CN103732533A - 化学修饰的石墨烯 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及石墨烯衍生物，以及包括石墨烯衍生物的相关装置和使用石墨烯衍生物的方法。

Description

化学修饰的石墨烯
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119，本申请要求如下优先权：美国临时申请序列号61/488,011(提交于2011年5月19日)、美国临时申请序列号61/546,740(提交于2011年10月13日)、美国临时申请序列号61/601,691(提交于2012年2月22日)、以及美国临时申请序列号61/601,862(提交于2012年2月22日)。所述母案申请的全文在此以引用方式并入。
关于联邦赞助研究的说明
本发明得到空军科学研究办公室签署的FA9550-10-1-0091号合同的支持。美国政府对于本发明享有一定权利。
技术领域
本发明涉及石墨烯衍生物，以及相关装置和方法。
背景技术
蛋白(例如酶和抗体)通常难以在分离的同时仍然保持其生物学活性。例如，此类生物分子可能需要使用水以外的溶剂来分离，这样的溶剂将使生物分子变性并使分离过程复杂化。然而，对于患者的健康以及法规遵从性而言重要的是，用作药物的蛋白具有高纯度。同样重要的是开发出更有效的高通量纯化方法以降低成本和对环境的影响。
石墨烯是一种单层碳原子，其具有包含六元碳环的二维蜂窝结构，并且是所有其他维度石墨材料基本的结构单元。例如，石墨的晶体薄片形式是由层叠在一起的诸多石墨烯薄片所组成的。因此，有时石墨烯被称为单层石墨。石墨烯的薄片结构使该材料具有独特的电子和光学性质。
发明概述
本发明基于一项意想不到的发现，即相比于常规固定相材料而言，由某些石墨烯衍生物制得的色谱固定相材料在蛋白分离方面表现出了优异的性能。
在一个方面中，本发明涉及包括石墨烯衍生物的材料(例如用于固定相的树脂材料)，所述石墨烯衍生物含有石墨烯核心和第一侧基(pendant group)。所述第一侧基包括金属离子、纳米颗粒、磺酸基团(sulfonate group)、胺基团、季铵基团或螯合基团(chelating group)。
在另一方面中，本发明涉及包括石墨烯衍生物的材料，所述石墨烯衍生物含有石墨烯核心和共价连接至所述石墨烯核心的蛋白(作为侧基)。
在另一方面中，本发明涉及色谱柱，其含有至少一种上述材料。
在另一方面中，本发明涉及包括上述色谱柱的色谱系统。
在另一方面中，本发明涉及一种从样品中分离蛋白的方法。所述方法包括(1)将所述样品置于含有至少一种上述材料的分散体中，从而将所述蛋白结合至所述材料，得到蛋白-结合的材料，(2)分离所述蛋白-结合的材料，和(3)自所述蛋白-结合的材料回收所述蛋白。
在又一方面中，本发明涉及一种制备石墨烯氧化物的方法。所述方法包括(1)将石墨依次与氧化性酸和氧化剂反应，得到氧化的石墨烯；(2)用水性溶剂洗涤所述氧化的石墨烯；和(3)用含有间充物(intercalant)的溶液处理所述氧化的石墨烯，得到石墨烯氧化物。
实施方案可包括一个或多个下述特征。
在一些实施方案中，所述第一侧基可包括金属离子(例如Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ag+、Fe3+、Ga3+、Zr3+、Ca2+或Co2+)。在此类实施方案中，所述第一侧基可包括连接基且所述金属离子与所述连接基结合。所述连接基可包括次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid)部分、三-次氮基三乙酸部分或亚氨基二乙酸部分。在一些实施方案中，所述连接基可通过酰胺基(例如-CO-NH-)共价连接至所述石墨烯核心。在一些实施方案中，所述第一侧基还可包括结合至所述金属离子的His-标记的蛋白(例如His-标记的蛋白A或His-标记的蛋白G)。
在一些实施方案中，所述第一侧基可包括纳米颗粒。在一些实施方案中，所述纳米颗粒可为TiO2或SiO2纳米颗粒。例如，所述SiO2纳米颗粒可通过酰胺基共价连接至所述石墨烯核心。在一些实施方案中，所述SiO2纳米颗粒可通过连接基-CO-NH-R-Si(-O-)3共价连接至所述石墨烯核心，其中R为C1-C20亚烷基。
在一些实施方案中，所述石墨烯衍生物还可包括第二侧基，其含有金属离子或TiO2纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述第一侧基可包括蛋白(例如蛋白A、蛋白G或E72G3蛋白)。所述蛋白可共价连接至所述石墨烯核心。在此类实施方案中，所述材料还可包括共价连接至所述石墨烯核心和所述蛋白的连接基。所述连接基可包括乙酰胺部分、琥珀酰亚胺部分、马来酰亚胺部分或硫代硫酸酯部分(thiosulfate moiety)。
在一些实施方案中，所述第一侧基可包括磺酸基团、胺基团、季铵基团，或螯合基团。例如，所述第一侧基可包括-CO-NH-R-SO3H、-CO-NH-R-N(R’R”R’’’)+、-CO-NH-R-N(R’R”)、-CO-NH-R-SH、-CO-NH-R-COOH、-CO-NH-R-N(CH2COOH)2、-CO-NH-R-NH-R-PO3H或EDTA衍生物，其中各R独立地为C1-C20亚烷基，并且各R’、R”和R’”独立地为H或C1-C20烷基。
在一些实施方案中，所述材料的形式可以是粉末、基于液体的组合物或膜。
在一些实施方案中，通过氨基酸分析测得所述材料的蛋白负载能力为每毫升所述材料至少约60mg(mg/mL)(例如至少约80mg/mL)。
在一些实施方案中，所述柱还可包括与所述材料混合的间隔物。例如，所述间隔物可为氧化物(例如金属氧化物)或聚合物。
在一些实施方案中，可通过离心、过滤或倾析分离所述蛋白-结合的材料。
在一些实施方案中，待分离的蛋白可为His-标记的蛋白(例如His-标记的光系统I核心复合物、His-标记的光系统II核心复合物或His-标记的细菌反应中心)、FLAG-标记的蛋白、HA-标记的蛋白、myc-标记的蛋白、GST-标记的蛋白、MBP-标记的蛋白、凝集素、磷蛋白(例如Fc受体、Ulk抗体、神经钙蛋白、K染色质免疫沉淀物或尿皮质素(urocotin))，或具有Fc区的抗体。
在一些实施方案中，所述氧化性酸为硝酸。
在一些实施方案中，所述氧化剂为氯酸钾。
