CN110511314B - 一种金属螯合聚苯乙烯纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents

一种金属螯合聚苯乙烯纳米球及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于高分子聚合物的技术领域，公开了一种金属螯合聚苯乙烯纳米球及其制备方法与应用。所述方法：1)羧基化聚苯乙烯纳米球的制备；2)将羧基化聚苯乙烯纳米球进行羧基活化，随后加入金属螯合剂进行反应，获得螯合剂修饰的纳米球；将螯合剂修饰的纳米球与金属盐反应，获得金属螯合聚苯乙烯纳米球；所述金属盐为溶于水的金属盐，具体包括铜盐，锌盐，钴盐或镍盐中的一种以上。本发明的方法简单，所制备的金属螯合聚苯乙烯纳米球比表面积大，粒径均一，约100nm；而且金属螯合聚苯乙烯纳米球能够快速从复杂生物体系分离纯化目标蛋白，分离出的目标蛋白纯度高，数量多。本发明的金属螯合聚苯乙烯纳米球用于蛋白质的分离纯化领域。

Description

一种金属螯合聚苯乙烯纳米球及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于高分子聚合物的技术领域，具体涉及一种金属螯合聚苯乙烯纳米球及其制备方法与应用。
背景技术
固定化金属螯合亲和层析技术是近年来出现的一种新型亲和层析技术，主要用于生物大分子的分离。相对于传统的分离蛋白质技术，如凝胶过滤层析、吸附层析、离子交换层析等，亲和层析技术优点在于其在蛋白质的分离纯化过程中具有选择性和特异性，可以在某些复杂的环境中快速、简便、有针对性地得到纯度高的目标蛋白。正因如此，固定化金属螯合亲和层析技术越来越得到重视，除了应用在蛋白质检测、分离纯化外，还应用于蛋白质的定向固定、联用技术应用、蛋白质的复性与纯化、核酸的分离纯化、基因工程技术等。但目前现有的亲和层析技术存在蛋白质得率低、纯度低的问题。
本发明基于以上现状，制备了一种具有较大比表面积、尺寸大小可调控的金属螯合聚苯乙烯纳米球，该纳米颗粒粒径均一，表面光滑、呈现良好球形表面固定化大量金属离子。本发明先采用乳液聚合法，以苯乙烯为单体，丙烯酸为功能单体制备出羧基化聚苯乙烯纳米球，再利用氨三乙酸为金属螯合剂，将金属离子通过配位键固定化在纳米球表面。相比于传统的金属螯合亲和层析，本发明制备的金属螯合聚苯乙烯纳米球与蛋白质的结合量较大、分离得到蛋白质纯度较高。
发明内容
本发明针对传统镍柱对生物复杂体系中蛋白质纯化度不高，结合量少等问题，提供了一种金属螯合聚苯乙烯纳米球及其制备方法。本发明采用乳液聚合法制备了羧基化聚苯乙烯纳米微球，然后通过金属螯合剂的作用，将金属离子通过配位键固定在纳米球表面，从而获得金属螯合聚苯乙烯纳米球。该纳米颗粒比表面积大，粒径均一，表面光滑、呈现良好球形表面固定化大量金属离子。
本发明的另一目的在于提供上述金属螯合聚苯乙烯纳米球的应用。所述金属螯合聚苯乙烯纳米球用于蛋白质的分离纯化领域，对蛋白质进行分离纯化，特别是生物体系中蛋白质的分离纯化。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种金属螯合聚苯乙烯纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧基化聚苯乙烯纳米球的制备
(2)将羧基化聚苯乙烯纳米球进行羧基活化，随后加入金属螯合剂进行反应，获得螯合剂修饰的纳米球；将螯合剂修饰的纳米球与金属盐反应，获得金属螯合聚苯乙烯纳米球。
所述金属螯合剂为氨三乙酸及其盐，乙二胺四乙酸及其盐，二亚乙基三胺五乙酸及其盐中一种以上。
所述金属盐为溶于水的金属盐，具体包括铜盐，锌盐，钴盐或镍盐中的一种以上；所述铜盐为氯化铜、硫酸铜或硝酸铜；所述锌盐为氯化锌、硫酸锌或硝酸锌；所述钴盐为氯化钴；所述镍盐为氯化镍。
