CN111477265B - 一种功能化石墨烯薄膜在冷冻电镜三维重构中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种功能化石墨烯薄膜在冷冻电镜三维重构中的应用。所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜能够用于冷冻电子显微镜三维重构中，所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜由生物活性配体连接于石墨烯薄膜上形成，生物活性配体为Ni‑氨三乙酸配体；其中生物活性配体功能化石墨烯薄膜作为或用于制备冷冻电镜的支撑膜；生物活性配体功能化石墨烯薄膜特异性捕获带His标签的蛋白或生物大分子。本发明生物活性配体功能化石墨烯薄膜可以通过在未来优化中直接定位或捕获细胞裂解物中的目标生物分子，将生物分子纯化和冷冻电镜样品制备结合到一个步骤中是可预期的。

Description

一种功能化石墨烯薄膜在冷冻电镜三维重构中的应用

技术领域

本发明涉及一种利用功能化石墨烯实现生物分子高分辨结构解析的方法，属于生物冷冻电镜技术领域。

背景技术

冷冻电子显微镜自上世纪70年代出现以来，经过长期发展，尤其是近年的科学技术突破，已经成为当前最重要的结构生物学研究手段。冷冻电子显微镜将处于生理条件下的含水生物样品快速冷冻至非晶玻璃态冰中，再利用透射电子显微镜观察冷冻状态下的样品，并结合图像处理技术解析生物大分子结构，因而具有其它手段所不具备的独特优势。冷冻电镜技术近年来在仪器硬件及结构分析软件方面的革命性突破，大大扩展了该技术的应用范围，深刻地改变着结构生物学的研究内容和格局。在过去的二十多年里，我国的结构生物学研究取得了飞速发展，已经成为了结构生物学研究大国，但是基于自主知识产权的结构生物学方法与相关科学技术研究成果还非常少。

冷冻电子显微学领域虽然获得了蓬勃发展，但仍然不是一个成熟的技术，其更广泛的发展与应用受到科学技术瓶颈的限制。冷冻样品制备作为冷冻电子显微学的关键步骤，一直是该领域的技术难点。直至今天，冷冻电镜样品的制备原理，制备材料和装配工艺与20年前相比并没有明显变化，仍然停留在每个实验人员根据不同的样品状态进行制样摸索的阶段，而且可重复性很差，大大影响了冷冻电镜结构解析的效率。随着电子显微镜硬件设备与软件技术的迅速发展，样品制备科技的瓶颈效应越发凸显出来。如何制备厚度合适，样品分布均匀，分子性质保持良好的冷冻样品是制样的核心问题。因此，设计新型的冷冻电镜支持膜材料是获得优异的冷冻样品的关键所在，亦是突破冷冻样品制备科技瓶颈的核心所在。

目前普遍采用的冷冻电镜支持膜材料是微筛孔碳膜，此类材料在冷冻电镜应用领域有一系列的缺点，包括表面性质不均匀、微筛孔边缘厚度不一致、无定型碳骨架在液氮温度下导电性差、机械刚性与延展性差容易破裂等，悬挂在微筛孔中的溶液薄膜气液界面对生物大分子的结构稳定性、颗粒取向性、分布均一性均产生不良影响。微筛孔支持的超薄碳膜(厚度在3～5nm)也是较为普遍使用的一种冷冻制样支撑材料，在一定程度上减小了溶液气液界面对生物分子的影响，但无定型碳膜的背景噪音大大，限制了对较小分子结构的高分辨率结构研究。以上问题导致冷冻制样的可重复性、普遍通用性、成功率、样品质量的均一性等都大大降低。过去几年里，已经有若干课题组在探索新材料制备的冷冻样品载网，包括氮化硅微筛孔、金微筛孔、氧化石墨烯薄膜等，但至今尚未得到广泛应用，其主要原因是这些材料本身就不是理想的载网支持膜材料，存在导电性差、液氮温度下刚性差、容易破裂等问题，且在实际中可重复性的制备工艺很不成熟。因此，需要提供一种理想的新型冷冻电镜载网支持膜材料，用于生物分子的高分辨结构解析。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用功能化石墨烯薄膜实现生物分子高分辨结构解析的方法，本发明采用的功能化石墨烯薄膜为一种生物活性配体功能化石墨烯薄膜，即将转移至冷冻电镜载网得到石墨烯支持膜进行石墨烯薄膜表面化学功能化并利用化学链接引入高密度的生物活性配体(Ni-NTA)得到，所述功能化石墨烯薄膜充分提高了石墨烯与生物大分子样品的结合性能；本发明采用的功能化石墨烯薄膜的功能化修饰可以解决石墨烯的疏水性问题，利用化学链接引入高密度的生物活性配体，可以实现支持膜与生物分子的选择特异性结合，准确控制蛋白质分布。

本发明所涉及的石墨烯可为大面积单晶石墨烯、多晶石墨烯，少层石墨烯等，可采用现有技术中的方法进行，如CVD法、机械剥离法、液相剥离法、石墨氧化还原法等方法。

具体地，生物活性配体功能化石墨烯薄膜可用于冷冻电子显微镜三维重构；

所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜由生物活性配体连接于石墨烯薄膜上形成，所述生物活性配体为Ni-氨三乙酸配体，其中，所述生物活性配体通过共价键连接于所述石墨烯薄膜上。