在一些实施方案中，所述水性溶剂为水。
在一些实施方案中，所述间充物为四丁基氢氧化铵。
在一些实施方案中，所述氧化的石墨烯的处理包括在含有该间充物的溶液中在温度为至少约60℃(例如至少约80℃)加热所述氧化的石墨烯。
实施方案可具有一个或多个下述优势。
不欲拘泥于理论，据信本文所述的石墨烯衍生物(例如含有金属离子或蛋白的石墨烯衍生物)与常规固定相材料相比可具有显著较高的蛋白负载能力。
不欲拘泥于理论，据信本文所述的石墨烯衍生物(例如含有金属离子或蛋白的石墨烯衍生物)可用作色谱方法中的固定相，以有效地从样品中分离蛋白，同时保持所述蛋白的生物活性。相反，尽管常规固定相材料可能能够分离蛋白，但其经常会在分离过程中使蛋白失活。
通过说明书、附图以及权利要求书，本发明的其他特征、目的以及优势将变得更明显。
附图说明
图1为含有金属离子的石墨烯衍生物的一个实施方案。
图2为含有纳米颗粒的石墨烯衍生物的另一个实施方案。
图3为显示了在实施例2所得的PSII CC蛋白的存在或不存在时原始GO和GO-Ni-NTA的流式细胞计强度的图。
图4为显示了实施例4中所得的GO-Ni-NTA和两种市售树脂的PSII CC蛋白负载能力的图。
各附图中相似的引用符号表示类似的要素。
发明详述
总体上，本发明涉及石墨烯衍生物，其含有石墨烯核心以及所述石墨烯核心上的至少一个侧基(例如至少两个侧基、至少五个侧基或至少10个侧基)。所述侧基可包括金属离子、纳米颗粒、蛋白、磺酸基团、胺基团、季铵基团、螯合基团或其组合。在一些实施方案中，侧基可包括一个或多个连接基，该连接基以共价、离子或配位的方式连接至上述基团(例如金属离子或蛋白)。所述连接基可共价连接至所述石墨烯核心(例如通过酰胺基或酯基连接)。在一些实施方案中，所述石墨烯衍生物可具有一个或多个与其他侧基不同的侧基。在一些实施方案中，所述石墨烯衍生物可包括多个石墨烯核心，其通过一个或多个聚合物共价连接(例如交联)。
含有金属离子的石墨烯衍生物
图1显示了含有金属离子的石墨烯衍生物的一个实施方案。具体地，图1中所提及的石墨烯衍生物100包括石墨烯核心102和侧基104。侧基104包括连接基106以及与所述连接基结合的(例如以离子方式或配位方式)金属离子108。
在一些实施方案中，连接基106共价连接(例如通过酰胺基或酯基)至石墨烯核心102。在图1所示的实施方案中，连接基106包括一端的螯合基团(即次氮基三乙酸部分)、另一端的酰胺基，以及螯合基团和酰胺基之间的间隔基(即亚丁基)。通常，所述螯合基团可与金属离子108结合，并因此在所述石墨烯衍生物的表面捕获金属离子108。连接基106中可使用任何能够与金属离子结合的适当的螯合基团。示例性螯合基团包括次氮基三乙酸部分、三-次氮基三乙酸部分或亚氨基二乙酸部分。在一些实施方案中，所述连接基106中的间隔基可为任何适当的C1-C20亚烷基。不欲拘泥于理论，据信在连接基106中包含间隔基能够增加石墨烯衍生物100的蛋白负载能力。
金属离子108通常可用作亲和性配体，通过与在蛋白表面的某些氨基酸残基(例如His、Glu、Asp、Tyr、Cys、Arg、Lys和Met残基)形成复合物(例如通过配位结合)来分离或纯化各种蛋白。示例性金属离子包括Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ag+、Fe3+、Ga3+、Zr3+、Ca2+和Co2+。
通常，待分离蛋白上能够结合金属离子的氨基酸残基可以存在于天然存在的蛋白的氨基酸序列中，或可作为标记物添加至天然存在的蛋白中。示例性的标记蛋白包括His-标记的蛋白、FLAG-标记的蛋白、HA-标记的蛋白、myc-标记的蛋白、GST-标记的蛋白以及MBP-标记的蛋白。例如，含有2-10个邻近His残基(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个His残基)的His标记可引入蛋白的一端(例如N-末端或C-末端)或可到达的内部序列，得到His-标记的蛋白。示例性His-标记的蛋白包括His-标记的光系统I核心复合物、His-标记的光系统II核心复合物、His-标记的细菌反应中心、His-标记的蛋白A，以及His-标记的蛋白G。标记的蛋白的其他实例描述于例如以下文献中：Gaberc-Porekar等人，J.Biochem.Biophys.Methods，49(2001)335-360和Ueda等人，J.Chromatography A，988(2003)1-23。含有能够结合金属离子的氨基酸残基的蛋白可对本文所述石墨烯衍生物具有较强的亲和力。这样，本文所述的石墨烯衍生物可选择性吸附(例如通过配位结合)此类蛋白，并将其与样品中的其他组分(例如其他蛋白)分离开来。
在一些实施方案中，石墨烯衍生物100可包括多个结合至石墨烯核心102的其他官能团。示例性官能团包括通常可见于石墨烯氧化物中的那些基团(例如羧基、羟基和环氧基)，以及通过其他化学修饰来引入至石墨烯氧化物中的那些基团(例如氨基)。
不欲拘泥于理论，据信本文所述的石墨烯衍生物(例如含有金属离子或蛋白的石墨烯衍生物)相比于常规固定相材料可具有显著更高的蛋白负载能力(例如当用于亲和色谱中时)。例如，由叶绿素A测试测得所述石墨烯衍生物的蛋白负载能力可为每毫升所述石墨烯衍生物至少约100mg(mg/mL)(例如至少约200mg/mL、至少约400mg/mL、至少约500mg/mL、至少约1,000mg/mL、至少约2,000mg/mL、至少约4,000mg/mL)和/或至多约10,000mg/mL(例如至多约9,000mg/mL、至多约7,000mg/mL、至多约5,000mg/mL、至多约3,000mg/mL或至多约1,000mg/mL)。作为另一实例，通过氨基酸分析测得所述石墨烯衍生物的蛋白负载能力可为至少约60mg/mL所述石墨烯衍生物(例如至少约80mg/mL、至少约100mg/mL、至少约150mg/mL、至少约200mg/mL、至少约300mg/mL、至少约400mg/mL)和/或至多约500mg/mL(例如至多约350mg/mL、至多约250mg/mL、至多约150mg/mL、至多约110mg/mL或至多约90mg/mL)。相反，由市售蛋白测试试剂盒测得亲和色谱常规固定相材料的蛋白负载能力至多约60mg/mL。
