。

图5为实施例1中200kV冷冻电镜下的铁蛋白颗粒照片(左)及300kV冷冻电镜解析得到的铁蛋白二维分类图(右)。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

图1是实施例1的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置的结构和样品制备操作示意图。

样品溶液3为铁蛋白溶液，将样品溶液加入小型离心管中。采用玻璃毛细管作为制样探针7，先在丁烷火焰中拉制制样探针7，获得具有拉尖尖端的制样探针7，再用表面处理试剂处理清洗干净的制样探针7，获得内外表面均为疏水的制样探针7。制样探针7采用石蜡油15作为载液。制样探针7与由10微升注射器及精密注射泵组成的液体驱动装置8连接，然后安装于三维平移台9上，共同组成液滴操纵机器人。采用镊子作为铜网2的夹持装置5，用于固定铜网2，铜网2上固定有微孔膜1，即碳膜，采用电机驱动的同步带滑台作为铜网快速转移装置6。采用透明的亚克力板作为制样室10的外壳，控湿模块11和控温模块12被安装在制样室10内部，制样室10的外壳上留有孔，供铜网快速转移装置6和制样探针7进出制样室10。监控模块14由镜头和CCD相机组成，实时监控铜网表面状态并将图像输出于外部显示器上。冷冻模块13采用液态乙烷作为冷冻剂，采用泡沫杜瓦储存冷冻剂。

样品溶液3的量取操作方法为：控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移入离心管内的样品溶液3中，在精密注射泵的驱动下，制样探针7将从样品溶液3中吸取特定体积的样品溶液3(图1(1))进入毛细管制样探针7。然后控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移出离心管。

铜网2上的样品制备操作方法为：铜网2上固定有微孔膜1(厚度为5～100nm，其上分布有1～100μm的微孔)。使用前，铜网2和微孔膜1经过辉光放电亲水化处理3分钟。在铜网快速转移装置6的驱动下，铜网2被转移进入制样室10内部。控湿模块11和控温模块12被开启，将制样室10内的湿度维持在92％-94％之间(湿度控制精度在1％-0.1％之间)，将制样室10内的温度维持在4℃。控制三维平移台9(可选择现有三维运动机构)，使制样探针7的尖端通过制样室外壳预设的孔进入制样室10内部，在监控模块14的辅助下，使制样探针7对准铜网2。在铜网2上转移的样品体积和数量由用户决定，最少的转移体积为1皮升，最少的转移数量为1个。一般样品液滴体积为1-10纳升。控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移动到铜网2表面的第一处制样位置，在精密注射泵的驱动下，样品溶液3被转移到铜网2的表面。然后，控制三维平移台9，依次切换制样探针7的制样位置并将样品溶液3转移到对应的制样位置处(图1(2))。当完成铜网2表面多个位置处的样品制备后，控制三维平移台9，使制样探针7撤离铜网2表面。在铜网快速转移装置6的驱动下，铜网2被从制样室10转移进入冷冻模块13的冷冻剂中，完成样品的快速冷冻(图1(3))。对于单一样品液滴，控制样品液滴4的蒸发时间在20秒左右。

实施例1的另一种操作方法是，在铜网2上形成同一样品溶液3的3个以上的样品液滴4，利用监控模块14观察最开始形成的1-2个液滴的蒸发情况，当这些液滴被蒸干而开始变得不可见时，迅速将将铜网2转移至冷冻模块13进行快速冷冻。当在铜网2上制备16个5nL铁蛋白样品液滴4时，样品液滴制备时间约30秒。样品液滴制备完成后，再等待约30秒至铜网2表面的前四个制备的液滴都不可见时，快速将铜网2插入冷冻剂中完成样品的快速冷冻。利用该操作，可以实现对液滴蒸发状态的观测和调整，通过液滴厚度梯度和液滴受控蒸发的方法，获得超薄的厚度呈梯度变化的样品液层，显著提高冷冻电镜制样的成功率和实验的重现性。