所述应用中，所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜作为或用于制备冷冻电镜的支撑膜。

所述应用中，所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜特异性捕获带His标签的蛋白或生物大分子。

本发明采用的生物活性配体功能化石墨烯薄膜对石墨烯晶格影响很小或没有影响，并保持单层单晶石墨烯的优越性能，因此与无定形碳膜相比，有效降低了原始冷冻电镜显微照片中的背景噪声。本发明生物活性配体功能化石墨烯薄膜具有捕获带His标签的蛋白的特异性，适合作为原子分辨率的冷冻电子显微镜三维重构的支撑材料，本发明以20S蛋白酶体、60s核糖体前体、PNPase蛋白、荧光蛋白(红色荧光蛋白(RFP))为例，验证了本发明生物活性配体功能化石墨烯薄膜与带His标签的蛋白的特异性结合。

当使用生物活性配体功能化石墨烯薄膜时，制作具有20～30nm最佳冰厚度的冷冻样本是更可控的，并且这种冰厚度是嵌入大多数蛋白的理想选择并且没有引入额外的背景噪音。

可按照下述步骤制作冷冻样本：将所述带His标签的蛋白或生物大分子的溶液滴加至所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜上，然后在如下条件制作冷冻样品：

湿度为80～100％，温度为4～12℃，吸干时间为0.5～5s。

本发明所采用的生物活性配体功能化石墨烯薄膜可按照包括如下步骤的方法制备：

1)将石墨烯薄膜转移至电镜载网上；

2)采用高锰酸钾和碱性化合物的混合水溶液处理所述石墨烯薄膜；

3)采用氨三乙酸活化所述石墨烯薄膜，然后与镍盐反应即得到所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜。

具体地，步骤1)中，所述电镜载网可为微栅载网或其他类型电镜载网。

具体地，步骤1)中，可采用现有技术的方法转移所述石墨烯薄膜，如无胶直接转移法(J.C.Zhang et al.,Clean Transfer of Large Graphene Single Crystals forHigh-Intactness Suspended Membranes and Liquid Cells.Adv.Mater.29,1700639(2017).

；W.Regan et al.,A direct transfer of layer-areagraphene.Appl.Phys.Lett.96,113102(2010).；Matkovic,U.Ralevic,M.Chhikara,M.M.Jakovljevic,D.Jovanovic,G.Bratina,R.Gajic,J.Appl.Phys.2013,114,093505.；W.H.Lin,T.H.Chen,J.K.Chang,J.I.Taur,Y.Y.Lo,W.L.Lee,C.S.Chang,W.B.Su,C.I.Wu,ACS Nano2014,8,1784)、聚合物辅助转移法(J.W.Suk et al.,Transfer of CVD-GrownMonolayer Graphene onto Arbitrary Substrates.Acs Nano 5,6916-6924(2011).；L.Lin et al.,Surface Engineering of Copper Foils for Growing Centimeter-SizedSingle-Crystalline Graphene.Acs Nano 10,2922-2929(2016).；Y.C.Lin,C.C.Lu,C.H.Yeh,C.H.Jin,K.Suenaga,P.W.Chiu,Nano Lett.2012,12,414.；E.Ledwosinska,P.Gaskell,A.Guermoune,M.Siaj,T.Szkopek,Appl.Phys.Lett.2012,101,033104.；W.Regan,N.Alem,B.Aleman,B.S.Geng,C.Girit,L.Maserati,F.Wang,M.Crommie,A.Zettl,Appl.Phys.Lett.2010,96,113102.)等方法。

具体地，步骤2)中，所述碱性化合物可为氢氧化钠或氢氧化钾；

步骤2)中，所述混合水溶液中，所述高锰酸钾的浓度可为0～0.4M，但不为零，所述碱性化合物的浓度可为0～0.2M，但不为零；

所述处理的时间可为1～60min，如50min。

采用如下方式处理所述石墨烯薄膜：

将所述混合水溶液滴加至所述石墨烯薄膜上；静置后，可用滤纸吸掉所述混合水溶液，并用亚硫酸氢钠水溶液(0～1M，但不为零)充分清洗至石墨烯薄膜表面无残留处理溶液。

步骤2)用于氧化石墨烯薄膜表面。

上述的制备方法中，步骤3)之前，所述方法还包括如下改性步骤：

采用1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺和2-(N-吗啉代)乙磺酸的混合水溶液处理所述石墨烯薄膜。

上述的制备方法中，所述混合水溶液中，所述1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的浓度可为1～6mM，具体可为5mM，所述N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)的浓度可为1～6mM，具体可为5mM，所述2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)的浓度可为10～200mM，具体可为100mM。