此外，不欲拘泥于理论，据信本文所述的石墨烯衍生物(例如含有金属离子或蛋白的石墨烯衍生物)对于大蛋白(例如分子量为至少约61kDa)或多蛋白复合物(例如光系统I或II核心复合物)可具有较高的蛋白负载能力，同时在使用本文所述的石墨烯衍生物进行蛋白结合或分离的过程中保持其生物活性。相反，据发明人所知，目前市售可得的基于多糖的树脂似乎仅对于小蛋白(例如分子量小于约61kDa)具有相对较高的蛋白负载能力。此外，据发明人所知，从未报道高于61kDa的蛋白以高蛋白负载(例如大于10mg/ml)与任何用于固定化金属亲和色谱(IMAC)的市售树脂结合。不欲拘泥于理论，据信这可能是因为市售的基于多糖的IMAC树脂孔径有限，进而显著降低大蛋白接近多糖基质中金属配位位点的能力。此外，相比于天然条件下的蛋白，市售的基于多糖的IMAC树脂对变性的蛋白似乎能够得到更高的蛋白负载能力，因为变性的蛋白中His-标记能够更好地接近。然而，尽管变性肽链的重折叠可得到有活性的蛋白，但该方法通常限于单个域或不需要陪伴分子(chaperone)和其他折叠辅因子的蛋白，却不适用于大蛋白或多蛋白复合物(例如光系统I或II核心复合物)。不欲拘泥于理论，据信本文所述的石墨烯衍生物对大蛋白(例如分子量至少约61kDa)或四元复合蛋白(complex quaternary proteins)(例如光系统I或II核心复合物)可具有较高蛋白负载能力而不使这些蛋白变性，从而在分离过程中保持其生物活性。
石墨烯衍生物可通过使用石墨烯氧化物作为起始材料制备。石墨烯氧化物可通过本领域已知的方法制备或可为自市售来源购买。作为一个实例，石墨烯氧化物可通过以下制备：用强氧化剂(例如H2SO4、NaNO3和KMnO4的混合物)处理石墨。所述氧化处理通常在剥离型石墨(exfoliated graphite)上形成含氧官能团(例如COOH、OH和环氧基)，得到石墨烯氧化物。石墨烯氧化物的氧含量可为约8摩尔%至约35摩尔%。氧含量可通过用不同浓度的强还原剂(例如肼)并以不同的处理周期处理石墨烯氧化物来调节。作为起始材料，所述石墨烯氧化物的形式可为粉末、基于液体的组合物(其可通过将所述粉末混悬或分散于水性溶剂中来获得，例如其为混悬液或浆液)，或涂布于基底上的膜。通常，所述基底可由任何适当的材料制成，例如塑料、金属(例如金)、金属氧化物、石英、纸或玻璃。
在一些实施方案中，所述石墨烯氧化物可由聚合物(例如聚烯丙胺)交联，得到交联石墨烯氧化物。这样的交联氧化物也可用作起始材料，得到本文所述的石墨烯衍生物。
在一些实施方案中，含有金属离子的石墨烯衍生物可通过以下制备：(1)任选活化混悬于水性溶剂中或作为基底上的膜形式的石墨烯氧化物上的羧基(例如通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)(EDC))，(2)将所述任选活化的石墨烯氧化物与在一端具有螯合基团(例如次氮基三乙酸部分)且在另一端具有能够与羧基或其活化形式反应的基团(例如氨基或羟基)的化合物反应，得到修饰的石墨烯氧化物，以及(3)将所述修饰的石墨烯氧化物与金属盐(例如NiSO4)反应，得到含有金属离子的石墨烯衍生物。当基于液体的组合物形式的石墨烯氧化物用作起始材料时，在上述各反应步骤之后可进行温和的离心和/或过滤，以将各步骤的产物从其反应介质中分离。由此，技术人员可从各反应步骤的产物中移除反应介质中的任何过量反应物。当膜形式的石墨烯氧化物用作起始材料时，上述各反应步骤之后所述膜可经溶剂(例如水)洗涤，以移除膜表面的任何过量反应物。
在一些实施方案中，制备本文所述的石墨烯衍生物所用的石墨烯氧化物可制成对环境稳定的形式。为制备这样的石墨烯氧化物，技术人员可首先将石墨依次与氧化性酸(例如硝酸)和氧化剂(例如氯酸钾)反应，得到氧化的石墨烯；(2)用水性溶剂(例如水)洗涤所述氧化的石墨烯；和(3)用含有间充物(例如四丁基氢氧化铵)的溶液处理所述氧化的石墨烯，得到石墨烯氧化物。石墨与所述氧化性酸和所述氧化剂之间的反应可在室温进行。间充物是指能够进入石墨烯氧化物之间的空间的化学品。在一些实施方案中，用含有间充物的溶液处理所述氧化的石墨烯可在至少约60℃(例如至少约80℃)的温度进行。不欲拘泥于理论，据信用水性溶剂洗涤所述氧化的石墨烯可移除所述氧化性酸、所述氧化剂以及任何可溶于水的完全氧化的石墨烯(其可包含结构缺陷并且因此形成不稳定的石墨烯氧化物)。此外，不欲拘泥于理论，据信由上述方法得到的石墨烯氧化物可具有显著提高的稳定性，因为其含有浓度更低的结构缺陷。特别是，由此形成的含有所述石墨烯氧化物的分散体经数月的时间仍可保持稳定，形成最少的沉淀。
在一些实施方案中，本文所述的石墨烯衍生物的平均粒径(例如粒长或粒宽)可为至少约0.1μm(例如至少约0.5μm、至少约1μm、至少约5μm或至少约10μm)和/或至多约100μm(例如至多约75μm、至多约50μm、至多约25μm或至多约10μm)。在一些实施方案中，本文所述的石墨烯衍生物的平均粒径(例如粒长或粒宽)可为至少约1μm至至少约10μm(例如约5μm)。
在一些实施方案中，本文所述的石墨烯衍生物可具有较大的平均纵横比(例如长度与厚度之比，或宽度与厚度之比)。例如，所述石墨烯氧化物的平均纵横比可为至少约50(例如至少约100或至少200)和/或至多约500(例如至多约400或至多约300)。
通常，在分离技术中，本文所述的石墨烯衍生物(例如含有金属离子或蛋白的石墨烯衍生物)可用作固定相。所述分离技术包括柱色谱或批色谱(batchchromatography)。
在柱色谱的实施方案中，技术人员可通过以下来分离样品中的感兴趣蛋白：首先使所述样品通过柱(例如金属柱或玻璃柱)中选择性结合至所述蛋白的固定相，使得所述蛋白被吸附到固定相上，同时所述样品中的其他组分通过该固定相。随后，技术人员可用能够使所述感兴趣蛋白从固定相解吸附的洗脱液洗脱，以收集所述蛋白。柱色谱的实例包括高效液相色谱，超高效液相色谱，膨胀床吸附色谱和快速蛋白液相色谱。
在批色谱的实施方案中，技术人员可通过以下来分离样品中的感兴趣的蛋白：首先将所述样品在容器(例如烧杯)中混合于含有选择性结合至所述蛋白的固定相和溶剂(例如水性溶剂)的分散体或混悬液中，使得所述蛋白被吸附到固定相上。然后，通过适当的分离方法，例如离心、过滤或倾析，所述蛋白-结合的固定相可与所述样品的其他组分分离。所分离的固定相可接着经能够使所述感兴趣蛋白从固定相解吸附的洗脱液洗涤，以回收所述蛋白。不欲拘泥于理论，据信本文所述的石墨烯衍生物可在色谱方法中用作固定相，以有效地从样品中分离蛋白，同时保持所述蛋白的生物活性。相反，尽管常规固定相材料可能能够分离蛋白，但它通常在分离过程中使所述蛋白失活。
