CN107754769B - 一种高载量金属螯合亲和层析介质 - Google Patents

一种高载量金属螯合亲和层析介质 Download PDF

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Abstract

本案涉及高载量金属螯合亲和层析介质，以硅胶微球为内核，所述硅胶微球设有孔道，在硅胶微球表面及孔道内附着有羧甲基壳寡糖分子，羧甲基壳寡糖分子一部分络合有第一金属离子以形成第一层金属螯合，剩余部分键合有烯丙基缩水甘油醚，烯丙基缩水甘油醚连接有配基，配基络合有第二金属离子以形成第二层金属螯合；本发明成功地在介质表面固载了双金属层，有效提高了金属亲和层析介质的固载量，这种改进方法简单，生产成本低，利于大规模推广应用。

Description

一种高载量金属螯合亲和层析介质
技术领域
本发明涉及一种层析介质，具体涉及一种高载量金属螯合亲和层析介质。
背景技术
蛋白质的高效分离纯化是生物制药、基因工程、生命科学研究等顺利开展的前提和基础，根据蛋白质自身的尺寸大小不同、溶解能力及所带电荷数的不同，纯化蛋白质的方法也不尽相同。其中，金属螯合亲和层析技术是基于蛋白质表面的一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力不同而对蛋白质进行分离纯化，具有特异性强、金属离子可选择种类多、吸附目标蛋白相对稳定、层析柱可连续使用或再生等优势而日益受到人们的关注。
金属螯合亲和层析介质主要由固体基质、螯合配基和金属离子三部份构成，而且这些组成部分都会对最终层析柱吸附分离蛋白质产生不同程度的影响。评价金属螯合层析介质性能的指标有很多，如粒径及其分布、流通性能、孔道结构及载量等，其中，载量是最重要的指标之一，用以表征介质的吸附性能。高载量介质能大大增加柱承载能力，提升纯化能力，降低分离纯化成本。但是，现有金属螯合亲和层析介质的结构单一，普遍存在蛋白载量较低，分离纯化效率不高的问题。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种高载量金属螯合亲和层析介质。
本发明的技术方案概述如下：
以硅胶微球为内核，所述硅胶微球设有孔道，所述硅胶微球表面及孔道内附着有羧甲基壳寡糖分子；所述羧甲基壳寡糖分子一部分络合有第一金属离子以形成第一层金属螯合，剩余部分键合有烯丙基缩水甘油醚；所述烯丙基缩水甘油醚连接有配基；所述配基络合有第二金属离子以形成第二层金属螯合。
优选的是，所述第一金属离子选自Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+中的一种。
优选的是，所述第二金属离子选自Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+中的一种。
优选的是，所述第二金属离子与所述第一金属离子的摩尔比为1∶8～10。
优选的是，所述羧甲基壳寡糖分子的聚合度在5～15之间。
优选的是，所述硅胶微球的粒径为30～100μm，所述孔道的平均孔径为8～12nm。
优选的是，所述配基为亚氨基二乙酸、三羟甲基乙二胺、次氨基三乙酸中的一种。
本发明的有益效果是：本案发明涉及的金属螯合亲和层析介质选用比表面积大、孔道均匀、孔径较大的硅胶微球作为内核，可以提供较大的配基固载面积；用羧甲基壳寡糖分子附着于硅胶微球表面增加了硅胶微球的生物相容性，能够增加蛋白质载量；羧甲基壳寡糖分子是经羧甲基修饰的聚合度为5～15的低聚壳聚糖分子，其对Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+等金属离子具有强烈地络合作用，可以用于螯合金属离子，增加层析介质的金属固载量；羧甲基壳寡糖分子通过烯丙基缩水甘油醚键合配基，该配基可以是金属螯合亲和层析介质中常用的配基亚氨基二乙酸、三羟甲基乙二胺、次氨基三乙酸等，该配基进一步固载金属离子用于分离纯化；本发明成功地在介质表面固载了双金属层，有效提高了金属亲和层析介质的固载量，这种改进方法简单，生产成本低，利于大规模推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本发明提供了一种高载量的金属螯合亲和层析介质，通过下述实施例以及对比例具体阐述。
实施例1
制备过程如下：
1)将20g粒径在30～100μm的硅胶微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50～55℃下搅拌1～1.5小时使硅胶微球活化，将硅胶微球真空干燥12小时；硅胶微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有500g/L羧甲基壳寡糖分子、3mol/L氢氧化钠的无水乙醇溶液中，在35～40℃下搅拌反应4～5小时，干燥后得到附着有羧甲基壳寡糖分子的硅胶微球内核；
2)将步骤1)所得的硅胶微球内核用去离子水冲洗，依次加入23g(约0.2mol)烯丙基缩水甘油醚、5g硫酸钠、5g氢氧化钠、100ml去离子水，在45～50℃下搅拌18小时，用去离子水洗净，干燥后得到活化后的硅胶微球内核；
3)将步骤2)所得硅胶微球浸泡于2mol/L醋酸镍缓冲溶液，调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌3小时，过滤，用去离子水冲洗、干燥，所得硅胶微球内核表面的羧甲基壳寡糖分子络合有Ni2+；
4)向步骤3)所得硅胶微球中加入42g(约0.22mol)氨基三乙酸、50mL乙醇和5gNaOH，在55～60℃下搅拌反应5～6h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤、干燥，所得硅胶微球内核表面的通过烯丙基缩水甘油醚键合了金属螯合配基氨基三乙酸；