具体地，所述混合水溶液的pH值为4.0～6.0，具体可为5；

所述处理的时间为1～60分钟。

具体地，步骤3)中，将所述石墨烯薄膜置于含有所述氨三乙酸的TBE缓冲液中进行所述活化步骤；

所述活化的时间可为0.1～4小时，具体可为2小时；

所述氨三乙酸的浓度可为1.0～15mM，具体可为11.3mM；

所述TBE缓冲液的pH值为7～9，具体可为8.5。

具体地，步骤3)中，所述镍盐可为硫酸镍、氯化镍或硝酸镍；

向所述石墨烯薄膜滴加所述镍盐的水溶液；

所述反应的时间可为0.1～1.5小时，具体可为1小时；

所述镍盐的水溶液的浓度为1.0～15mM，具体可为11.3mM；

所述反应结束后，可采用去离子水洗涤所述石墨烯薄膜。

本发明具体实施方式中，采用原子力显微镜测试了石墨烯功能化后的平整度变化；采用拉曼光谱测定了石墨烯功能化后的结晶性变化；采用透射电子显微镜检测了石墨烯的完整性、稳定性和抗辐照能力。

本发明采用的生物活性配体功能化石墨烯薄膜对石墨烯晶格影响很小或没有影响，并保持单层单晶石墨烯的优越性能，因此与无定形碳膜相比，有效降低了原始冷冻电镜显微照片中的背景噪声。与无定形碳载网相比，生物活性配体功能化石墨烯薄膜天然亲水，对生物分子更友好。此外，它能够捕获感兴趣的蛋白质，防止蛋白质分子被吸附到空气-水界面。生物活性配体功能化石墨烯薄膜在选择目标蛋白质和减少用于样本制备的蛋白质量方面显示出高度特异性，因此简化了蛋白质纯化并改善了蛋白质稳定性。这些都为石墨烯材料用于冷冻电镜开辟了新的前景。生物活性配体功能化石墨烯薄膜膜的突出优点使得制备具有均匀适当的冰厚度的玻璃化冷冻电镜样品更加可控，并且更可靠地进行数据处理，尤其是在衬度传递函数估计中，用于高分辨率冷冻电镜结构测定。本发明生物活性配体功能化石墨烯薄膜可以通过在未来优化中直接定位或捕获细胞裂解物中的目标生物分子，将生物分子纯化和冷冻电镜样品制备结合到一个步骤中是可预期的。

附图说明

图1为镍原子改性悬空单层石墨烯的表征；其中，图1(a)为覆盖在冷冻电镜Au载网的悬空石墨烯膜；插图显示了在铜箔上生长的相对应的原始石墨烯；图1(b)为悬空石墨烯薄膜的原子力显微镜表征；图1(c)为石墨烯薄膜的高分辨率透射电镜图像；插图显示了石墨烯膜的放大透射电镜图像；图1(d)为生物活性配体功能化石墨烯膜的2D原子力显微镜图像；图1(e)为图1(d)中标记的方形区域中对应的生物活性配体功能化石墨烯膜的高倍率原子力显微镜3D图像；图1(f)为石墨烯表面上修饰配体的高度分布的统计直方图；图1(g)为Ni-NTA改性的石墨烯膜的扫描透射电子显微镜图像和相应的Ni原子能量色散X射线光谱元素分布，揭示了镍原子在石墨烯表面上的均匀分布；图1(h)为高分辨率扫描透射电子显微镜图像，显示石墨烯表面上潜在的单个镍原子，由绿色圆圈标记；图1(i)为Ni-NTA改性石墨烯的高分辨率Ni 2p，N 1s XPS光谱。

图2为转移的石墨烯膜的典型透射电镜图像；其中，图2(a)为观察到五个孔的转移石墨烯膜的低倍放大透射电镜图像；图2(b)为悬空的石墨烯膜覆盖的单个孔的典型透射电镜图像；图2(c)为在一个孔内悬空的石墨烯膜的更高放大率透射电镜图像。

图3为不同的放大倍数和模式原子力显微镜表征的悬空石墨烯膜；其中，图3(a)和图3(b)分别为具有16孔和单孔的石墨烯膜的2D原子力显微镜图像；图3(c)为图3(b)中标记的方形区域中石墨烯膜的相应高倍原子力显微镜3D图像。

图4(a)为悬空生物活性配体功能化石墨烯膜的原子力显微镜表征；图4(b)为图4(a)中标记的虚线白线的高度轮廓；高度与用于功能化石墨烯膜的这些生物活性分子的大小一致。

图5为原始石墨烯(图5(a))和Ni-NTA改性石墨烯(图5(b))载网的X射线光电子能谱表征。

图6为生物活性配体功能化石墨烯膜亲水性和强度的表征；其中，图6(a)为在功能化处理之前(上)和之后(下)，石墨烯在Cu上的亲水性，水接触角分别为88°和53°；图6(b)为功能化处理之前(上)和之后(下)，悬空的石墨烯在载网上的亲水性，水接触角分别为56°和29°；图6(c)为功能化处理之前(红色)和之后(蓝色)的悬空石墨烯的拉曼光谱；图6(d)和图6(e)分别为石墨烯膜和Ni-NTA功能化石墨烯膜(生物活性配体功能化石墨烯膜)的选择区域电子衍射(SAED)图案，剂量率为86e/A²/s，虚线矩形框展示了相应强度；图6(f)为三阶积分布拉格强度(I)与一阶积分布拉格强度(Imax)的比率，分别作为石墨烯膜和生物活性配体功能化石墨烯膜剂量的函数。

