CN113484108B - 应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法。其中界面包括气液界面以及二维膜(蛋白质二维晶体膜、石墨烯膜以及超薄碳膜等)与液体形成的界面，其步骤包括：设置冷冻制样仪的温度和湿度，在制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷；取载网固定在冷冻制样仪上，将样品溶液滴加至载网上，除去多余样品溶液，在载网上下两面形成液膜；将载网插入预冷后的液态乙烷中玻璃化；其中，在冷冻电镜样品制备过程中，在载网液膜的上界面或/和下界面应用电荷进行界面电荷修饰和界面电荷的改变。本发明提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，能够解决传统冷冻电镜样品制备方法中常出现的冰层过厚、不吸附样品颗粒以及取向优势等问题。
Description
技术领域
本发明涉及透射电镜样品制备技术领域，特别涉及一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法。
背景技术
单颗粒冷冻电镜方法需要包埋在薄玻璃态冰层中的样品颗粒分布均匀且取向随机。然而，冷冻样品制备过程中形成的超薄液膜，其上下界面却常常不吸附样品颗粒，或者导致嵌在玻璃态冰中的样品颗粒出现取向优势问题，成为冷冻电镜高分辨结构解析的主要障碍之一。
冷冻样品制备过程中形成的超薄液膜，其上下界面包括气液界面以及二维膜/溶液界面。其中二维膜包括石墨烯膜，氮化硼膜，超薄碳膜等。
目前对于解决冷冻电镜样品制备过程中气液界面导致的取向优势问题，都是基于气液界面的疏水性质，采用的方法如下：
利用去污剂分子特殊的双亲性结构，帮助占据气液界面，从而去改善蛋白的取向优势问题。但该方法存在的缺点是只有特定的去污剂对改善取向优势问题才有效，而且筛选过程费时费力，成功率较低。还有的方法是利用超快冻样仪系统，在蛋白颗粒被气液界面捕获之前将其冷冻，但结果显示，即使冷冻样品制备的时间缩短至6ms，也不能使蛋白颗粒远离气液界面，还需要更多的证据证明超快冻样仪的有效性。上述方法都是使样品颗粒远离气液界面，而如果蛋白颗粒不吸附于气液界面，往往需要很高的制样浓度，而且冰层很难制薄。
另外，也有方法在载网孔内铺连续超薄碳膜以及石墨烯膜等二维薄膜，采用辉光放电的方法，利用离子束轰击其表面，使其由疏水面变为亲水面，使样品颗粒吸附在二维膜/溶液界面上从而远离气液界面。但该方法中二维膜材料对于蛋白样品的亲附性并不好，而且往往会导致更为严重的取向优势问题。
如在《PNAS》116.24，11718-11724，2019中提到的方法中，通过在辉光放电的过程中引入不同的化学基团，使石墨烯表面的疏水性质发生改变，但这种方法对于蛋白样品取向分布的改变不明显。在《JACS》141.9，4016-4025，2019中报道的方法中，通过在石墨烯膜上共价耦合镍原子，来吸附带有his标签的蛋白颗粒，但这种方法只对部分蛋白有效，衬度较差，很难实用。另外，在《PNAS》117.2，1009-1014，2020中提到的方法中，通过紫外光对单层石墨烯膜进行照射，使石墨烯表面带上含氧基团改变石墨烯的疏水性质，但氧化石墨烯膜本身也是及其疏水的。同时，也有一定数量的蛋白质不吸附在二维膜上，导致二维膜的使用受限。
因此，目前迫切需要一种制备冷冻电镜样品的方法，以解决当前冷冻电镜样品制备方法中常出现的冰层过厚、界面不吸附样品颗粒以及界面引起的取向优势等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备快速高效且制备质量高的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，以解决传统冷冻电镜样品制备方法中常出现的冰层过厚、界面不吸附样品颗粒以及界面引起的取向优势等问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，包括如下步骤：
