CN106268556B - 一种蛋白纯化用磁珠的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白纯化用磁珠的制备方法。以壳聚糖和磁粉为原料，在交联剂作用下形成交联壳聚糖包覆磁粉的核壳结构颗粒，经还原和羧甲基化作用形成蛋白纯化用磁珠。将该蛋白纯化用磁珠用于带有his‑tag的蛋白质的分离纯化，极大提高分离效率。本发明避免了洗脱时可能出现的蛋白质变性的问题，且能提高蛋白质的分离效率。同时，操作便捷，适用于浑浊蛋白溶液的分离，尤其适用于大工业生产。

Description

一种蛋白纯化用磁珠的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用于蛋白质分离纯化的磁珠的制备方法。
背景技术
蛋白质的分离纯化主要有盐析、离心、凝胶电泳和亲和层析等方法。其中，盐析、离心和凝胶电泳受限于成本高和效率低等因素，应用比较局限。亲和层析是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中，经洗脱即可分离纯化。目前，对于重组蛋白的分离纯化，金属螯合亲和层析是最常应用的技术手段。金属螯合亲和层析是利用蛋白质表面的一些氨基酸如组氨酸、色氨酸和半胱氨酸等能与金属离子发生特异性吸附，从而对蛋白质进行分离的技术。其中的His-tag技术，就是以4-10个组氨酸标记要分离的目标蛋白质，组氨酸残基带有1个咪唑基团，能够与Ni2+、Co2+、Cu2+金属离子螯合从而特异吸附到介质上实现分离。常规的金属螯合亲和层析介质大多是葡聚糖和琼脂糖，但这两种层析介质制备复杂，价格昂贵，且不耐压，一般仅适合实验室使用。
作为葡聚糖和琼脂糖基质的替代者，壳聚糖有很多优势，如资源丰富价格低，生物相容性好，配基偶联方法简单，非特异性吸附弱等。壳聚糖是一种天然的碱性多糖，C2位带有氨基，C3和C6位带有羟基，可与各种含有醛基的交联剂反应，因此易于衍生化。目前，对于壳聚糖应用的开发主要集中于废水处理领域。CN201010610928.3于2011年7月27日公开了一种磁性壳聚糖微球的制备方法，将壳聚糖，含Fe3+，Fe2+的溶液在酸性条件下混合，然后将该混合液滴加到碱性溶液中进行沉淀反应，所得沉淀物即为磁性壳聚糖微球。该发明制得的磁性壳聚糖微球，分布在表层，且对壳聚糖并未采用交联剂增强机械强度，承压力较差，不适用于蛋白质的分离纯化，仅适合于污水处理或者用于作为药物载体。CN201510622284.2于2015年12月23日公开了一种糠醛改性交联壳聚糖螯合树脂磁性颗粒的制备方法，其步骤为：1、以糠醛为原料，壳聚糖为基质，制备糠醛改性壳聚糖；2、使用戊二醛为交联剂，将糠醛改性壳聚糖进行交联，并将其包覆在颗粒表面，得到糠醛改性交联壳聚糖螯合树脂磁性颗粒。该发明采用糠醛对壳聚糖进行改性，是为了引入更多的N原子和O原子，增加树脂中可以与金属离子配对的原子数量。这种处理办法对于处理工业废水污染中重金属离子的回收吸附比较有效，但在金属螯合亲和层析中金属离子过多反而导致蛋白质变性，因此不适用。CN201310257075.3于2013年10月9日公开了一种一种咪唑和壳聚糖功能化磁性粒子及其制备方法，由磁粉、油酸、壳聚糖和咪唑等反应制得，用于去除工业废水中磺酸染料。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于工业化应用的蛋白质大规模分离纯化的磁性壳聚糖介质的制备方法。由于葡聚糖和琼脂糖树脂的机械强度低不耐压，以及制备工艺复杂、价格昂贵等特点，使得这两种介质不适用于蛋白质的大规模纯化。同时，普通的交联壳聚糖也存在装填较大的层析柱时会挤压变形的问题。为解决上述问题，本发明提供一种蛋白纯化用磁珠的制备方法。该磁珠是将壳聚糖交联在磁粉表面，避免了普通壳聚糖树脂的挤压变形问题；颗粒内部无螯合金属离子也避免了因此而带来的问题；同时颗粒带有磁感应性，可以在磁场作用下从溶液中快速分离，便于杂蛋白的清洗与纯蛋白的洗脱操作，尤其适用于大规模的工业化生产。
本发明的技术方案
本发明提供一种蛋白纯化用磁珠的制备方法，是在磁珠表面构建羧甲基化的交联壳聚糖包膜；所述羧甲基化交联壳聚糖的结构如下：
Figure 346058DEST_PATH_IMAGE001
本发明提供的蛋白纯化用磁珠的制备方法，其过程为：
1、取壳聚糖、纯水、冰醋酸，充分溶解，得壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量百分比浓度为0.1%-2%；
2、取步骤1所制壳聚糖溶液，加入磁粉，搅拌混匀，加入交联剂，加入碱性溶液调节pH 值至5.5-9.5，此时能发生醛胺缩合反应，产生交联壳聚糖；
3、在搅拌条件下加入NaBH4，还原亚胺而形成稳定交联结构；
4、充分洗涤后，往反应体系中加入氯乙酸钠，控制温度为80-95℃，pH 值为8-9，搅拌，此时产生羧甲基化反应，形成可螯合金属离子的交联壳聚糖，即蛋白纯化用磁珠；