图7为通过荧光以及负染色电子显微镜表征生物活性配体功能化石墨烯膜的结合特异性；其中，图7(a)为His标记的红色荧光蛋白与作为生物活性配体但不存在Ni离子的石墨烯膜一起温育，在荧光显微镜下未检测到红色信号；图7(b)为高密度的红色信号与Ni离子结合到生物活性配体功能化石墨烯膜；图7(c)为用300mM咪唑缓冲液洗掉红色信号；从图7(d)到图7(i)为His-标记的PNPase结合亲和力的负染色电子显微镜表征；图7(d)和图7(g)几乎没有蛋白质颗粒附着在作为生物活性配体但没有Ni离子的石墨烯膜载网上；图7(e)和图7(h)由生物活性配体功能化石墨烯膜载网支持的His-标记的PNPase的代表性显微照片，其中蛋白质颗粒被可见地鉴定，一些蛋白质颗粒用红色箭头表示；图7(f)和图7(i)为用300mM咪唑缓冲液洗掉蛋白质颗粒；图7(g)、图7(h)和图7(i)分别是图7(d)、图7(e)和图7(f)用较高的放大倍数而获得的电子显微镜照片。

图8为空白生物活性配体功能化石墨烯膜(图8(a))和His-标记的PNPase负载的生物活性配体功能化石墨烯膜(图8(b))的负染色电子显微镜显微照片，在图8(b)中可以清楚地看到单分散的带His标签的PNPase颗粒。

图9为生物活性配体功能化石墨烯薄膜在冷冻电子显微镜样品制备中的应用；其中，图9(a)为His-标记的20S蛋白酶体(箭头标记)和60s核糖体前体(圆圈标记)混合蛋白在无定形碳膜上的代表性显微照片，插图是Relion在2D分类中产生的平均类别，其中上部是60s核糖体前体，下部是20S蛋白酶体；图9(b)为在不存在Ni离子的情况下NTA生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上的混合蛋白质的代表性显微照片；图9(c)为Ni-NTA修饰的生物活性配体功能化石墨烯膜载网上的混合蛋白的代表性显微照片；图9(d)为蛋白质比例变化的统计分析，在没有Ni离子NTA石墨烯膜的情况下，His标记的20S蛋白酶体相对于核糖体的比率在NTA修饰的石墨烯膜上约为30％，但在Ni-NTA修饰的生物活性配体功能化石墨烯膜上增加9倍至270％。

图10为在生物活性配体功能化石墨烯膜载网上制备的复合物的冷冻电镜结构测定；其中，图10(a)为冷冻电子断层扫描显示，在多孔碳涂层载网中定位的20S颗粒，每个点代表一个20S粒子；图10(b)列出了来自图10(a)中的冷冻电子断层扫描重构的Z轴的三个不同层，并且它们的相对位置由箭头指示，冷冻标本的厚度估计为～50nm，这些层中的比例尺表示50nm；图10(c)为冷冻电子断层扫描显示Ni-NTA生物活性配体功能化石墨烯膜载网中20S颗粒的定位，每个斑点代表一个20S粒子，这些颗粒主要分布在同一层；图10(d)列出了图10(c)中来自冷冻电子断层扫描重构的Z轴的三个代表性层，并且用箭头指示它们的相对位置。冷冻标本的厚度估计为～25nm，比例尺代表50nm；图10(e)为使用从Ni-NTA生物活性配体功能化石墨烯膜样本收集的粒子图像对20S蛋白酶体进行三维重构；图10(f)为从三维重建中提取的α-和β-亚基密度的两种不同视图(包含相应的原子模型拟合)；图10(g)为由α-和β-亚基界面分段的相互作用α-螺旋密度(网状)原子模型(紫色带，pdb代码：3J9I)，以及一些大侧链的密度被清楚地识别。

图11(a)为多孔碳膜载网支持的20S蛋白酶体的代表性冷冻电子显微镜显微照片；图11(b)-图11(d)为从图10(a)中的断层图像重建中提取的Z轴的不同层；层(b)和层(d)对应于两个空气-水界面，亦是蛋白质颗粒主要分布区域；通过计算层(b)和层(d)之间的距离，可以估计冷冻样本的厚度(～50nm)，层(c)为玻璃化冷冻样品中的一个选定层，其中可以识别一些稀疏分散的颗粒。

图12(a)为生物活性配体功能化石墨烯膜载网支持的20S蛋白酶体的代表性冷冻电子显微镜显微照片；图12(b)-图12(d)为通过图10(c)中的断层图像重构提取的Z轴的不同层，发现几乎所有的蛋白质颗粒都分布在同一层(c)；层(b)距层(c)4-5nm，并且一些冰污染物(用箭头标记)是可察觉的，表明(b)层几乎不位于冷冻样品边界之外；层(d)与层(c)在与(b)不同的方向上约20nm，通过计算层(b)和(d)之间的距离来估计冷冻样品厚度为～25nm。