设置冷冻制样仪的温度和湿度，在制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷；
取载网固定在冷冻制样仪上，将样品溶液滴加至载网上，除去多余样品溶液，在载网上下两面形成液膜；
将载网插入预冷后的液态乙烷中玻璃化；
其中，在冷冻电镜样品制备过程中，对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，或者在无二维膜的载网液膜上，对气液界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变。
进一步地，在无二维膜的载网液膜上，对气液界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，包括：先在样品溶液中加入阳离子去污剂和/或阴离子去污剂，再将加入阳离子去污剂和/或阴离子去污剂的样品溶液滴加至载网上。
进一步地，所述阳离子去污剂和阴离子去污剂的质量百分比浓度为0.002％～0.01％，所述阳离子去污剂为CTAB或DTAC，所述阴离子去污剂为CHS或SLS。
进一步地，对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，包括：先在铺有连续二维膜的载网上滴加阳离子去污剂和/或阴离子去污剂，静置4-6分钟后再将样品溶液滴加至载网上。
进一步地，所述阳离子去污剂和阴离子去污剂的质量百分比浓度为0.01％～0.02％，所述阳离子去污剂为CTAB或DTAC，所述阴离子去污剂为CHS、SLS或聚乙烯亚胺。
进一步地，对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，包括：先在铺有连续二维膜的载网上滴加氨基芘、1-芘羧酸、苯酚或间苯三酚，静置4-6分钟后再将样品溶液滴加至载网上。
进一步地，所述氨基芘、1-芘羧酸、苯酚或间苯三酚的质量百分比浓度为0.01％～0.1％。
进一步地，所述载网上的连续二维膜为碳膜、石墨烯膜或氮化硼膜。
进一步地，所述载网上的连续二维膜的铺设方法为，在微孔阵列碳支持膜的透射电镜载网的碳支持膜面紧密贴附通过化学气相沉积法制备的铜基二维膜，然后使用三氯化铁溶液蚀刻铜基，经过多次清洗，最终将二维膜膜平铺至微孔阵列碳支持膜上。
进一步地，所述载网预先采用辉光放电处理。
由于在冷冻电镜样品制备过程中，无论是气液界面还是二维膜/溶液界面，其界面的电荷性质是导致界面吸附蛋白质颗粒以及形成取向优势的根本原因。在冷冻制样过程中，蛋白质吸附在气液界面上是由于界面上的负电导致的，并非传统认为的气液界面的疏水性质造成的。当调制气液界面使其带正电时，该界面同样会吸附蛋白质颗粒，但吸附在带正电的气液界面的蛋白质颗粒和吸附在带负电的气液界面的蛋白质颗粒具有完全不同的优势取向。并且，由于常见的气液界面通常是带负电的，因此，本发明提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，通过应用界面电荷，对界面上的电荷进行调制，促使界面电荷性质发生改变，从而改善吸附于界面上的样品颗粒的取向分布，并通过在三维重构的过程中合并不同电荷条件下的数据进行计算，从而有效改善蛋白颗粒的取向优势问题。对于自身不带电的二维膜和溶液的界面，通过化学修饰的方法，使二维膜和溶液的表面带有不同性质和数量的电荷，促使其更为普适的吸附蛋白质颗粒，从而调节蛋白质取向分布的能力，进而去解决界面的蛋白颗粒取向优势问题。
附图说明
图1为本发明实施例提供的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法的流程图；