实施例2

图2是实施例2的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置的结构和样品制备操作示意图。

将样品溶液3(转铁蛋白溶液)加入微型离心管中。采用实心金属针作为制样探针7，制样探针7的尖端为平头、开槽或其它有利于承载样品溶液3的异形结构，用疏水试剂处理制样探针7尖端以外的区域，获得尖端亲水的制样探针7。制样探针7安装于三维平移台9上，共同组成液滴操纵机器人。采用镊子作为铜网夹持装置5，用于固定铜网2，采用电机驱动的同步带滑台作为铜网快速转移装置6。采用透明的亚克力板作为制样室10的外壳，控湿模块11和控温模块12被安装在制样室10内部，制样室10的外壳上留有孔，供铜网快速转移装置6和制样探针7进出制样室10。监控模块14由镜头和CCD相机组成，实时监控铜网表面状态并将图像输出于外部显示器上。冷冻模块13采用液态乙烷作为冷冻剂，采用泡沫杜瓦储存冷冻剂。

样品溶液3的量取操作方法为：控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移入离心管管内的样品溶液3中。然后再控制三维平移台9，将制样探针7移出样品溶液3，制样探针7的亲水尖端将蘸上特定体积的样品溶液3(图2(1))。

铜网上的样品制备操作方法为：在铜网快速转移装置6的驱动下，铜网2被转移进入制样室10内部。控湿模块11和控温模块12被开启，将制样室13内的湿度维持在100％，将制样室10内的温度维持在16℃。控制三维平移台9，使制样探针7的尖端通过制样室10外壳的孔进入制样室10内部，在监控模块14的辅助下，使制样探针7对准铜网2的制样位置。在铜网2上转移的样品液滴4的体积和数量由用户决定，最少的转移体积为1皮升，最少的转移数量为1个。控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移动到铜网2表面的制样位置处并使样品溶液3接触铜网2的表面，样品溶液3被移到铜网2的表面(图2(2))。当完成铜网2表面的样品液滴4制备后，控制三维平移台9，使制样探针7撤离铜网2表面。在铜网快速转移装置6的驱动下，铜网从制样室10转移进入冷冻模块13的冷冻剂中，完成样品的快速冷冻(图2(3))。

实施例3

图3为实施例3的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置的结构和样品制备操作示意图

四种不同的待测样品溶液3被分别装在384孔板的四个孔中，超纯水装载在另外的孔中(图3中未显示)。采用玻璃毛细管作为制样探针7，先在丁烷火焰中拉制制样探针7，获得具有拉尖尖端的制样探针7，再用表面处理试剂处理清洗干净的制样探针7，获得内外表面均为疏水性质的制样探针7。制样探针7采用石蜡油作为载液。制样探针7与由10微升注射器及精密注射泵组成的液体驱动装置8连接，然后安装于三维平移台9上，共同组成液滴操纵机器人。采用镊子作为铜网夹持装置5，用于固定铜网2，铜网2上固定有微孔膜1。使用前，铜网2和微孔膜1经过辉光放电处理3分钟。采用步进伺服电机驱动的同步带滑台作为铜网快速转移装置6。采用透明的亚克力板作为制样室10的外壳，控湿模块13和控温模块14被安装在制样室10内部，制样室10的外壳上留有孔，供铜网快速转移装置6和制样探针7进出制样室10。监控模块16由镜头和CCD相机组成，实时监控铜网表面状态并将图像输出于外部显示器上。冷冻模块13采用液态乙烷作为冷冻剂，采用泡沫杜瓦储存冷冻剂。

样品溶液3量取操作方法为：控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移入384孔板的待测样品溶液3中，在精密注射泵的驱动下，制样探针7将从样品溶液3中吸取特定体积的样品溶液3(图3(1))进入毛细管。然后控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移出384孔板板孔。当完成一种待测样品溶液3的转移后，如果要继续对另一种不同的样品溶液3进行转移操作，可以在三维平移台9的控制下，将制样探针7的尖端移入储存有超纯水的板孔中，在注射泵的驱动下，使制样探针7反复吸取和注射超纯水，完成对制样探针7内外壁的清洗，避免不同样品间的交叉污染。当制样探针7完成清洗后，可继续按照上述步骤完成对其它样品的转移操作。