图13(a)为由连续碳膜(Continuous carbon)、多孔碳膜(Holey carbon)或生物活性配体功能化石墨烯膜(FGM)支撑的20S蛋白酶体的3D重构的FSC曲线，所有这三个重建来自完全相同数量(6,095)的粒子，水平虚线表示FSC＝0.143分辨率估计标准，并且标记了每个重建的相应分辨率；图13(b)分别在连续碳膜、多孔碳膜和生物活性配体功能化石墨烯膜上的20S蛋白酶体颗粒取向的欧拉角分布，这些斑点的直径表示颗粒的相对部分，并且结构的一些主要取向显示在旁边。在20S蛋白酶体重构中应用D7对称性，因此分布图仅覆盖3D球体的1/14。在连续碳膜和多孔碳膜上除了侧视图(θ＝0°)之外，还有一部分颗粒具有其他取向。在生物活性配体功能化石墨烯膜上几乎找不到这样的其他取向(例如连续碳膜上θ＝～50°或多孔碳膜上θ＝～90°)。

图14(a)为20S蛋白酶体的3D密度图；图14(b)为20S蛋白酶体内的α-α亚基相互作用；图14(c)为20S蛋白酶体内的β-β亚基相互作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中应用的石墨烯薄膜按照CVD法制备，并采用无胶直接转移法(J.C.Zhang et al.,Clean Transfer of Large Graphene Single Crystals for High-Intactness Suspended Membranes and Liquid Cells.Adv.Mater.29,1700639(2017).)转移至冷冻电镜微栅Au载网上。

对转移后的石墨烯薄膜进行了表征：

图1(a)为覆盖在冷冻电镜Au载网的悬空石墨烯膜；插图显示了在铜箔上生长的相对应的原始石墨烯；图1(b)为悬空石墨烯薄膜的原子力显微镜表征；图1(c)为石墨烯薄膜的高分辨率透射电镜图像；插图显示了石墨烯膜的放大透射电镜图像。

图2为转移的石墨烯膜的典型透射电镜图像；其中，图2(a)为观察到五个孔的转移石墨烯膜的低倍放大透射电镜图像；图2(b)为悬空的石墨烯膜覆盖的单个孔的典型透射电镜图像；图2(c)为在一个孔内悬空的石墨烯膜的更高放大率透射电镜图像。

图3为不同的放大倍数和模式原子力显微镜表征的悬空石墨烯膜；其中，图3(a)和图3(b)分别为具有16孔和单孔的石墨烯膜的2D原子力显微镜图像；图3(c)为图3(b)中标记的方形区域中石墨烯膜的相应高倍原子力显微镜3D图像。

实施例1、生物活性配体功能化石墨烯薄膜的制备

1、制备

在转移后的石墨烯薄膜表面滴加7μL的0.40M高锰酸钾和0.20M氢氧化钠的混合溶液滴，静置一段时间(约50分钟)后，用滤纸吸掉混合溶液，并用1M的亚硫酸氢钠充分清洗至石墨烯薄膜表面无残留处理溶液。接着，通过5.0mM 1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，5.0mM N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和0.10M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)的混合溶液(pH 5.0)改性石墨烯表面并保持约50分钟。之后，石墨烯载网在含有11.3mM氨三乙酸的50mM TBE缓冲液(pH 8.5)中活化一定时间(约2小时)，然后滴加11.3mM硫酸镍(NiSO₄)溶液反应一段时间(约1小时)。最后，用去离子水洗涤改性的石墨烯薄膜，并用于随后的表征和蛋白质捕获。

2、结果分析

上述通过一系列化学反应对所制备的悬空石墨烯薄膜进行功能化，以实现具有生物活性配体Ni-NTA的特定功能，并使用一系列显微镜和光谱分析表征生物活性配体功能化石墨烯膜的质量。悬空的石墨烯薄膜在功能化过程中可以承受多次操作，以至于在化学改性后没有引入额外的破坏。与未修饰的悬空石墨烯薄膜相比，生物活性配体功能化石墨烯薄膜的表面更加粗糙，具有额外的结构特征(图1(d)和图1(e))。生物活性配体功能化石墨烯薄膜的表面高度波动平均为～1.5nm(图1(f)和图4)，类似于附着的Ni-NTA分子的垂直高度，表明在石墨烯表面上成功制备了生物活性配体。值得注意的是，连接配体的平均高度远小于常规冷冻电子显微镜中使用的无定形碳薄膜(～5nm)的厚度，因此可能显着降低透射电镜支撑膜的背景噪声。扫描透射电子显微镜成像和生物活性配体功能化石墨烯薄膜的相应能量色散X射线光谱元素分布说明了Ni原子在石墨烯表面上的均匀分布，证明了Ni-NTA在石墨烯薄膜上的成功引入(图1(g))。生物活性配体功能化石墨烯薄膜的高分辨率扫描透射电子显微镜显示出分散的高对比度特征，可能对应于改性石墨烯表面上单独的镍原子(图1(h))。