图2为本发明实施例提供的在冷冻样品制备过程中气液界面上分别修饰正负电荷所制备的谷氨酸脱氢酶蛋白的冷冻样电镜照片以及二维分类图；
图3为本发明实施例提供的在冷冻样品制备过程中气液界面上分别修饰正负电荷以及修饰少量正电荷所制备醛缩酶、谷氨酸脱氢酶70S核糖体样品的三维重构取向分布图；
图4为本发明实施例提供的在冷冻样品制备过程中气液界面上加入少量的正电荷修饰得到的红血球凝集素三聚体蛋白的冷冻样品图、二维分类图、三维重构密度图以及分辨率信息图；
图5为本发明实施例提供的在冷冻样品制备过程中石墨烯-溶液界面上分别修饰正负电荷所制备的谷氨酸脱氢酶蛋白的冷冻样品图以及二维分类图；
图6为本发明实施例提供的在冷冻样品制备过程中石墨烯-溶液界面上分别利用π-π共价耦合的方式修饰正负电荷所制备的醛缩酶蛋白的冷冻样品图以及二维分类图。
具体实施方式
参见图1，本发明实施例提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，包括如下步骤：
首先预设好冷冻制样仪的温度和湿度等参数，在冷冻制样仪的制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷。
然后用镊子夹取辉光放电处理后的载网并固定在冷冻制样仪的上，用移液器吸取微升体积的样品溶液滴加于载网上方，随后吸去多余的样品溶液，载网上下两面形成由样品溶液形成的超薄液膜，从而在载网上形成上下两个界面。
对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，或者在无二维膜的载网液膜上，对气液界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，最终实现界面更好地吸附蛋白颗粒，改变蛋白颗粒的取向分布，并通过三维重构过程中合并不同电荷条件下的数据，解决界面的蛋白颗粒取向优势问题。
最后将形成有超薄液膜的载网快速插入预冷后的液态乙烷中对载网上下两面的超波液膜进行玻璃化，载网上下两面的液膜玻璃化完成后保存留用。
作为本发明的一种具体实施方式，在无二维膜的载网液膜上，对气液界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，可以在滴加样品溶液至载网之前，在样品溶液中加入质量百分比浓度为0.002％～0.01％的阳离子去污剂和/或者阴离子去污剂。利用阴离子去污剂、阳离子型去污剂特殊的亲疏水结构，占据气液界面的同时又能通过亲水基团的电荷对界面进行修饰，而后进行冷冻电镜样品的制备。其中，阳离子去污剂为CTAB或DTAC，所述阴离子去污剂为CHS或SLS。
作为本发明的一种具体实施方式，对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，可以在滴加样品溶液至载网之前，先在铺有连续二维膜的载网上滴加的质量百分比浓度为0.01％～0.02％的阳离子去污剂和/或阴离子去污剂，静置4-6分钟后再将样品溶液滴加至载网上。其中，阳离子去污剂为CTAB或DTAC，阴离子去污剂为CHS、SLS或聚乙烯亚胺。
作为本发明的一种具体实施方式，对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，可以在滴加样品溶液至载网之前，先在铺有连续二维膜的载网上滴加质量百分比浓度为0.01％～0.1％的氨基芘、1-芘羧酸、苯酚或间苯三酚，静置4-6分钟后再将样品溶液滴加至载网上。
其中，载网上的连续二维膜为碳膜、石墨烯膜或氮化硼膜。
其中，载网上的连续二维膜的铺设方法为，在微孔阵列碳支持膜的透射电镜载网的碳支持膜面紧密贴附通过化学气相沉积法制备的铜基二维膜，然后使用三氯化铁溶液蚀刻铜基，经过多次清洗，最终将二维膜膜平铺至微孔阵列碳支持膜上。
下面通过实施例对本发明提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法做具体说明。