所述金属螯合剂的用量为羧基化聚苯乙烯纳米球质量的1～10％，加入金属螯合剂进行反应的反应时间12～24h，反应温度为20～30℃；所述金属盐的用量为羧基化聚苯乙烯纳米球中羧基摩尔量的1倍以上，优选羧基摩尔量≤金属盐中金属离子的摩尔量与金属离子所带电荷数的乘积值；螯合剂修饰的纳米球与金属盐反应的时间为1～12h。
所述羧基活化的时间为1～4h；所述羧基活化是指采用活化剂进行活化，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；在进行羧基活化时，将活化剂用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液溶解，配成溶液使用。
所述羧基化聚苯乙烯纳米球通过以下方法制备：
在保护性氛围以及含有乳化剂的水中，将苯乙烯在碱性条件下进行加热搅拌，随后加入引发剂反应，再加入丙烯酸类单体聚合反应，后续处理，获得羧基化聚苯乙烯纳米球。
所述加热搅拌的时间为20～35min，加热搅拌的温度为50～70℃；
所述加入引发剂反应的时间为20～35min，加入引发剂反应的温度为50～70℃；
聚合反应的时间为12～48h，聚合反应的温度为60～90℃。
所述丙烯酸类单体为丙烯酸或甲基丙烯酸；
所述乳化剂为十二烷基硫酸钠；所述引发剂为过硫酸钾；所述碱性条件是指在水中加入碳酸钠。碳酸钠与水的质量比为(0.05～0.2):300。所述水与苯乙烯的体积比为(8～12)：1。
所述乳化剂的质量与苯乙烯的体积比为(0.3～1.5)g:100mL、引发剂的质量与苯乙烯的体积比为(0.05～1)g：100mL，丙烯酸类单体的用量为苯乙烯体积用量的10～80％。
聚合反应在高速搅拌的条件下进行，转速为300～600r/min。
所述后续处理是指取出，采用无水乙醇、水于交替洗涤数次，真空干燥。
本发明以苯乙烯为单体，丙烯酸类为功能单体，采用乳液聚合法制备羧基化聚苯乙烯纳米微球，再以氨三乙酸为金属螯合剂，将金属离子通过配位键固定化在纳米球表面。
本发明的金属螯合聚苯乙烯纳米球通过上述方法制备得到。纳米球的粒径约100nm，大小均一，由于通过金属螯合接入大量金属离子，能够实现蛋白质的高度分离与纯化应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明制备的金属螯合聚苯乙烯纳米球比表面积大，粒径均一，约100nm。
2)本发明制备的金属螯合聚苯乙烯纳米球金属离子含量高。
3)本发明制备的金属螯合聚苯乙烯纳米球能够快速从复杂生物体系分离纯化目标蛋白，分离出的目标蛋白纯度高，数量多，在蛋白质的分离纯化领域具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2制备的镍离子螯合聚苯乙烯纳米球的扫描电镜(SEM)图；a，b分别为不同放大倍数的扫描电镜(SEM)图；
图2为实施例6中镍离子螯合聚苯乙烯纳米球分离纯化蛋白的SDS凝胶电泳分析图；条带1-8分别为：细胞裂解液、上清液、10、25、50、100、200、300mM咪唑洗脱液；
图3为实施例9中镍离子螯合聚苯乙烯纳米球与传统镍柱分离纯化蛋白的SDS凝胶电泳分析图：条带1-5分别为：细胞裂解液、镍离子螯合聚苯乙烯纳米球100mM咪唑洗脱液、镍离子螯合聚苯乙烯纳米球500mM咪唑洗脱液、传统镍柱100mM咪唑洗脱液、传统镍柱500mM咪唑洗脱液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细地描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
羧基化聚苯乙烯纳米球的制备：取0.2g SDS、0.1g Na2CO3溶于装有300mL蒸馏水的三颈烧瓶，搅拌，充氮30min，加入30mL苯乙烯并升温至60℃，搅拌反应30min，加入15mL含0.06g过硫酸钾的热溶液(水溶液)，混匀，在高转速350r/min的状态下反应30min后加入9ml丙烯酸，充氮保护后在75℃、350r/min的条件下反应24h，取出，采用无水乙醇、水于交替洗涤数次，在60℃下真空干燥12h，得到粉末状乳白色羧基化聚苯乙烯纳米球。