本发明使用X射线光电子能谱(XPS)分析了生物活性配体功能化石墨烯薄膜的元素组成和电子结构。将所有XPS光谱校准至sp²碳的284.0eV结合能。对于生物活性配体功能化石墨烯薄膜，XPS光谱呈现C 1s，O 1s，N 1s，Ni 2p和Au 2p(1s，2p对应于原子内电子的电子构型)的信号，原子比分别为83.2％，13.6％，1.0％，0.8％，1.3％(图5)。其中，Au的光谱信号来自支撑多孔碳的金载网。高分辨率Ni 2p光谱在856.4eV和874.1eV(图1(i))显示两条显著的条带，分别对应于Ni 2p3/2和Ni 2p1/2，与Ni²⁺阳离子的电子结合能的文献值一致。在高分辨率N 1s光谱中以400.3eV为中心的N 1s的特征峰可以归属于C-NH₂键，其衍生自与石墨烯薄膜共价连接的NTA(图1(i))。

进一步，本发明使用水接触角测量评估了生物活性配体功能化石墨烯薄膜的亲水性。研究了功能化处理对石墨烯在铜箔表面上生长的石墨烯薄膜上的亲水性(图6(a))和转移到Au载网(图6(b))的影响。图6(a)显示在功能化处理后，铜箔上石墨烯的水接触角从88°降低至53°。在转移的Au载网上，水接触角从56°降至29°，表明处理后具有较高亲水性(图6(b))。

石墨烯中碳-碳键的完整性对其特殊的物理性质至关重要。本发明表征了悬空的石墨烯薄膜和生物活性配体功能化石墨烯薄膜的拉曼光谱。结果表明，2D(2690cm^-1，来自二阶拉曼散射的双声子带)与G(1580cm^-1，一阶拉曼散射)峰的强度比接近8，并且没有缺陷峰，证明了悬空石墨烯薄膜的高质量(图6(c))。功能化处理后，石墨烯的G和2D峰的形状保持良好，出现弱D峰(1350cm^-1，缺陷诱导的二阶拉曼散射，图6(c))，表明石墨烯晶格变化较小。这保证了生物活性配体功能化石墨烯薄膜的高导热性和导电性以及其降低电子辐射对样品损伤的潜在能力。通过表征透射电镜中石墨烯薄膜的衍射图案变化来研究电子辐射对生物活性配体功能化石墨烯薄膜稳定性的影响(图6(d)和图6(e))。生物活性配体功能化石墨烯薄膜的衍射图中的尖峰与在200kV下以

加速的电子剂量率暴露1s后的悬空石墨烯薄膜非常相似(图6(d)和图6(e))，表明生物活性配体功能化石墨烯薄膜保留了很好的晶格结构。石墨烯膜和生物活性配体功能化石墨烯膜的布拉格反射的相对强度，定义为布拉格峰的三阶积分强度与一阶积分强度的比率，即使在高达

的高电子辐射下也都表现出小的衰变(图6(f))。载网上可忽略不计的辐射损伤说明了生物活性配体功能化石墨烯薄膜在电子束下的高稳定性，这应归因于连续大面积单晶石墨烯薄膜的高电子传导性。

实施例2、生物活性配体功能化石墨烯薄膜的生物应用性能研究

1、试验方法

在冷冻下，滴加一定浓度的带有和小配体分子有特异性结合标签的荧光蛋白至实施例1制备的生物活性配体功能化石墨烯薄膜，静置一定时间后用缓冲溶液反复清洗，然后使用荧光显微镜检测石墨烯表面的荧光信号。实验同时设置多个对照组，测试生物活性配体功能化石墨烯薄膜对带有标签的蛋白的特异性结合能力。

His标记的PNPase的负染色EM分析：将一滴约5μL的100nM PNPase样品滴加到新修饰的石墨烯载网上，并在4℃的高湿度室中温育15分钟。然后用样品缓冲液(20mM HEPES(pH7.5)，50mM NaCl，1mM MgCl₂)轻轻洗涤载网3～5次。接下来，将3μL的2％乙酸双氧铀移液到生物活性配体功能化石墨烯薄膜上并使其染色约1分钟。染色后，将网格吸干并风干。对于咪唑洗涤实验，将样品孵育的载网用300mM咪唑溶液洗涤5次，然后用2％乙酸双氧铀负染色。在配备有Gatan US4000 CCD相机的FEI Tecnia Spirit 120电子显微镜下获得负染色显微照片。

利用Vitro bot制作冷冻样品：滴加4微升一定浓度的带有标签的生物大分子(如PNPase)至生物活性配体功能化石墨烯薄膜，在湿度为100％，温度为12℃，吸干压力2.5个单位，吸干时间2s的条件下制作冷冻样品。另外，以～1：1的摩尔比将～5μLHis-标记的20S蛋白酶体与60s核糖前体混合蛋白溶液的液滴移液到石墨烯修饰载网(生物活性配体功能化石墨烯薄膜)及对照组载网上。温育15min后，将载网轻轻洗涤3～5次，然后转移到FEIVitrobot中。制样中，根据上述条件对吸干压力，吸干时间做调整，保证样品无序冰层厚度适宜。待样品制备好后，按照Titan krois上样流程将冷冻样品加入Cassette中，利用Auto-EMation自动收集数据，并详细研究新型石墨烯载网材料对制备样品的冰层厚度、样品分布均一性、取向性、完整性、样品的抗辐照能力、辐照漂移情况等的影响，将中间出现的问题反馈到以上制备过程，并进行修正、完善和优化。根据收集的电镜照片，挑选蛋白质颗粒，构建三维模型，计算获得生物大分子结构解析的分辨率。