通常，取决于本文所述的石墨烯衍生物中存在的侧基，所述石墨烯衍生物可在基于不同分离机理的色谱方法中用作固定相，所述色谱例如尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱或亲和色谱(例如固定化金属亲和色谱(IMAC))。
在一些实施方案中，上述含有金属离子的石墨烯衍生物可用作IMAC中的固定相，以分离或纯化标记的蛋白。
例如，石墨烯衍生物100可用作固定相材料，以在批次IMAC中从样品中分离His-标记的蛋白(例如His-标记的光系统II核心复合物)，其通过使用以下方法达成：技术人员可首先将所述样品与容器(例如烧杯)中的含有石墨烯衍生物100(其分散于溶剂例如水中)的分散体或混悬液混合，使得通过在所述金属离子(即Ni2+)和所述蛋白中的His标记之间形成络合物(例如通过配位结合)而使His-标记的蛋白被吸附至石墨烯衍生物100上。所述蛋白-结合的石墨烯衍生物可接着通过适当的分离方法(例如离心、过滤或倾析)与所述样品中的其他组分分离。所分离的石墨烯衍生物可接着经能够使His-标记的蛋白从所述蛋白-结合的石墨烯衍生物解吸附的洗脱液(例如含有咪唑或具有适当的pH(例如约3至约13)的洗脱液)洗涤，以回收所述蛋白。
作为另一实例，石墨烯衍生物100可用作固定相材料，以在IMAC柱中使His-标记的蛋白从样品中分离，其通过使用以下方法达成：技术人员可首先使所述样品通过柱(例如金属、玻璃或塑料柱)中的石墨烯衍生物100，使得通过在所述金属离子(即Ni2+)和所述蛋白中的His标记之间形成络合物(例如通过配位结合)而使所述蛋白被吸附至石墨烯衍生物100上。所述样品中的其他未被吸附至石墨烯衍生物100上的组分可被洗脱至柱外。随后，技术人员可用能够使His-标记的蛋白从蛋白-结合的石墨烯衍生物解吸附的洗脱液(例如含有咪唑或具有适当pH的洗脱液)进行洗脱，以收集His-标记的蛋白。
通过使用适当的固定相材料(例如含有适当的金属离子的石墨烯衍生物)和适当的洗脱液，可以以类似上述的方式将其他的标记蛋白分离。
含有纳米颗粒的石墨烯衍生物
图2例示了含有纳米颗粒的石墨烯衍生物的一个实施方案。具体地，如图2中所提及，石墨烯衍生物200包括石墨烯核心202和侧基204。侧基204包括连接基206和连接至所述连接基的纳米颗粒208(例如通过共价键合)。在一些实施方案中，连接基206可为通过氧化制备石墨烯氧化物之后在石墨烯氧化物上形成的官能团(例如羧基)。在一些实施方案中，连接基206可包括间隔基(例如C1-C20亚烷基)。纳米颗粒208的实例包括氧化物纳米颗粒(例如SiO2纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒例如TiO2纳米颗粒)。
在一些实施方案中，含有纳米颗粒的石墨烯衍生物可通过以下制备：(1)在溶剂中形成纳米颗粒，和(2)将所述纳米颗粒与石墨烯氧化物反应(通过使用其表面上的天然羧基或由表面上其他含氧基团的化学官能团化所形成的羧基)，得到含有纳米颗粒的石墨烯衍生物。作为起始材料，所述石墨烯氧化物的形式可为粉末、基于液体的组合物(例如混悬液或浆液)或膜。在所述含有纳米颗粒的石墨烯衍生物形成之后，可通过上述方法移除过量反应物。
例如，含有TiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物可通过以下制备：(1)通过将TiO2前体(例如钛盐，例如四异丙醇钛)分散于溶剂(例如无水醇)中形成TiO2纳米颗粒，和(2)将所述TiO2纳米颗粒与石墨烯氧化物上的羧基反应，得到含有TiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物。
作为另一实例，含有SiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物可通过以下制备：(1)将SiO2纳米颗粒(例如二氧化硅纳米颗粒)与氨基官能团化的硅烷反应，得到氨基官能团化的SiO2纳米颗粒，和(2)将氨基官能团化的SiO2纳米颗粒与石墨烯氧化物(其含有羧基)反应，得到含有SiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物。在一些实施方案中，所述氨基官能团化的硅烷可具有式NH2-R-Si(OR’)3，其中R为C1-C20亚烷基且R’为H或C1-C20烷基。这样的硅烷的实例为氨基丙基三乙氧基硅烷。在此类实施方案中，所述SiO2纳米颗粒通过酰胺基键合至石墨烯核心202。在此类实施方案中，连接基206可具有式-CO-NH-R-Si(-O-)3，其中R如前面所定义。
通常，在本文所述的分离技术(例如批色谱或柱色谱)中，含有纳米颗粒的石墨烯衍生物可用作固定相以分离或纯化某些蛋白。在一些实施方案中，含有TiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物可用于分离或纯化磷蛋白，因为TiO2纳米颗粒和磷蛋白之间具有高结合亲和性。磷蛋白包括含有与氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)发生酯化的磷酸酯基团的那些。示例性磷蛋白包括Fc受体、Ulk抗体、神经钙蛋白、K染色质免疫沉淀物或尿皮质素。
例如，石墨烯衍生物200可用作固定相材料以在批次柱色谱中从样品中分离磷蛋白，其通过使用以下方法达成：技术人员可首先在容器(例如烧杯)中将所述样品与含有石墨烯衍生物200(其分散于溶剂中，例如水中)的分散体或混悬液混合，使得磷蛋白通过磷蛋白和TiO2纳米颗粒之间的结合而被吸附至石墨烯衍生物200上。所述蛋白-结合的石墨烯衍生物可接着通过适当的分离方法(例如离心、过滤或倾析)与所述样品中的其他组分分离。所分离的石墨烯衍生物可接着经能够使磷蛋白自所述蛋白-结合的石墨烯衍生物解吸附的洗脱液(例如磷酸盐缓冲盐水溶液)洗涤，以回收磷蛋白。
作为另一实例，石墨烯衍生物200可用作固定相材料，以在柱色谱中从样品中分离磷蛋白，其通过使用以下方法达成：技术人员可首先使所述样品通过柱(例如金属或玻璃柱)中的石墨烯衍生物200，使得磷蛋白通过磷蛋白和TiO2纳米颗粒之间的结合而被吸附至石墨烯衍生物200上。所述样品中的其他不吸附于石墨烯衍生物200上的组分可从柱中洗脱出。随后，技术人员可用能够使磷蛋白自所述蛋白-结合的石墨烯衍生物解吸附的洗脱液(例如磷酸盐缓冲盐水溶液)洗脱，以收集所述磷蛋白。