金属螯合聚苯乙烯纳米球的制备：取200mg羧基化聚苯乙烯纳米球加入至30ml含3mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，反应2h(常温下)，活化聚苯乙烯纳米球表面的羧基；再加入15ml 6mM的氨三乙酸溶液(氨三乙酸溶于20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液)，继续反应12h，形成氨三乙酸修饰的聚苯乙烯纳米球，加入过量CuCl2(0.15mmol)(氯化铜以溶液的形式加入，溶剂为水，50mL)反应2h，得到金属螯合聚苯乙烯纳米球(铜离子螯合聚苯乙烯纳米球)。
实施例2：
羧基化聚苯乙烯纳米球的制备：取0.2g SDS、0.1g Na2CO3溶于装有300mL蒸馏水的三颈烧瓶，搅拌，充氮30min，加入30mL苯乙烯并升温至60℃，搅拌反应30min，加入15mL含0.06g过硫酸钾的热溶液(水溶液)，混匀，在高转速350r/min的状态下反应30min后加入9ml丙烯酸，充氮保护后在75℃、350r/min的条件下反应24h，取出，采用无水乙醇、水于交替洗涤数次，在60℃下真空干燥12h，得到粉末状乳白色羧基化聚苯乙烯纳米球。
金属螯合聚苯乙烯纳米球的制备：取200mg羧基化聚苯乙烯纳米球加入至30ml含3mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和3mM N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，反应2h，活化聚苯乙烯纳米球表面的羧基；再加入15ml 6mM的氨三乙酸溶液(氨三乙酸溶于20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液)，继续反应12h，形成氨三乙酸修饰的聚苯乙烯纳米球，加入过量NiCl2(0.15mmol)(氯化镍以溶液的形式加入，溶剂为水)反应2h，得到金属螯合聚苯乙烯纳米球(镍离子螯合聚苯乙烯纳米球)。
图1为实施例2制备的镍离子螯合聚苯乙烯纳米球的扫描电镜(SEM)图；a，b分别为不同放大倍数的扫描电镜(SEM)图。
实施例3：
羧基化聚苯乙烯纳米球的制备：取0.2g SDS、0.1g Na2CO3溶于装有300mL蒸馏水的三颈烧瓶，搅拌，充氮30min，加入30mL苯乙烯并升温至60℃，搅拌反应30min；加入15mL含0.06g过硫酸钾的热溶液(水溶液)，混匀，在高转速350r/min的状态下反应30min后加入9ml丙烯酸，充氮保护后在75℃、350r/min的条件下反应24h，取出，采用无水乙醇、水于交替洗涤数次，在60℃下真空干燥12h，得到粉末状乳白色羧基化聚苯乙烯纳米球。
金属螯合聚苯乙烯纳米球的制备：取200mg羧基化聚苯乙烯纳米球加入至30ml含3mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，反应2h，活化聚苯乙烯纳米球表面的羧基，再加入15ml 6mM的氨三乙酸溶液(氨三乙酸溶于20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液)，继续反应12h，形成氨三乙酸修饰的聚苯乙烯纳米球，加入过量CoCl2(0.15mmol)反应2h，得到金属螯合聚苯乙烯纳米球(钴离子螯合聚苯乙烯纳米球)。
实施例4：
羧基化聚苯乙烯纳米球的制备：取0.2g SDS、0.1g Na2CO3溶于装有300mL蒸馏水的三颈烧瓶，搅拌，充氮30min，加入30mL苯乙烯并升温至60℃，搅拌反应30min；加入15mL含0.06g过硫酸钾的热溶液，混匀，在高转速350r/min的状态下反应30min后加入9ml丙烯酸，充氮保护后在75℃、350r/min的条件下反应24h，取出，采用无水乙醇、水于交替洗涤数次，在60℃下真空干燥12h，得到粉末状乳白色羧基化聚苯乙烯纳米球。
