CN107790108B - 一种以中空氧化锌微球为刚性基质的亲和层析介质 - Google Patents
一种以中空氧化锌微球为刚性基质的亲和层析介质 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种以中空氧化锌微球为刚性介质的亲和层析介质,其内核由刚性介质和非刚性介质组成,刚性介质为中空氧化锌微球,非刚性介质由聚乳酸‑羟基乙酸共聚物、琥珀酸二辛酯磺酸钠、1,2‑环氧丁烷组成,内核表面交联氨基纤维素,之后被环氧基活化,环氧基与配基连接;本发明的亲和层析介质既具有较强的机械强度、较大的压力耐受范围等优点,同时又有较好的亲水性和生物相容性,同时生产步骤简单,生产成本低,利于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种层析介质,具体涉及一种以中空氧化锌微球为刚性基质的亲和层析介质。
背景技术
生物技术的发展,为高附加值蛋白质药物的大规模生产提供了可能。蛋白质药物的工业化大规模纯化、较高的纯度标准和经济成本要求,促进了生物分离技术的极大发展。液相层析技术是生物分离过程中的一个重要单元,并在生物制药工业中扮演着重要的角色。液相层析的机理之一是通过化学或者物理作用吸附样品中的各组分,具体作用方式有:离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析、反相层析和混合模式层析。其中亲和层析是根据蛋白质与介质上特殊配体的生物识别作用进行吸附的,具有分辨率高、吸附条件温和、洗脱时不易破坏蛋白质结构等优点,常用于重组蛋白的纯化。
亲和层析介质主要有固相基质、功能性配基和起连接作用的间隔臂组成,其中基质是固定配基的载体,要求其具有稳定的物理化学性质。目前使用使用较多且已经商业化的基质是聚葡萄糖、琼脂糖、聚纤维素、聚丙烯酸和聚苯乙烯等非刚性亲和层析介质,其在流体静力学压力下会产生一定程度的变形,会导致层析柱的压力增加和堵塞,进而造成亲和层析介质专一性和分离效率的降低或完全丧失,难以满足生物大分子纯化中大量且快速的操作要求。而氧化硅、氧化锆、氧化铝以及氧化钛等可用于其他层析柱的刚性介质由于非特异性吸附高、生物相容性差等问题,难以作为亲和层析介质。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本发明的目的在于提供一种以中空氧化锌微球为刚性基质的亲和层析介质。
本发明的技术方案概述如下:
一种以中空氧化锌微球为刚性基质的亲和层析介质,其内核由刚性介质和非刚性介质组成;所述刚性介质为中空氧化锌微球;所述非刚性介质由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、琥珀酸二辛酯磺酸钠、1,2-环氧丁烷组成;所述内核表面交联氨基纤维素;所述交联氨基纤维素的内核被环氧基活化;所述环氧基与配基连接。
优选的是,所述氨基纤维素通过键合环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚实现对内核的环氧基活化。
优选的是,所述内核通过下述步骤制备:
(1)将聚乳酸-羟基乙酸微球置于体积分数为50%的乙醇溶液中,在35~40℃下搅拌30分钟;
(2)用硫酸调节体系pH值为5~6,加入硫酸锌粉末,在30~35℃下搅拌使硫酸锌粉末溶解;
(3)在30~35℃下边搅拌边逐滴滴入2mol/L氢氧化钠溶液,至体系pH值为9~9.5,继续搅拌30分钟并超声15分钟,过滤并用去离子水冲洗、干燥,得到表面覆有氧化锌壳体的聚乳酸-羟基乙酸微球;
(4)将步骤(3)所得微球置于20~25℃的无水乙醇中,边搅拌边加入琥珀酸二辛酯磺酸钠和1,2-环氧丁烷,升温至70~75℃,搅拌1小时,超声30分钟,过滤并用0~4℃去离子水冲洗、干燥,得到所述内核。
优选的是,所述硫酸锌粉末与聚乳酸-羟基乙酸微球的质量比为1∶1~1.2。
优选的是,所述琥珀酸二辛酯磺酸钠与1,2-环氧丁烷的体积比为1∶3~4。
优选的是,所述聚乳酸-羟基乙酸微球的粒径为50~100μm。
优选的是,所述搅拌均采用磁力搅拌。
本发明的有益效果是:本案通过将刚性的氧化锌和非刚性的聚乳酸-羟基乙酸共聚物等相互结合构建内核,两者相互取长补短,使内核即具有刚性基质所具备的较强机械强度、较大压力耐受范围等优点,同时又弥补了其亲水性差、生物相容性差、非特异性吸附多的缺点;本发明中采用硬模板法,以固定粒径的聚乳酸-羟基乙酸微球作为模板,制备特定粒径的中空氧化锌微球。