通过使用适当的固定相材料(例如含有适当的纳米颗粒的石墨烯衍生物)和适当的洗脱液，可按类似于上述的方法分离其他磷蛋白。
在一些实施方案中，含有SiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物可用作反相固定相材料。例如，此类石墨烯衍生物可与烷基胺反应，得到具有高度疏水性表面的材料，其适用于反相色谱。不欲拘泥于理论，据信相比于基于常规二氧化硅的材料制成的反相固定相材料，由含有SiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物制成的反相固定相材料将显著地吸附所述样品。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法(例如通过将所述石墨烯核心上的至少一部分剩余的羧基与TiO2纳米颗粒反应)，含有SiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物可进一步修饰为包括另一类型的纳米颗粒(例如TiO2纳米颗粒)，得到含有两种不同类型的纳米颗粒的石墨烯衍生物。在此类实施方案中，所述石墨烯衍生物含有两种不同侧基，一种含有有SiO2纳米颗粒，另一种含有TiO2纳米颗粒。这样的石墨烯衍生物可用于分离或纯化磷蛋白。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法(例如通过将所述石墨烯核心上至少一部分剩余的羧基先后与具有次氮基三乙酸部分的化合物和金属盐例如NiSO4反应)，含有SiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物可进一步修饰为包括金属离子(例如Ni2+)，得到含有纳米颗粒和金属离子的石墨烯衍生物。这样的石墨烯衍生物可用于分离或纯化标记的蛋白(例如His-标记的蛋白)。
不欲拘泥于理论，据信当用于柱色谱中时，相比于无任何SiO2纳米颗粒的石墨烯衍生物，含有SiO2纳米颗粒和另一类型的纳米颗粒或金属离子的石墨烯衍生物可对洗脱液具有改善的透过性。
含有蛋白的石墨烯衍生物
在一些实施方案中，本文所述的石墨烯衍生物可在所述侧基中(例如在如上所述的侧基104或204中)包括蛋白。所述蛋白可共价连接至所述石墨烯核心。这样的蛋白的实例包括蛋白A、蛋白G、E72G3蛋白或它们的衍生物。这样的石墨烯衍生物可用于分离或纯化抗体。
在一些实施方案中，所述石墨烯衍生物可在所述石墨烯核心和所述蛋白之间包括连接基。所述连接基可共价连接至所述石墨烯核心和共价连接至所述蛋白。在一些实施方案中，所述连接基可为酰胺基(例如-CO-NH-)。在其他实施方案中，所述连接基可包括例如以下的官能团：乙酰胺部分(例如碘乙酰胺或溴乙酰胺部分)、琥珀酰亚胺部分(例如N-羟基琥珀酰亚胺部分)、马来酰亚胺部分(例如N-羟基琥珀酰亚胺部分)或硫代硫酸酯部分，或与金属离子(例如如上所述的金属离子)结合的螯合基团。例如，当所述石墨烯衍生物在侧基中包括碘乙酰胺部分时，可通过将所述碘基与所述蛋白中半胱氨酸残基中的巯基反应使适当的蛋白(例如对抗体具有结合亲和性的蛋白)共价连接至所述连接基。在一些实施方案中，所述连接基可包括间隔基(例如C1-C20亚烷基)。
通常，含有蛋白的石墨烯衍生物可通过本文所述的方法或本领域已知的方法制备。例如，含有蛋白A的石墨烯衍生物可通过以下制备：将上述含有金属离子(例如Ni2+或Co2+)的石墨烯衍生物(例如作为分散体或膜)与His-标记的蛋白A混合，使得所述His-标记的蛋白A结合于所述金属离子。作为另一实例，含有蛋白A的石墨烯衍生物可通过以下制备：(1)任选活化分散于水性溶剂中或为膜形式的石墨烯氧化物上的羧基(例如通过使用NHS和EDC来活化)，(2)将所述任选活化的石墨烯氧化物与蛋白A上的伯胺基团反应，以使蛋白A通过酰胺基(例如-CO-NH-)共价结合至所述石墨烯核心。作为另一实例，含有蛋白(例如蛋白A)的石墨烯衍生物可通过以下制备：(1)用异氰酸4-(马来酰亚胺基)苯基酯或异氰酸4-(氯甲基)苯基酯化合物处理石墨烯氧化物，以使所述石墨烯氧化物表面上的羟基与分子末端的异氰酸苯基酯反应，和(2)将由此形成的石墨烯衍生物中马来酰亚胺部分与所述蛋白中的巯基(例如所述蛋白中半胱氨酸残基中的巯基)反应，得到含有共价连接的蛋白的石墨烯衍生物。
通常，含有蛋白的石墨烯衍生物可用作在本文所述的分离技术(例如批色谱或柱色谱)中的固定相。例如，含有蛋白A的石墨烯衍生物可用作免疫亲和色谱(无论其为批色谱还是柱色谱)中的固定相，通过使蛋白A和抗体的Fc区之间发生结合来分离或纯化抗体。不欲拘泥于理论，相比于常规蛋白A固定相材料，据信所述含有蛋白A的石墨烯衍生物可具有显著更高的抗体负载能力。
例如，含有蛋白的石墨烯衍生物可用作固定相材料，以在批次免疫亲和色谱中从样品中分离抗体，其通过使用以下方法达成：技术人员可首先在容器(例如烧杯)中将所述样品与分散体或混悬液混合，在该分散体或混悬液中，含有蛋白的石墨烯衍生物分散于溶剂(例如水)中，使得通过抗体和所述石墨烯衍生物上的蛋白之间的结合，使感兴趣的抗体被吸附于所述石墨烯衍生物上。通过适当的分离方法(例如离心、过滤或倾析)，所述抗体-结合的石墨烯衍生物可接着与所述样品中的其他组分分离。所分离的石墨烯衍生物可接着经能够使所述抗体从抗体-结合的石墨烯衍生物解吸附的洗脱液(例如含有EDTA和甘油和pH为约8的缓冲溶液)洗脱，从而回收抗体。
作为另一实例，含有蛋白的石墨烯衍生物可用作固定相材料，以在免疫亲和柱色谱中从样品中分离抗体，其通过使用以下方法达成：技术人员可首先使所述样品通过柱(例如金属或玻璃柱)中的石墨烯衍生物，使得通过抗体和所述石墨烯衍生物上的蛋白之间的结合，使抗体被吸附于所述石墨烯衍生物上。所述样品中的其他不被吸附到所述石墨烯衍生物上的组分可从柱中洗脱出。随后，技术人员可用能够使所述抗体从抗体-结合的石墨烯衍生物解吸附的洗脱液(例如含有EDTA和甘油和pH为约8的缓冲溶液)洗脱，从而收集所述抗体。
含有官能团的石墨烯衍生物