5)将步骤4)所得硅胶微球浸泡于1mol/L的醋酸镍缓冲溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时，过滤、洗涤、干燥得到最终固载有双金属层的金属螯合亲和层析介质。
实施例2：
实施例1中的步骤2)中2mol/L醋酸镍用相同量的醋酸铁代替，其余制备过程与实施例1一致，得到不同金属的双金属层螯合亲和层析介质。
对比例1：
1)将20g粒径在30～100μm的硅胶微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50～55℃下搅拌1～1.5小时使硅胶微球活化，将硅胶微球真空干燥12小时；硅胶微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有500g/L羧甲基壳寡糖分子、3mol/L氢氧化钠的无水乙醇溶液中，在35～40℃下搅拌反应4～5小时，干燥后得到附着有羧甲基壳寡糖分子的硅胶微球内核；
2)将步骤1)所得硅胶微球浸泡于3mol/L醋酸镍缓冲溶液，调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌5小时，过滤，用去离子水冲洗、干燥，得到以羧甲基壳寡糖分子固载单层Ni2+的金属螯合亲和层析介质。
对比例2：
1)将20g粒径在30～100μm的硅胶微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50～55℃下搅拌1～1.5小时使硅胶微球活化，将硅胶微球真空干燥12小时；硅胶微球从真空干燥炉中取出后迅速置于含有500g/L羧甲基壳寡糖分子、3mol/L氢氧化钠的无水乙醇溶液中，在35～40℃下搅拌反应4～5小时，干燥后得到附着有羧甲基壳寡糖分子的硅胶微球内核；
2)将步骤1)所得的硅胶微球内核用去离子水冲洗，依次加入1.9～2mol烯丙基缩水甘油醚、0.4～0.5mol硫酸钠、2.4～2.5mol氢氧化钠、250ml去离子水，在45～50℃下搅拌18小时，用去离子水洗净，干燥后得到活化后的硅胶微球内核；
3)向步骤2)所得硅胶微球中加入42g(约0.22mol)氨基三乙酸、50mL乙醇和5gNaOH，在55～60℃下搅拌反应5～6h，反应结束后过滤除去溶剂，洗涤、干燥，所得硅胶微球内核表面的通过烯丙基缩水甘油醚键合了金属螯合配基氨基三乙酸；
4)将步骤3)所得硅胶微球浸泡于3mol/L醋酸镍缓冲溶液，调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌5小时，过滤，用去离子水冲洗、干燥，得到以配基固载单层Ni2+的金属螯合亲和层析介质。
对比例3：
市售以氨基三乙酸为配基的金属螯合亲和层析介质。
为了测试上述实施例1～2以及对比例1～3所述的金属螯合亲和层析介质，在相同条件下进行蛋白质动态载量测试。将5.0mL介质装柱,连接到层析系统中，平衡缓冲液为0.02mol/L磷酸-0.15mol/L氯化钠-5mmol/L咪唑(pH7.5)溶液，分别以组氨酸标记的枯草杆菌蛋白酶和乳酸脱氢酶上样，流速为0.5mL/min,流穿液达到饱和后停止上样，以0.02mol/L磷酸-0.15mol/L氯化钠-0.5mol/L咪唑(pH 7.5)溶液洗脱，收集洗脱峰，检测280nm下的析光度A280，测定流出液和洗脱液蛋白浓度，根据公式Q＝CV/Vmed，其中，Q为介质固载量(mg/mL)，C为洗脱液蛋白浓度(mg/mL),V为洗脱液体积(mL),Vmed为介质体积(mL)。
表1即为在上述测试条件下实施例1～2以及对比例1～3所述的金属螯合亲和层析介质对组氨酸标记的枯草杆菌蛋白酶和乳酸脱氢酶的动态载量。其中，实施例1和实施例2制备的双层金属螯合亲和介质对两种蛋白质的固载量较对比例1～3所制备介质的蛋白固载量明显偏高，双层金属螯合扩展了用来固载蛋白的空间从而能够固载更多的蛋白质；对比例1和对比例2分别为单层金属螯合亲和层析介质，尽管它们蛋白固载量较实施例1和实施例2少，但由于采用了以附着有羧甲基壳寡糖分子的硅胶微球作为内核，表面积较大，硅胶微球孔径均匀、孔隙较大，使得蛋白固载量相比于对比例3所述市售亲和层析介质的固载量有提高。
表1
Figure BDA0001451543150000051
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (5)

1.一种高载量金属螯合亲和层析介质，其特征在于，以硅胶微球为内核，所述硅胶微球设有孔道，所述硅胶微球表面及孔道内附着有羧甲基壳寡糖分子；所述羧甲基壳寡糖分子一部分络合有第一金属离子以形成第一层金属螯合，剩余部分键合有烯丙基缩水甘油醚；所述烯丙基缩水甘油醚连接有配基；所述配基络合有第二金属离子以形成第二层金属螯合；
所述第一金属离子选自Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+中的一种；
所述第二金属离子选自Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+中的一种。
2.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述第二金属离子与所述第一金属离子的摩尔比为1∶8～10。
3.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述羧甲基壳寡糖分子的聚合度在5～15之间。
4.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述硅胶微球的粒径为30～100μm，所述孔道的平均孔径为8～12nm。
5.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述配基为亚氨基二乙酸、三羟甲基乙二胺、次氨基三乙酸中的一种。
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