实施例1
应用气液界面电荷制备谷氨酸脱氢酶蛋白的冷冻电镜样品。首先预设好冷冻制样仪的温度和湿度等参数，在冷冻制样仪的制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷。然后用镊子夹取辉光放电处理后的载网并固定在冷冻制样仪上，在谷氨酸脱氢酶蛋白的样品溶液中分别加入质量百分比浓度分别为0.01％的阳离子去污剂CTAB和阴离子去污剂CHS，用移液器吸取微升体积的加有阳离子去污剂CTAB和阴离子去污剂CHS的谷氨酸脱氢酶蛋白的样品溶液滴加于载网上方，随后利用滤纸吸去多余的样品溶液。在多孔支持膜的载网上，其空孔内存在上下气液界面。利用阴离子型去污剂和阳离子型去污剂特殊的亲疏水结构，占据气液界面的同时又能通过亲水基团的电荷对界面进行修饰。最后将载网快速插入预冷后的液态乙烷中进行玻璃化，并保存。参见图2，所制备的谷氨酸脱氢酶蛋白的冷冻电镜照片以及二维分类图，其中，图2(a)为气液界面修饰为正电时谷氨酸脱氢酶蛋白冷冻电镜照片以及二维分类图，图2(b)为气液界面修饰为负电时谷氨酸脱氢酶蛋白冷冻电镜照片以及二维分类图。在气液界面为正电荷时，几乎全是蛋白颗粒的侧视图取向，而在气液界面为负电荷时，几乎全是蛋白颗粒的顶视图取向。由此可以说明，界面上电荷性质的改变，可以改变蛋白质颗粒的取向分布。
实施例2
应用气液界面电荷制备醛缩酶蛋白、谷氨酸脱氢酶蛋白和70s核糖体蛋白的冷冻电镜样品。首先预设好冷冻制样仪的温度和湿度等参数，在冷冻制样仪的制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷。然后用镊子夹取辉光放电处理后的载网并固定在冷冻制样仪上，在醛缩酶蛋白、谷氨酸脱氢酶蛋白和70s核糖体蛋白的样品溶液中分别加入质量百分比浓度分别为0.01％的阳离子去污剂CTAB和阴离子去污剂CHS，用移液器吸取微升体积的加有阳离子去污剂CTAB和阴离子去污剂CHS的醛缩酶蛋白、谷氨酸脱氢酶蛋白和70s核糖体蛋白的样品溶液分别滴加于载网上方，随后利用滤纸吸去三个载网上多余的样品溶液。最后分别将三个载网快速插入预冷后的液态乙烷中进行玻璃化，并保存。参见图3(a)和图3(b)，为快速冷冻过程中形成的气液界面上分别修饰正负电荷所得到的醛缩酶蛋白、谷氨酸脱氢酶蛋白和70s核糖体蛋白三种样品溶液的三维重构取向分布图，可以看出气液界面为正电时的样品颗粒的取向分布与气液界面为负电时的样品颗粒的取向分布有很大的不同。对于醛缩酶蛋白，当气液界面为正电荷时，几乎都是侧视图方向取向分布，而当气液界面为负电荷时，则主要是顶视图方向取向分布。而对于谷氨酸脱氢酶蛋白样品，当气液界面为正电荷时，几乎都是侧视图方向取向分布，当气液界面为负电荷时，则变成了主要是顶视图方向取向分布。而对于70s核糖体蛋白样品，当气液界面为正负电荷时的取向也有很大的不同，为正电荷时的取向变得更为集中，取向优势问题更为严重，而为负电荷时时取向则较为均匀一些。参见图3(c)，当醛缩酶蛋白、谷氨酸脱氢酶蛋白和70s核糖体蛋白三种样品的常规冷冻样品制备时，样品颗粒的取向分布情况，存在明显的取向优势问题。参见图3(d)，对于醛缩酶蛋白、谷氨酸脱氢酶蛋白和70s核糖体蛋白三种样品，分别通过三维重构过程中对不同电荷条件下的数据进行合并计算，都可以有效改善三种蛋白颗粒的取向优势问题。
实施例3