冷冻电子断层扫描：冷冻电子断层扫描显微照片是在FEI Titan Krios上获得的，加速电压300千伏，Gatan K2相机，

的剂量率和～总累积剂量

数据采集的放大倍率为64,000×，校准的像素尺寸为

对于每个倾斜系列，倾斜角度从+51°到-51°，步长为3°。所有倾斜系列都是在约-5.0μm的欠焦下获得的。20S蛋白酶体颗粒在冷冻电子断层扫描密度图中的位置主要通过模板匹配方法确定。

2、结果分析

(1)生物活性配体功能化石墨烯薄膜的生物结合活性

首先使用带有His标签的红色荧光蛋白(RFP)通过荧光显微镜验证了生物活性配体功能化石墨烯薄膜的结合能力。

将2mL His标记的红色荧光蛋白以2mg/mL的浓度施加到生物活性配体功能化石墨烯薄膜表面。在室温下与蛋白质溶液温育15min后，用蛋白质缓冲液洗涤生物活性配体功能化石墨烯薄膜表面并在荧光显微镜下表征。在表面上清楚地识别出高密度的红色荧光斑点(图7(b))，表明存在His标记的红色荧光蛋白。为了验证His标记的红色荧光蛋白在生物活性配体功能化石墨烯薄膜表面上的积累是否是特异性的，通过用300mM咪唑洗涤红色荧光蛋白结合的生物活性配体功能化石墨烯薄膜进行对照实验，发现几乎所有的红色信号都被耗尽(图7(c))。在平行实验中，在化学改性步骤中有意省略了Ni离子。缺乏Ni离子完全消除了生物活性配体功能化石墨烯薄膜的结合能力，因此在生物活性配体功能化石墨烯薄膜表面上未检测到红色荧光蛋白信号(图7(a))。为了测试Ni-NTA生物活性配体功能化石墨烯薄膜的亲和力，使用负染色电子显微镜表征它们对His标记的PNPase蛋白的结合能力(图8)。同荧光显微镜表征结果一致，在没有Ni离子的情况下几乎没有蛋白质颗粒被识别出来(图7(d)和体7(g))。当化学修饰过程中存在Ni离子时，生物活性配体功能化石墨烯薄膜可以吸附具有高信噪比的单分散蛋白质颗粒(图7(e)和图7(h))，这些附着的PNPase颗粒在用300mM咪唑洗涤后消失(图7(f)和图7(i))，证实His标记的蛋白质通过Ni-NTA螯合特异性结合生物活性配体功能化石墨烯薄膜。

(2)生物活性配体功能化石墨烯薄膜在冷冻电子显微镜三维重构中的应用

进一步使用His标记的20S蛋白酶体和60s核糖体前体的混合溶液以～1：1的摩尔比进一步表征了用于冷冻电子显微镜样品制备的生物活性配体功能化石墨烯薄膜。

作为对照，还使用无定形碳载网(图9(a))和NTA功能化石墨烯薄膜(在没有Ni离子的情况下)载网(图9(b))来制作冷冻电子显微镜样本。发现生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网(图9(c))有效地降低了背景噪声并保留了比连续无定形碳载网更多的结构细节(图9(a))。生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上的蛋白质颗粒(20S蛋白酶体或60s核糖体前体)在原始显微照片中显示出比在无定形碳涂覆载网上更高的对比度和更低的背景噪声信号。在大致相同的粒子数量前提下，生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上的20S蛋白酶体和60s核糖体前体的二维分类平均比无定形碳载网的二维分类平均拥有更多细节(图9(c)和图9(a)插图)。为了进一步证实生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网对His标记蛋白质的选择性高于未标记蛋白质，对缺少Ni离子的生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网(图9(b))和Ni-NTA修饰的生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网(图9(c))上混合的His标记的20S蛋白酶体和60s核糖体前体样品的图像通过单颗粒冷冻电子显微镜分析进行了分类和计算。实际上，在Ni-NTA修饰的生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上，His-标记的20S蛋白酶体与60s核糖体前体的颗粒比率比NTA修饰的石墨烯膜载网增加了9倍(图9(d))。显然，在载网上仍存在一定量的60s核糖体前体的非特异性吸附。这可能是由于60s核糖体前体中带有大量负电荷的RNA。