通常制备中空氧化锌微球过程中需要通过煅烧或者溶解以完全除去模板微球,但是本发明中在特定的温度、溶剂条件下,使聚乳酸-羟基乙酸微球形成玻璃化聚乳酸-羟基乙酸聚合物,用琥珀酸二辛酯磺酸钠对玻璃化的聚乳酸-羟基乙酸聚合物表面活化,同时混入1,2-环氧丁烷来对聚合物进行修饰;用低温去离子水冲洗使内核中的非刚性基质迅速固化,形成复合基质内核。
采用氨基纤维素在内核表面交联是为了提高内核的生物亲和性和增加表面基团种类,其中琥珀酸二辛酯磺酸钠与氨基纤维素存在正负电荷之间的吸引,能够增加氨基纤维素与内核的交联强度,进而能够加强对配基的连接强度;1,2-环氧丁烷以及与氨基纤维素键合的环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚都是为了丰富内核表面的环氧活化度,进而增加亲和层析介质中配基的含量,配基含量越多,亲和层析柱的分离效率越高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本案提供了一种以中空氧化锌微球为刚性基质的亲和层析介质,通过下述实施例以及对比例具体阐述。
实施例1
制备过程如下:
(1)将20g粒径为50~100μm的聚乳酸-羟基乙酸微球置于100mL体积分数为50%的乙醇溶液中,在35~40℃下磁力搅拌30分钟;
(2)用1mol/L硫酸调节体系pH值为2~3,加入20g硫酸锌粉末,在30~35℃下磁力搅拌使硫酸锌粉末溶解;
(3)在30~35℃下边磁力搅拌边逐滴滴入2mol/L氢氧化钠溶液,至体系pH值为9~9.5,继续磁力搅拌30分钟并超声15分钟,过滤并用去离子水冲洗、干燥,得到表面覆有氧化锌壳体的聚乳酸-羟基乙酸微球;
(4)将步骤(3)所得微球置于20~25℃的20mL无水乙醇中,边磁力搅拌边加入5mL琥珀酸二辛酯磺酸钠和20mL的1,2-环氧丁烷,升温至70~75℃,磁力搅拌1小时,超声30分钟,过滤并用0~4℃去离子水冲洗、干燥,得到所需内核;
(5)将氨基纤维素溶于0~4℃去离子水中,调节pH值为6~6.5,加入步骤(4)制备的微球,在0~4℃下磁力搅拌4小时,然后升高温度,在35℃下搅拌3小时,过滤、用常温去离子水冲洗并干燥,得到表面交联氨基纤维素的微球;
(6)向步骤(5)所得微球加入50mL丙酮、10mL环氧氯丙烷和5g的NaOH,在30-40℃下磁力搅拌1~2小时,反应结束后洗涤干燥,得到表面被环氧基活化的内核;
(7)向步骤(6)所得内核中加入15g的蛋白A配基、50mL无水乙醇和4g的NaOH,在40~45℃下搅拌22小时,应结束后真空抽去溶剂,重复三次,即得层析介质。
实施例2
制备过程如下:
将实施例1中步骤(7)中的蛋白A配基用蛋白G配基代替,其余制备过程与实施例1相同。
对比例1
制备过程如下:
(1)以20g粒径在50~100μm的聚乳酸-羟基乙酸微球为内核,将其置于20~25℃的20mL无水乙醇中,边磁力搅拌边加入5mL琥珀酸二辛酯磺酸钠和20mL的1,2-环氧丁烷,在30~35℃,磁力搅拌1小时,超声30分钟,过滤并用0~4℃去离子水冲洗、干燥;
(2)将氨基纤维素溶于0~4℃去离子水中,调节pH值为6~6.5,加入步骤(1)所得的微球,在0~4℃下磁力搅拌4小时,然后升高温度,在35℃下搅拌3小时,过滤、用常温去离子水冲洗并干燥,得到表面交联氨基纤维素的聚乳酸-羟基乙酸微球;
(3)向步骤(2)所得微球加入30mL无水乙醇、10mL环氧氯丙烷和5g的NaOH,在30-40℃下磁力搅拌1~2小时,反应结束后洗涤干燥,得到表面被环氧基活化的内核;
(4)向步骤(3)所得内核中加入15g的蛋白A配基、50mL无水乙醇和4g的NaOH,在40~45℃下搅拌22小时,应结束后真空抽去溶剂,重复三次,即得目标层析介质。
对比例2
制备过程如下:
实施例1的步骤(4)中不加入琥珀酸二辛酯磺酸钠,其余制备过程与实施例1完全相同。
对比例3
制备过程如下:
实施例1的步骤(4)中琥珀酸二辛酯磺酸钠用相同量的十二烷基苯磺酸钠代替,其余制备过程与实施例1完全相同。
对比例4
制备过程如下:
略去实施例1的步骤(5),即微球内核的表面不进行氨基纤维素的交联,其余制备过程与实施例1完全相同。
对比例5
制备过程如下:
实施例1的步骤(5)中氨基纤维素用相同量的纤维素替代,其余制备过程与实施例1完全相同。
对比例6:
市售的以蛋白A为配基的亲和层析介质。
为了对亲和层析介质实施例1~2和对比例1~6的耐受压力以及吸附性能进行测试,分别对各样品进行耐受柱压测试和对目标蛋白固载量测试。
耐受柱压测试:
分别将3.5mL介质装柱(柱内径1cm,装柱高度4.46cm),连接到AKTA Purifier层析系统,流动相选择浓度为0.1mol/L氯化钠溶液,测定不同流速下所对应的柱压。以流速为横坐标,对应流速下的柱压为纵坐标,当柱压与流速呈线性关系时,层析柱可以进行有效分离纯化,说明层析柱能够承受相应的压力与流速。在柱压与流速呈现良好线性关系的范围内,该直线的斜率能够代表层析介质的耐压性,斜率越小则耐压性能越好,斜率小即在高流速下介质所需承受的柱压较小,不易破碎,机械性能好。
目标蛋白固载量测试:
以lgG抗体作为目标蛋白,将各亲和层析介质装柱进行载量测试,以相同浓度的目标蛋白重复3次层析实验,每次层析实验结束后用均用2个柱体积的0.5mol/L氢氧化钠和0.15mol/L氯化钠混合溶液冲洗,再用5个柱体积的平衡液平衡,记录第三次的固载量。
由表1的测试数据可以看出,根据实施例1和实施例2制备的亲和层析介质在耐压性能和吸附性能方面均有较大优势;与实施例1相比,对比例1不含有中空氧化锌刚性介质,耐压性能明显较差,同时单独使用聚乳酸-羟基乙酸微球作为基质,亲和层析介质的稳定性差,对碱性耐受度低,在三次层析实验中对目标蛋白的固载量有降低明显;根据实施例1和对比例2~3可以看出,表面活性物质琥珀酸二辛酯磺酸钠的加入,使层析介质对目标蛋白质的固载量有增加,同时耐压性能也有增强,本发明使用琥珀酸二辛酯磺酸钠不仅可以促使1,2-环氧丁烷与聚乳酸-羟基乙酸聚合物相互融合,使微球内核上环氧基活化位点增多,进而较多连接配基,增加对目标蛋白固载量,而且能够增加中空氧化锌微球与非刚性基质的结合力,增大介质的耐压性。
根据实施例1和对比例4~5的测试数据,可以证明氨基纤维素丰富了亲和层析介质的表面活性基团,能够与环氧化合物有效键合而被环氧基活化,从而连接更多配体,提高目标蛋白固载量,同时与氨基纤维素相比,没有氨基的纤维素与内核的附着强度较弱,表现在对比例5的耐受压力较差;由实施例1与对比例6能够得知,相对于现有产品,本发明的亲和层析介质在耐受强度和吸附性能方面都有较大改进。
表1
层析介质 | 柱压与流速斜率(Pa·h/cm) | 对lgG抗体的固载量(mg/mL) |
实施例1 | 203 | 39.5 |
实施例2 | 205 | 42.7 |
对比例1 | 251 | 34.6 |
对比例2 | 220 | 33.7 |
对比例3 | 213 | 35.8 |
对比例4 | 226 | 32.3 |
对比例5 | 218 | 36.4 |
对比例6 | 247 | 32.6 |
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节。
Claims (2)
1.一种以中空氧化锌微球为刚性基质的亲和层析介质,其特征在于,内核由刚性介质和非刚性介质组成;所述刚性介质为中空氧化锌微球;所述非刚性介质由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、琥珀酸二辛酯磺酸钠、1,2-环氧丁烷组成;所述内核表面交联氨基纤维素;所述交联氨基纤维素的内核被环氧基活化;所述环氧基与配基连接;
所述内核通过下述步骤制备:
(1)将聚乳酸-羟基乙酸微球置于体积分数为50%的乙醇溶液中,在35~40℃下搅拌30分钟;
(2)用硫酸调节体系pH值为5~6,加入硫酸锌粉末,在30~35℃下搅拌使硫酸锌粉末溶解;
(3)在30~35℃下边搅拌边逐滴滴入2mol/L氢氧化钠溶液,至体系pH值为9~9.5,继续搅拌30分钟并超声15分钟,过滤并用去离子水冲洗、干燥,得到表面覆有氧化锌壳体的聚乳酸-羟基乙酸微球;
(4)将步骤(3)所得微球置于20~25℃的无水乙醇中,边搅拌边加入琥珀酸二辛酯磺酸钠和1,2-环氧丁烷,升温至70~75℃,搅拌1小时,超声30分钟,过滤并用0~4℃去离子水冲洗、干燥,得到所述内核;
所述硫酸锌粉末与聚乳酸-羟基乙酸微球的质量比为1∶1~1.2;
所述琥珀酸二辛酯磺酸钠与1,2-环氧丁烷的体积比为1∶3~4;
所述聚乳酸-羟基乙酸微球的粒径为50~100μm;
所述搅拌均采用磁力搅拌。
2.根据权利要求1所述的亲和层析介质,其特征在于,所述氨基纤维素通过键合环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚实现对内核的环氧基活化。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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