应用气液界面电荷制备红血球凝集素三聚体蛋白的冷冻电镜样品。首先预设好冷冻制样仪的温度和湿度等参数，在冷冻制样仪的制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷。然后用镊子夹取辉光放电处理后的载网并固定在冷冻制样仪上，在红血球凝集素三聚体蛋白的样品溶液中分别加入质量百分比浓度分别为0.005％的阳离子去污剂CTAB和阴离子去污剂CHS，用移液器吸取微升体积的加有阳离子去污剂CTAB和阴离子去污剂CHS的红血球凝集素三聚体蛋白的样品溶液滴加于载网上方，随后利用滤纸吸去多余的样品溶液。最后将载网快速插入预冷后的液态乙烷中进行玻璃化，并保存。参见图4，通过对界面上分别修饰正负电荷的数据在三维重构的过程中进行合并计算，得到红血球凝集素三聚体蛋白样品的冷冻样品图、二维分类图、三维重构密度图以及分辨率信息图。在常规冷冻样品制备时存在严重的优势问题，如图4(a)所示。参见图4(b)，在气液界面上被阳离子去污剂修饰时，侧视图的取向可以增加至40％左右，只需少量的单颗粒数据采集，便可以得到红血球凝集素蛋白三聚体如图4(d)所示
的结构，三维重构取向分布图和FSC曲线图如图4(c)和图4(e)所示，重构密度真实可信。
实施例4
应用二维膜-溶液界面电荷制备谷氨酸脱氢酶蛋白的冷冻电镜样品。首先预设好冷冻制样仪的温度和湿度等参数，在冷冻制样仪的制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷。在微孔阵列碳支持膜的透射电镜载网的碳支持膜面紧密贴附通过化学气相沉积法制备的铜基二维膜，然后使用三氯化铁溶液蚀刻铜基，经过多次清洗，最终将二维膜平铺至微孔阵列碳支持膜上。将额外铺有单层石墨形成连续二维膜的载网预先经过辉光放电处理，用镊子夹取该载网固定在冷冻制样仪上，将浓度为0.01％的阳离子去污剂CTAB和阴离子去污剂CHS滴加于该载网表面，静置等待5分钟后，再用移液器吸取微升体积的谷氨酸脱氢酶蛋白样品溶液滴加至该载网上，随后利用滤纸吸去多余的谷氨酸脱氢酶蛋白样品溶液，利用阴离子型去污剂和阳离子型去污剂特殊的亲疏水结构，疏水端与二维膜表面结合的同时又能通过亲水基团的电荷对界面进行修饰，最后将载网快速插入预冷后的液态乙烷中进行玻璃化，并保存。参见图5，在单层石墨形成的连续二维膜和样品溶液的界面上分别修饰正负电荷，所制备的谷氨酸脱氢酶蛋白的冷冻样品图以及二维分类图。从图5可以看出，对于谷氨酸脱氢酶蛋白样品，在利用单层石墨形成连续二维膜的载网进行冷冻制样时，利用正电荷去修饰单层石墨形成的连续二维膜和样品溶液的界面之后，样品颗粒的取向几乎全变成了侧视图取向，参见图5(a)，其二维分类图同样也验证了这样的结果。而利用负电荷去修饰单层石墨形成的连续二维膜和样品溶液的界面后，颗粒的取向分布则多为顶视图取向，参见图5(b)，其二维分类图的结果亦验证了这一结果。因此，本发明实施例通过对界面上电荷性质的改变，可以改变蛋白的取向分布。
实施例5
应用二维膜-溶液界面电荷制备醛缩酶蛋白的冷冻电镜样品。首先预设好冷冻制样仪的温度和湿度等参数，在冷冻制样仪的制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷。在微孔阵列碳支持膜的透射电镜载网的碳支持膜面紧密贴附通过化学气相沉积法制备的铜基二维膜，然后使用三氯化铁溶液蚀刻铜基，经过多次清洗，最终将二维膜平铺至微孔阵列碳支持膜上。将额外铺有单层石墨形成连续二维膜的载网预先经过辉光放电处理，用镊子夹取该载网固定在冷冻制样仪上，将浓度为0.05％的的氨基芘或者1-芘羧酸滴加于该载网表面，静置等待5分钟后，再用移液器吸取微升体积的醛缩酶蛋白样品溶液滴加至该载网上，随后利用滤纸吸去多余的醛缩酶蛋白样品溶液，氨基芘或者1-芘羧酸会通过π-π共价耦合的方式结合于载网的二维膜表面，氨基芘或者1-芘羧酸带有的正电或负电的功能基团-OH及-COOH等会对二维膜表面起到化学修饰的作用，使其表面带上正电荷或者负电荷，最后将载网快速插入预冷后的液态乙烷中进行玻璃化，并保存。参见图6，在单层石墨形成的连续二维膜和样品溶液的界面上分别修饰正负电荷，所制备的醛缩酶蛋白的冷冻样品图以及二维分类图。从图6可以看出，对于醛缩酶蛋白样品，在利用单层石墨形成连续二维膜的载网进行冷冻制样时，利用正电荷基团(-OH)去修饰单层石墨形成的连续二维膜和样品溶液的界面之后，样品颗粒的取向几乎全变成了侧视图取向，参见图6(a)，其二维分类图同样也验证了这一结果。而利用负电荷基团(-COOH)去修饰单层石墨形成的连续二维膜和样品溶液的界面后，颗粒的取向则多顶视图取向，参见图6(b)，其二维分类图的结果亦验证了这一结果。因此，本发明实施例通过对界面上电荷性质的改变，可以改变蛋白的取向分布。