接下来在生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上进行His标记的20S蛋白酶体的冷冻电子断层扫描(Cryo-ET)，以进一步表征冷冻标本的特性(图10(c)，图10(d)和图12)。电子断层扫描图清楚地表明，几乎所有20S颗粒都被吸附到生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上同一层中的石墨烯膜上。相比之下，在20S蛋白酶体应用于多孔碳载网(Quantifoil)的对照样本中，大多数蛋白酶体颗粒分布到玻璃冰的上部或底部空气-水界面(图10(a)，图10(b)和图11)。值得注意的是，当由生物活性配体功能化石墨烯薄膜网支撑蛋白时，几乎所有20S蛋白酶体颗粒的方向被认为是侧(矩形)视图(图12)，这与含有由组氨酸标记的β亚基的蛋白酶体的亲和结合策略一致。对于由多孔碳网支撑的颗粒，可以在空气-水界面以及玻璃冰中识别20S蛋白酶体的顶部(环形)和侧面(矩形)视图(图12)，表明His标记的蛋白酶体通过与其表面上的Ni-NTA配体相互作用而特异性结合生物活性配体功能化石墨烯薄膜。总之，这些实验结果表明生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网具有防止目标大分子被吸附到空气-水界面的优点。

在实践中，发现当使用生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网时，制作具有20～0nm最佳冰厚度的冷冻样本是更可控的(图10(d)和图12)，并且这种冰厚度被认为是嵌入大多数蛋白的理想选择并且没有引入额外的背景噪音。与多孔碳膜载网相比，生物活性配体功能化石墨烯薄膜上的玻璃冰更均匀(图10(a))。此外，由于大多数蛋白质颗粒位于同一平面，因此在数据处理期间对诸如生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上的颗粒的衬度传递函数，如颗粒的欠焦值的估计变得更可靠。相反，由多孔碳载网支撑的颗粒被吸附到上部或底部空气-水界面中，导致高度有较大的变化并且使得数据处理尤其是CTF估计更复杂且更不准确。因此，根据完全相同数量(6,095)的粒子图像，生物活性配体功能化石墨烯薄膜上20S蛋白酶体的3D重建的最终分辨率报告为

远高于连续碳膜载网和多孔碳涂层载网上的

和

的最终分辨率。(图13(a))。20S蛋白酶体颗粒的欧拉角分布也显示出一些差异。除侧视图外，连续碳或多孔碳上的一部分颗粒具有其他视图(图13(b))。然而，这些其他视图在生物活性配体功能化石墨烯薄膜上几乎没有得到，提供了另一个证据证明His标记的20S蛋白酶体通过Ni-NTA和His标签的特异性相互作用被捕获到生物活性配体功能化石墨烯薄膜上。在生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网上以

分辨率对His标记的20S蛋白酶体进行3D冷冻电子显微镜重建，足以明确追踪不对称α-和β-亚基的主链骨架并识别一些庞大的侧链(图10(e)-图10(g))。20S蛋白酶体内亚基之间的相互作用界面也可以高精度求解，以确定复合物生物学功能的分子机制(图14)。综上，生物活性配体功能化石墨烯薄膜载网具有捕获带His标签的蛋白的特异性，适合作为原子分辨率的冷冻电子显微镜三维重构的支撑材料。

Claims (5)

1.生物活性配体功能化石墨烯薄膜在冷冻电子显微镜三维重构中的应用；

所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜由生物活性配体连接于石墨烯薄膜上形成，所述生物活性配体为Ni-氨三乙酸配体；

所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜作为或用于制备冷冻电镜的支撑膜；

所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜按照包括如下步骤的方法制备：

1）将石墨烯薄膜转移至电镜载网上；

2）采用高锰酸钾和碱性化合物的混合水溶液处理所述石墨烯薄膜；

采用如下方式处理所述石墨烯薄膜：

将所述混合水溶液滴加至所述石墨烯薄膜上；静置后，采用滤纸吸掉所述混合水溶液，并用亚硫酸氢钠水溶液充分清洗至所述石墨烯薄膜表面无残留处理溶液；

3）采用氨三乙酸活化所述石墨烯薄膜，然后与镍盐反应即得到所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜；

步骤3）之前，所述方法还包括如下改性步骤：

采用1-乙基-3-（3-二甲基-氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺和2-（N-吗啉代）乙磺酸的混合水溶液处理所述石墨烯薄膜；

所述混合水溶液中，所述1-乙基-3-（3-二甲基-氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐的浓度为1~6mM，所述N-羟基-磺基琥珀酰亚胺的浓度为1~6mM，所述2-（N-吗啉代）乙磺酸的浓度为10~200mM。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜特异性捕获带His标签的蛋白或生物大分子。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述蛋白为20S蛋白酶体、60s核糖体前体、PNPase蛋白或荧光蛋白。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：将所述带His标签的蛋白或生物大分子的溶液滴加至所述生物活性配体功能化石墨烯薄膜上，然后在如下条件制作冷冻样品：

湿度为80~100%，温度为4~12℃，吸干时间为0.5~5s。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤2）中，所述碱性化合物为氢氧化钠或氢氧化钾；

所述混合水溶液中，所述高锰酸钾的浓度为0~0.4M，但不为零，所述碱性化合物的浓度为0~0.2M，但不为零；

所述处理的时间为10~60分钟。

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