铜网上的样品制备操作方法为：在铜网快速转移装置6的驱动下，铜网2被转移进入制样室10内部。控湿模块13和控温模块14被开启，将制样室10内的湿度维持在93％-98％之间，将制样室10内的温度维持在4℃。控制三维平移台9，使制样探针7的尖端通过制样室外壳的孔进入制样室10内部，在监控模块14的辅助下，使制样探针7对准铜网2的制样位置。在铜网10上转移的样品体积和数量由用户决定，最少的转移体积为1皮升，最少的转移数量为1个。通常在铜网2上准备的样品液滴体积为100皮升至500皮升。控制三维平移台9，将制样探针7的尖端移动到铜网2表面的制样位置处，在精密注射泵8的驱动下，样品溶液3被移到铜网2的表面(图3(2))。然后，控制三维平移台9，使制样探针7撤离铜网2表面并转移到超纯水中，完成制样探针7的清洗。随后，在三维平移台9的控制下，制样探针7重复上述操作，在铜网2表面制备其他样品溶液3的液滴4。当完成铜网2表面的全部样品液滴4的制备后，控制三维平移台9，使制样探针7撤离铜网2表面。在铜网快速转移装置6的驱动下，铜网2从制样室10被转移进入冷冻模块13的冷冻剂中，完成样品的快速冷冻(图3(3))。

图4为实施例1中铜网和制样探针的正视照片(左)及在铜网表面生成的5nL液滴阵列的照片(右)。

图5为实施例1中200kV冷冻电镜下的铁蛋白颗粒照片(左)及300kV冷冻电镜解析得到的铁蛋白二维分类图(右)。从图中可以看出，本发明的系统可以高效率地完成纳升级蛋白质样品的冷冻制样实验，并可用于冷冻电镜结构解析。

Claims (10)

1.一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，包括：

具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件，该支持网组件表面对所述待检测样品溶液具有亲和性；

分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；

驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；

对支撑网组件上样品溶液进行冷冻操作的冷冻模块；

驱动支持网组件在制样操作状态与冷冻操作状态之间进行转移的快速转移装置；

还包括所述支撑网组件可进出的制样室，以及对所述制样室进行温度和湿度控制的控湿模块和控温模块。

2.根据权利要求1所述的用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，还包括对制样操作过程中支撑网组件上样品溶液状态以及制样位置或者制样量进行监控的监控模块。

3.根据权利要求1所述的用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，所述制样探针为实心探针或者具有流道结构的毛细管结构；为实心探针结构时，制样探针取样端具有对待检测溶液具有亲和力的取样面或者取样微结构；为具有流道结构的毛细管结构时，还包括对所述毛细管结构提供取样动力的液体驱动装置。

4.根据权利要求1或4所述的用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，所述制样探针对微量样品溶液的操纵体积范围为0.1飞升到10微升。

5.一种利用权利要求1～4任一项所述的装置制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制样探针进行取样操作，完成对待检测样品溶液的取样；

(2)三维平移台驱动下，完成取样的制样探针转移至处于制样操作状态的支持网组件的对应位置；

(3)制样探针对支持网组件上设定制样位置进行制样，在支持网组件表面的亲和力作用下得到具有不同液层厚度的梯度的样品液滴，完成待检测样品溶液在支持网组件上的制样操作；

(4)快速转移装置驱动处于制样操作状态的支持网组件移动至冷冻模块，完成对支持网组件表面待检测样品的冷冻，制备得到用于冷冻电镜的微量样品。

6.根据权利要求5所述的制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，其特征在于，步骤(3)中，利用制样探针在支持网组件上形成的体积范围是10纳升至0.1纳升的样品液滴。

7.根据权利要求5所述的制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，其特征在于，所述的控湿模块的湿度控制精度在1％-0.1％之间，所述的高湿度范围是90％-100％之间；控温模块制样室内温度为2℃至25℃。

8.根据权利要求7所述的制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，其特征在于，在得到不同液层厚度梯度的样品液滴基础上，通过控制制样室内的湿度和温度来控制样品液滴的蒸发速度，以及通过控制液滴的蒸发时间，来调节样品液滴的蒸发程度。

9.根据权利要求8所述的制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，其特征在于，在某一支持网组件上顺序形成同一样品的多个液滴，利用监控模块观察最开始形成的数个液滴的蒸发情况，当这些液滴因被蒸干而开始变得不可见时，迅速将将支持网-微孔膜及携带的微量样品液滴转移至冷冻模块进行快速冷冻。

10.根据权利要求7所述的制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，其特征在于，对所述的支持网组件表面进行强亲水性处理，或用探针拖曳或带动样品液滴在膜上移动的方法，或者气吹样品液滴的方法，或者利用超声、声波、电场、磁场、重力诱导的方法而使得样品液滴在支持网组件表面移动的方法，或者上述一种或多种方法的结合，增加样品液滴在支持网组件表面的铺展面积。

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