在一些实施方案中，本文所述的石墨烯衍生物可在侧基(例如如上所述的侧基104或204)中包括官能团。示例性官能团包括磺酸基团、胺基团、季铵基团或螯合基团。例如，所述侧基可包括-CO-NH-R-SO3H、-CO-NH-R-N(R’R”R’’’)+、-CO-NH-R-N(R’R”)、-CO-NH-R-SH、-CO-NH-R-COOH、-CO-NH-R-N(CH2COOH)2、-CO-NH-R-NH-R-PO3H或EDTA衍生物，其中各R独立地为C1-C20亚烷基，并且各R’、R”和R”’独立地为H或C1-C20烷基。
通常，含有官能团的石墨烯衍生物可通过本文所述的方法或本领域已知的方法制备。例如，含有磺酸基团的石墨烯衍生物可通过以下制备：将分散于水性溶剂中或形式为膜的石墨烯氧化物(其含有羧基)与含有伯胺基团和磺酸基团两者的化合物反应，使得所述化合物通过酰胺基共价连接至所述石墨烯核心。作为另一实例，含有EDTA衍生物(即螯合基团)的石墨烯衍生物可通过以下制备：将EDTA与引入到所述石墨烯核心上的氨基反应，或将EDTA基团(EDTA radical)与引入到所述石墨烯核心上的乙烯基反应。所述氨基可例如通过以下方法引入到所述石墨烯核心上：(1)将乙二胺与石墨烯氧化物上的羧基反应，得到含有-(CO)-NH-CH2CH2-NH2基团的石墨烯衍生物，或(2)将磺酰氯与石墨烯氧化物上的羧基反应，得到含有-C(O)Cl基团的石墨烯氧化物，然后将由此形成的石墨烯氧化物与乙二胺反应，得到含有-(CO)-NH-CH2CH2-NH2基团的石墨烯衍生物。随后，可将由此形成的含有氨基的石墨烯衍生物与EDTA上的羧基反应，得到含有EDTA部分的石墨烯衍生物。上述乙烯基可例如通过以下方法引入到所述石墨烯核心上：将含有乙烯基和氨基的化合物与所述石墨烯核心上的羧基反应。EDTA基团可例如通过以下方法形成：将EDTA钠盐与Ce(IV)盐反应，得到EDTA基团
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随后，可将由此形成的含有乙烯基的石墨烯衍生物与上述EDTA基团反应，得到含有EDTA部分的石墨烯衍生物。含有上述其他官能团的石墨烯衍生物可通过类似方法制备。
通常，在本文所述的分离技术中(例如批色谱或柱色谱)中，含有官能团的石墨烯衍生物可用作固定相。例如，此类石墨烯衍生物可用作离子交换色谱的固定相。在一些实施方案中，含有天然羧基(即无其他化学修饰)的石墨烯氧化物也可用作离子交换色谱的固定相。
尽管已公开了具体实施方案，但其他实施方案也是可能的。
在一些实施方案中，当本文所述的石墨烯衍生物用作柱色谱中的固定相时，所述固定相还可包括与所述石墨烯衍生物混合的间隔物(例如惰性间隔物)。适当的间隔物的实例包括氧化物(例如金属氧化物或过渡金属氧化物)和聚合物。间隔物的实例是二氧化硅(例如SiO2颗粒或纳米颗粒)。不欲拘泥于理论，据信，由于本文所述的石墨烯衍生物可具有高纵横比，其在用作柱中的固定相之时可紧密填充，因此流动相不能透过(特别是当流动相在大气压下通过该柱洗脱时)。相比于不含此类间隔物的固定相，当固定相中包括间隔物时，可以使之透过性更好。
本文所引用的所有公开出版物的内容(例如专利、专利申请公开物和论文)，在此整体引用并作参考。
以下实施例是例示性的，并且不欲起到限制作用。
实施例1：含有镍离子的石墨烯衍生物的制备
含有镍离子的石墨烯衍生物的如下制备：起始材料为含有石墨烯氧化物(GO)的混悬液，所述石墨烯氧化物的氧含量为8摩尔%至35摩尔%，由Rutgers大学的纳米材料和装置研究组提供。所有的制备过程均在室温进行。具体地，使用含有10mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10mM的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(两者相对于GO上的羧基而言均为过量)的10mL溶液，将含有15-20体积%GO的10mL浆液处理1小时。接着在21,000×g使混悬液离心5分钟，然后用超纯水洗涤沉淀，得到含有活化的羧基的石墨烯衍生物。然后用过量(10mL)的150mM的Na,Na-双(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物(pH=9.8)溶液处理所述经洗涤的沉淀1小时。再次在21,000×g使混悬液离心5分钟，然后用超纯水洗涤沉淀得到含有次氮基三乙酸部分的石墨烯衍生物。所述经洗涤的沉淀随后用过量(10mL)的100mM的NiSO4溶液处理，得到含有镍离子的石墨烯衍生物(即GO-Ni-NTA)。所得树脂以湿沉淀的形式储存于4℃，以备进一步使用。
通过EPR光谱确定，涉及Na,Na-双(羧基甲基)-L-赖氨酸(pH9.8)的反应步骤出人意料地使GO上的羧基基团增加，超过了Na,Na-双(羧基甲基)-L-赖氨酸和起始GO上存在的羧基之间的反应所能形成的羧基水平。不欲拘泥于理论，据信这是因为Na,Na-双(羧基甲基)-L-赖氨酸与起始GO表面上的环氧基之间的直接反应。因此，GO表面可形成另外的Ni-NTA官能团。
实施例2：在混悬液中，PSII核心复合物固定于GO-Ni-NTA IMAC树脂 上
通过标准方案自嗜热蓝细菌嗜热细长聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)分离在蛋白域CP47上经His-标记的光系统II核心复合物(PSII CC)蛋白。所述PSII CC蛋白为二聚体蛋白，其物理尺寸为20.5nm(L)×11.0nm(W)×10.5nm(D)，且分子量为680kDa。所述His-标记的PSII CC蛋白在含有GO-Ni-NTA树脂(在实施例1中制备)的混悬液中培养20至60分钟。
使用流式细胞仪验证PSII CC蛋白对该树脂的配位，并测量该树脂的蛋白负载能力。使用488nm的询问激光(interrogating laser)，流式细胞仪允许实时和同时在692nm测量荧光(包括边缘散射(SSC)和前向散射(FSC))。在鞘液的存在下，个别颗粒经历流体动力学聚集。SSC和FSC与颗粒的大小成比例，取决于该颗粒相对询问激光的取向。已显示在所得牛顿流体的存在下，混悬液中的石墨烯衍生物颗粒趋于自我排列。流式细胞仪系统地检测个别石墨烯衍生物颗粒，揭示了典型的二维结构的高纵横比。PSII CC蛋白分子和GO-Ni-NTA颗粒之间的相互作用通过荧光对比SSC的分析来揭示。