将所得蛋白纯化用磁珠加入螯合金属离子溶液中，搅拌混匀，加入带有His-tag的目标蛋白混合液，经反应，目标蛋白特异结合在蛋白纯化用磁珠上，采用磁性吸附的方式将所述蛋白纯化用磁珠分离出来，经缓冲液洗杂和咪唑溶液洗脱，即得纯化后的目标蛋白。
步骤2中所述磁粉其规格为300-1200目；所述交联剂为乙二醛或者戊二醛。
本发明所述蛋白纯化用磁珠其改性交联壳聚糖的实现过程可用反应式表示如下：
Figure 20753DEST_PATH_IMAGE002
有益效果
针对葡聚糖、琼脂糖和普通交联壳聚糖在蛋白质大规模纯化方面的不足，本发明采用以磁粉为内核，以改性交联壳聚糖为外壳的核壳结构的磁珠，具有多方面的优点，其一是颗粒内部为实心结构，避免了大量的内部螯合金属离子洗脱导致洗脱液中Ni2+和Cu2+等金属离子过多而使目标蛋白变性；其二，由于蛋白纯化用磁珠具有磁感应性，在分离时，在磁场的作用下可以快速分离，易于操作；最后，由于磁场分离的便捷，浑浊的细胞破碎液无需繁琐费事的离心或过滤处理，而直接用于纯化操作，特别适合于大规模生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述。
以下实施例中的磁粉规格为600目，购自灵寿县宇通矿产品加工厂；壳聚糖脱乙酰度为95%，购自桓台县金湖甲壳制品有限公司。
实施例1
（1）取壳聚糖9g，加纯水900ml，搅拌下加入3ml冰醋酸，充分搅拌溶解，冷却至4℃，制得壳聚糖溶液；（2）在10L的反应体系中，加入磁粉750g、蒸馏水1875ml，加入步骤（1）中所制的壳聚糖溶液750ml，在高速搅拌条件下加入冷的4%的乙二醛溶液37.5ml，充分混匀；（3）加入0.2mol/L的K2HPO4溶液220ml，高速搅拌2h；（4）加入（NH4）2SO4 40g，同时以1mol/L的NaOH溶液动态调节并维持溶液的pH为8.5左右，搅拌2h；（5）加入NaBH4 10g，搅拌2h，去除上清液，用5L蒸馏水洗涤2次；（6）加入氯乙酸钠66g，在85℃，pH 8.5的条件下，搅拌2h；（7）经以上步骤得到的混合物，用蒸馏水洗涤2次，即得到蛋白纯化用磁珠。
取上述蛋白纯化用磁珠0.3g（湿），加入0.1mol/l的NiSO4 1ml，混匀10min，磁吸去上清，用缓冲液（含0.5mol/LNaCl，20mmol/L 磷酸盐，pH 7.4）洗涤3次（1ml*3），加入含有6His标记的青霉素酰化酶的大肠杆菌细胞破碎液，在4℃恒温混合10min。磁吸去上清，以1ml 0.5mol/LNaCl溶液（含20mmol/L磷酸盐，pH 7.4）洗涤3次去除杂质，最后加洗脱液（含0.5mol/LNaCl和0.5mol/L咪唑，pH 7.4）洗脱三次（0.5ml*3），合并洗脱液，得到纯化青霉素酰化酶。将洗脱液进行SDS-PAGE电泳，得到目标蛋白的纯度约为95%。
实施例2mol/L
（1）取壳聚糖9g，加纯水900ml，搅拌下加入3ml冰醋酸，充分搅拌溶解，冷至4℃，制得壳聚糖溶液；（2）在10L的反应体系中，加入磁粉750g、蒸馏水1875ml，加入步骤一中所制的壳聚糖溶液750ml，在高速搅拌条件下加入冷的4%的戊二醛溶液37.5ml，充分混匀；（3）加入0.2m/L的K2HPO4溶液220ml，高速搅拌2h；（4）加入（NH4）2SO4 40g，同时以1mol/L的NaOH溶液动态调节并维持溶液的pH为8.5左右，搅拌2h；（5）加入NaBH4 10g，搅拌2h，去除上清液，用5L蒸馏水洗涤2次；（6）在85℃，pH 8.5的条件下，加入氯乙酸钠66g，搅拌2h；（7）经以上步骤得到的混合物，用蒸馏水洗涤2次，即得到蛋白纯化用磁珠。
同实施例1的操作过程测试蛋白纯化效果，结果一致。

Claims (2)

1.一种蛋白纯化用磁珠的制备方法，其特征过程为：（1）、取壳聚糖、纯水、冰醋酸，充分溶解，得壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量百分比浓度为 0.1%-2%；（2）、取步骤（1）所制壳聚糖溶液，加入磁粉，搅拌混匀，加入交联剂，加入碱性溶液调节p H值至5.5-9.5；（3）、在搅拌条件下加入NaBH；（4）、往反应体系中加入氯乙酸钠，在温度80-95℃，p H值8-9条件下，搅拌，即得蛋白纯化用磁珠，其中所述蛋白纯化用磁珠是外壳为改性交联壳聚糖内核为磁粉的核壳结构，所述改性交联壳聚糖的具体结构为：
Figure 922238DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述蛋白纯化用磁珠的制备方法，其特征是：所述磁粉规格为300-1200目；所述交联剂为乙二醛。
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