本发明提供的一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，通过应用界面电荷，在冷冻样品制备过程中进行界面电荷修饰以及界面电荷的改变，最终实现界面更好地吸附蛋白颗粒，改变蛋白颗粒的取向分布，并通过合并计算不同电荷条件下的数据，解决界面的蛋白颗粒取向优势问题。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于，包括如下步骤：
设置冷冻制样仪的温度和湿度，在制样容器中利用液氮对液态乙烷预冷；
取载网固定在冷冻制样仪上，将样品溶液滴加至载网上，除去多余样品溶液，在载网上下两面形成液膜；
将载网插入预冷后的液态乙烷中玻璃化；
其中，在冷冻电镜样品制备过程中，对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，包括：先在铺有连续二维膜的载网上滴加阳离子去污剂或阴离子去污剂，静置4-6分钟后再将样品溶液滴加至载网上；
或者在无二维膜的载网液膜上，对气液界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，包括：先在样品溶液中加入阳离子去污剂和/或阴离子去污剂，再将加入阳离子去污剂或阴离子去污剂的样品溶液滴加至载网上。
2.根据权利要求1所述的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于：所述阳离子去污剂和阴离子去污剂的质量百分比浓度为0.002％～0.01％，所述阳离子去污剂为CTAB或DTAC，所述阴离子去污剂为CHS或SLS。
3.根据权利要求1所述的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于：所述阳离子去污剂和阴离子去污剂的质量百分比浓度为0.01％～0.02％，所述阳离子去污剂为CTAB或DTAC，所述阴离子去污剂为CHS、SLS或聚乙烯亚胺。
4.根据权利要求1所述的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于，对载网液膜上的二维膜界面应用带电分子进行界面电荷修饰和界面电荷的改变，包括：先在铺有连续二维膜的载网上滴加氨基芘、1-芘羧酸、苯酚或间苯三酚，静置4-6分钟后再将样品溶液滴加至载网上。
5.根据权利要求4所述的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于：所述氨基芘、1-芘羧酸、苯酚或间苯三酚的质量百分比浓度为0.01％～0.1％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于：所述载网上的连续二维膜为碳膜、石墨烯膜或氮化硼膜。
7.根据权利要求6所述的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于：所述载网上的连续二维膜的铺设方法为，在微孔阵列碳支持膜的透射电镜载网的碳支持膜面紧密贴附通过化学气相沉积法制备的铜基二维膜，然后使用三氯化铁溶液蚀刻铜基，经过多次清洗，最终将二维膜平铺至微孔阵列碳支持膜上。
8.根据权利要求4所述的应用界面电荷制备冷冻电镜样品的方法，其特征在于：所述载网预先采用辉光放电处理。
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