具体地，将流式细胞仪用于测量四个样品的荧光强度，即(1)未经修饰的GO颗粒，(2)GO-Ni-NTA颗粒，(3)在上述PSII CC蛋白存在时未修饰的GO颗粒，和(4)在上述PSII CC蛋白存在时的GO-Ni-NTA颗粒。结果总结于图3中。如图3所示，未修饰的GO颗粒的荧光强度低于在PSII CC蛋白存在时未修饰的GO颗粒的荧光强度。不欲拘泥于理论，据信在PSII CC蛋白的存在时未修饰的GO颗粒的荧光及其SSC之间有中等水平的相关性，这可能是因为PSII CC蛋白分子和两性未修饰的GO颗粒之间的非特异性疏水和/或亲水相互作用。类似的，GO-Ni-NTA颗粒的荧光强度小于在PSII CC蛋白存在时的GO-Ni-NTA颗粒的荧光强度。不欲拘泥于理论，据信所述His-标记的PSII CC蛋白与GO-Ni-NTA颗粒上Ni-NTA基团中的镍离子配位。GO-Ni-NTA-PSII的荧光及其SSC之间的高水平的线性相关表明GO-Ni-NTA颗粒上的蛋白负载增加。
实施例1所得GO-Ni-NTA颗粒的蛋白负载能力如下测量：通过1比10稀释GO-Ni-NTA浆液(具有的GO-Ni-NTA体积分数为15-20%)制备GO-Ni-NTA颗粒混悬液(溶液A)。稀释缓冲液含有20mM的MES、10mM的MgCl2、10mM的CaCl2和0.03%(w/v)的β-十二烷基麦芽苷。PSII CC储备溶液的蛋白浓度通过两种独立的方法测定，即(1)叶绿素A(Chl A)测试和(2)氨基酸分析。使用上述相同缓冲液将PSII CC储备混悬液(0.93mg的Chl A/mL或2.5646mg蛋白/mL)以1比10稀释，得到溶液B。将5μL的溶液A加入递增体积的(0至32μL)的溶液B。各情况下，添加总体积至多450μL的上述缓冲液。培养各混合物1小时后，在室温将各混合物在21,000×g离心5分钟。在1mL的上述缓冲液中洗涤所述沉淀，然后在室温在21,000×g离心5分钟。所述洗涤和离心重复三次。由此形成的沉淀重新混悬于上述缓冲液中，直到得到体积为450μL的混悬液。通过流式细胞仪探测各混悬液。结果表明在692nm颗粒的荧光强度自始即增加，然后达到特定的最大值，说明PSII CC蛋白分子附着于GO-Ni-NTA颗粒上，达到最大的蛋白负载。实施例1所得的GO-Ni-NTA颗粒的蛋白负载被确定为：基于Chl A测试，每毫升的GO-Ni-NTA颗粒约为410-552mg的PSII CC蛋白，或基于氨基酸分析，每毫升的GO-Ni-NTA颗粒为82-109mg的PSII CC蛋白。认为Chl A测试和所述氨基酸分析之间的偏差是由于Chl A测试的精度较低所致。相反，本领域已知的最高蛋白负载能力(例如Thermo Scientific的市售产品HISPUR Ni-NTA树脂所展示的负载能力)为：每毫升所述树脂60mg的His-标记的蛋白。
GO-Ni-NTA树脂显示能够非常有效地稳定PSII CC蛋白。为了评估这种稳定性的增强，在室温的水性缓冲液(20mM的MES、10mM的MgCl2、10mM的CaCl2和0.03%(w/v)的β-十二烷基麦芽苷)中监测了附着于GO-Ni-NTA的PSII CC蛋白的光化学量子产率(Fv/Fm)。25和37分钟之后，Fv/Fm值分别为0.250和0.264。这些结果表明在测量期间没有可检测到的PSII CC蛋白失活发生，而在相同条件下，在相同水性缓冲液中，分离的PSII CC蛋白通常失活。换言之，这些结果表明所述PSII CC蛋白与GO-Ni-NTA树脂相容，并能明显通过它得到稳定。这种稳定效果有利于将生物学活性蛋白(例如PSII CC蛋白)色谱分离的目的。
上述方法可用于PSII CC以外的其他蛋白。特别是，使用绿色荧光蛋白衍生物(例如mCherry荧光蛋白、mOrange荧光蛋白和二聚的tdTomato荧光蛋白)得到类似结果。这些蛋白在整个色谱分离操作中表现出荧光光谱的保持，表明在分离之后保留了蛋白的折叠结构。
实施例3：PSI核心复合物蛋白固定于GO-Ni-NTA薄膜上
使用Ni-NTA基团的官能团化直接在1cm2镀金硅载体(其进一步经氧含量为8-35wt%的GO涂布)(即Si-Au-GO载体)的顶部进行。在室温进行表面处理过程。具体地，用过量(3mL)的10mM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10mM的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液处理所述Si-Au-GO载体1小时，以活化所述GO上的羧基。在用超纯水洗涤活化的Si-Au-GO载体三次之后，用过量(3mL)的150mM的Na,Na-双(羧基甲基)-L-赖氨酸水合物(pH=9.8)溶液将其处理1小时。用超纯水洗涤由此得到的Si-Au-GO载体三次，得到含有GO的载体，所述GO具有次氮基三乙酸部分。然后用过量(3mL)的100mM的NiSO4溶液处理所述经洗涤的载体，得到含有GO的载体，所述GO具有镍离子。在不同步骤中，官能团化通过FT-IR衰减全反射光谱(FT-IRAttenuated Total Reflectance spectroscopy)来确认。所得Ni2+-NTA-涂布的载体(Si-Au-GO-Ni-NTA)立即用于蛋白分离。
自聚球藻(Synechococcus sp.)7002通过标准操作分离PSI CC蛋白。源自聚球藻7002的PSI CC蛋白的结构类似于源自细长聚球藻的PSI CC蛋白的结构，后者的结构已在原子水平上通过X射线晶体学得以解析。由此得到的PSICC蛋白具有三聚体结构。该圆柱状三聚体的直径约为22nm，高度约为10nm。通过原子力显微术来确定PSI CC蛋白附着于GO-Ni-NTA颗粒。在Au基底的表面上所检测到的特征似乎为三聚体的二聚体。
实施例4：GO-Ni-NTA和两种市售树脂之间蛋白负载能力的对比
按以下操作，使用PSII CC蛋白测量实施例1所制备的GO-Ni-NTA树脂和两种市售树脂(即Life Technologies Probond Ni-NTA树脂和Qiagen Ni-NTA树脂)的蛋白负载能力：使用1.5μL份的GO-Ni-NTA树脂和5μL份的市售树脂获得蛋白负载能力。所述树脂的PSII CC蛋白负载能力通过UV-可见光谱使用NanoDrop1000分光光度计在680nm间接测量。用所述树脂处理前后和经咪唑洗脱之后从PSII CC蛋白溶液收集UV-可见光谱。蛋白样品以分批的方式用各树脂在4℃在rotisserie上培养1小时。在40mM的MES pH6.5缓冲液中进行培养，该缓冲液中补充有15mM的MgCl2、15mM的CaCl2、20%甘油和1M甜菜碱。蛋白-树脂样品在4℃以21,000×g旋转5分钟。然后将所述负载蛋白的树脂进行洗涤和洗脱的步骤。各步骤后将蛋白样品在4℃以21,000×g旋转5分钟。洗脱之前，树脂用480uL的前述缓冲液洗涤。在冰上(对于GO-Ni-NTA树脂)或在rotisserie上在4℃(对于两种市售树脂)使用150mM的MES pH6.5缓冲液进行洗脱，所述缓冲液补充有15mM的MgCl2、15mM的CaCl2、200mM的NaCl、0.1%(w/v)十二烷基麦芽苷、300mM咪唑、10%(w/v)甘油和1M甜菜碱。
上述测试的结果总结于图4中，其显示的蛋白负载能力基于以下计算：在使用各树脂培养前后的上清液中剩余的蛋白的量的差异，以及用咪唑洗脱之后从所述树脂回收的蛋白的量。如图4所示，在相同的纯化条件下，该GO-Ni-NTA树脂出人意料地显示了其PSII CC蛋白负载能力为所测试的两种市售树脂的蛋白负载能力的5-10倍。
其他实施方案涵盖于权利要求书的范围之内。

Claims (44)

1.一种材料，其包含：
石墨烯衍生物，该石墨烯衍生物包含石墨烯核心和第一侧基，所述第一侧基包含金属离子、纳米颗粒、磺酸基团、胺基团、季铵基团或螯合基团。
2.权利要求1的材料，其中所述第一侧基包含金属离子。
3.权利要求2的材料，其中所述第一侧基包含连接基且所述金属离子与所述连接基结合。
4.权利要求3的材料，其中所述连接基包括次氮基三乙酸部分、三次氮基三乙酸部分或亚氨基二乙酸部分。
5.权利要求3的材料，其中所述连接基通过酰胺基共价连接至所述石墨烯核心。
6.权利要求3的材料，其中所述第一侧基还包含连接至所述金属离子的His-标记的蛋白。
7.权利要求6的材料，其中所述His-标记的蛋白为His-标记的蛋白A或His-标记的蛋白G。
8.权利要求2的材料，其中所述金属离子为Ni2+、Cu2+、Zn2+、Ag+、Fe3+、Ga3+、Zr3+、Ca2+或Co2+。
9.权利要求1的材料，其中所述第一侧基包含纳米颗粒。
10.权利要求9的材料，其中所述纳米颗粒为TiO2纳米颗粒。
11.权利要求9的材料，其中所述纳米颗粒为SiO2纳米颗粒。
12.权利要求11的材料，其中所述SiO2纳米颗粒通过酰胺基共价连接至所述石墨烯核心。
13.权利要求12的材料，其中所述SiO2纳米颗粒通过连接基-CO-NH-R-Si(-O-)3共价连接至所述石墨烯核心，其中R为C1-C20亚烷基。
14.权利要求11的材料，其中所述石墨烯衍生物还包含第二侧基，所述第二侧基包含金属离子或TiO2纳米颗粒。
15.权利要求1的材料，其中所述第一侧基包含磺酸基团、胺基团、季铵基团或螯合基团。
16.权利要求15的材料，其中所述第一侧基包含-CO-NH-R-SO3H、-CO-NH-R-N(R’R”R’’’)+、-CO-NH-R-N(R’R”)、-CO-NH-R-SH、-CO-NH-R-COOH、-CO-NH-R-N(CH2COOH)2、-CO-NH-R-NH-R-PO3H或EDTA衍生物，其中各R独立地为C1-C20亚烷基，并且各R’、R”和R’”独立地为H或C1-C20烷基。
17.权利要求1的材料，其中所述材料的形式为粉末、基于液体的组合物或膜。
18.权利要求1的材料，其中通过氨基酸分析测得所述材料的蛋白负载能力为每毫升所述材料至少约60mg。
19.权利要求1的材料，其中通过氨基酸分析测得所述材料的蛋白负载能力为每毫升所述材料至少约80mg。
20.一种材料，其包含：
石墨烯衍生物，该石墨烯衍生物包含石墨烯核心和共价连接至所述石墨烯核心的蛋白。
21.权利要求20的材料，其中所述蛋白为蛋白A、蛋白G或E72G3蛋白。
22.权利要求20的材料，其还包含共价连接至所述石墨烯核心和所述蛋白的连接基。
23.权利要求22的材料，其中所述连接基包括乙酰胺部分、琥珀酰亚胺部分、马来酰亚胺部分或硫代硫酸酯部分。
24.一种色谱柱，其包含权利要求1-23中任一项的材料。
25.权利要求24的色谱柱，其中所述柱还包含与所述材料混合的间隔物。
26.权利要求25的柱，其中所述间隔物为氧化物或聚合物。
27.一种色谱系统，其包含权利要求24-26中任一项的色谱柱。
28.一种从样品中分离蛋白的方法，其包括：
将所述样品置于包含权利要求1-23中任一项的材料的分散体中，从而将所述蛋白结合至所述材料，得到蛋白-结合的材料；
分离所述蛋白-结合的材料；且
自所述蛋白-结合的材料回收所述蛋白。
29.权利要求28的方法，其中通过离心、过滤或倾析来分离所述蛋白-结合的材料。
30.权利要求28的方法，其中所述第一侧基包含金属离子。
31.权利要求30的方法，其中所述蛋白为His-标记的蛋白、FLAG-标记的蛋白、HA-标记的蛋白、myc-标记的蛋白、GST-标记的蛋白、MBP-标记的蛋白或凝集素。
32.权利要求31的方法，其中所述His-标记的蛋白为His-标记的光系统I核心复合物、His-标记的光系统II核心复合物或His-标记的细菌反应中心。
33.权利要求28的方法，其中所述第一侧基包含TiO2纳米颗粒。
34.权利要求33的方法，其中所述蛋白为磷蛋白。
35.权利要求34的方法，其中所述磷蛋白为Fc受体、Ulk抗体、神经钙蛋白、K染色质免疫沉淀物或尿皮质素。
36.权利要求28的方法，其中所述第一侧基包含蛋白。
37.权利要求36的方法，其中所述第一侧基中的蛋白包括蛋白A、蛋白G或E72G3蛋白。
38.权利要求37的方法，其中所述样品中的蛋白为具有Fc区的抗体。
39.一种制备石墨烯氧化物的方法，其包括：
将石墨依次与氧化性酸和氧化剂反应，得到氧化的石墨烯；
用水性溶剂洗涤所述氧化的石墨烯；且
用含有间充物的溶液处理所述氧化的石墨烯，得到石墨烯氧化物。
40.权利要求39的方法，其中所述氧化性酸为硝酸。
41.权利要求39的方法，其中所述氧化剂为氯酸钾。
42.权利要求39的方法，其中所述水性溶剂为水。
43.权利要求39的方法，其中所述间充物为四丁基氢氧化铵。
44.权利要求39的方法，其中所述氧化的石墨烯的处理包括在至少约60℃的温度在含有所述间充物的溶液中加热所述氧化的石墨烯。
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