金属螯合聚苯乙烯纳米球的制备：取200mg羧基化聚苯乙烯纳米球加入至30ml含3mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中，反应2h，活化聚苯乙烯纳米球表面的羧基；再加入15ml 6mM氨三乙酸溶液(氨三乙酸溶于20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液)，继续反应12h，形成氨三乙酸修饰的聚苯乙烯纳米球，加入过量ZnCl2(0.15mmol)(以氯化锌溶液的形式加入，溶剂为水，50mL)反应2h，得到金属螯合聚苯乙烯纳米球(锌离子螯合聚苯乙烯纳米球)。
实施例5：
取10mg实施例1制备的铜离子螯合的聚苯乙烯纳米球加入到0.5mL大肠杆菌细胞裂解液中，反应2h，离心分离得上清液，再依次用10、25、50、100、200、300mM咪唑进行洗脱，得不同咪唑浓度的洗脱液。对所得细胞裂解液、上清液和咪唑洗脱液进行SDS凝胶电泳分析。结果表明铜离子螯合的聚苯乙烯纳米球对生物复杂体系中蛋白质纯化度较高，当用不同咪唑溶液进行梯度洗脱时，几乎只有目标蛋白被洗脱下来。
实施例6：
取10mg实施例2制备的镍离子螯合的聚苯乙烯纳米球加入到0.5mL大肠杆菌细胞裂解液中，反应2h，离心分离得上清液，再依次用10、25、50、100、200、300mM咪唑进行洗脱，得不同咪唑浓度的洗脱液。对所得细胞裂解液、上清液和咪唑洗脱液进行SDS凝胶电泳分析。结果表明镍离子螯合的聚苯乙烯纳米球对生物复杂体系中蛋白质纯化度较高，当用不同咪唑溶液进行梯度洗脱时，几乎只有目标蛋白被洗脱下来。SDS凝胶电泳分析结果见图2。
图2为实施例6中镍离子螯合聚苯乙烯纳米球分离纯化蛋白的SDS凝胶电泳分析图。
实施例7：
取10mg实施例3制备的钴离子螯合的聚苯乙烯纳米球加入到0.5mL大肠杆菌细胞裂解液中，反应2h，离心分离得上清液，再依次用10、25、50、100、200、300mM咪唑进行洗脱，得不同咪唑浓度的洗脱液。对所得细胞裂解液、上清液和咪唑洗脱液进行SDS凝胶电泳分析。结果表明钴离子螯合的聚苯乙烯纳米球对生物复杂体系中蛋白质纯化度较高，当用不同咪唑溶液进行梯度洗脱时，几乎只有目标蛋白被洗脱下来。
实施例8：
取10mg实施例4制备的锌离子螯合的聚苯乙烯纳米球加入到0.5mL大肠杆菌细胞裂解液中，反应2h，离心分离得上清液，再依次用10、25、50、100、200、300mM咪唑进行洗脱，得不同咪唑浓度的洗脱液。对所得细胞裂解液、上清液和咪唑洗脱液进行SDS凝胶电泳分析。结果表明锌离子螯合的聚苯乙烯纳米球对生物复杂体系中蛋白质纯化度较高，当用不同咪唑溶液进行梯度洗脱时，几乎只有目标蛋白被洗脱下来。
实施例9：
取20mg实施例2制备的镍离子螯合的聚苯乙烯纳米球加入到0.5mL大肠杆菌细胞裂解液中，反应2h，离心分离得纳米球与蛋白质复合物沉淀；同时将5mL大肠杆菌细胞裂解液渗过传统镍柱得到结合上蛋白质的镍柱。两者均用蒸馏水离心洗涤3次，再依次用100、500mM咪唑进行洗脱，得到两者的100、500mM咪唑洗脱液。用所得细胞裂解液和咪唑洗脱液进行SDS凝胶电泳分析。结果表明镍离子螯合聚苯乙烯纳米球和传统镍柱均能从生物复杂体系分离纯化出目标蛋白，但传统镍柱的咪唑洗脱液除了目标蛋白电泳带，还存在许多其他杂蛋白条带，而镍离子螯合聚苯乙烯纳米球的咪唑洗脱液几乎只有目标蛋白条带。因此镍离子螯合聚苯乙烯纳米球的纯化效果明显比传统镍柱更好。SDS凝胶电泳分析结果见图3。图3为实施例9中镍离子螯合聚苯乙烯纳米球与传统镍柱分离纯化蛋白的SDS凝胶电泳分析图。

Claims (7)

1.一种金属螯合聚苯乙烯纳米球在蛋白质的分离纯化领域中的应用，其特征在于：所述金属螯合聚苯乙烯纳米球的制备方法，包括以下步骤：
(1)羧基化聚苯乙烯纳米球的制备；
(2)将羧基化聚苯乙烯纳米球进行羧基活化，随后加入金属螯合剂进行反应，获得螯合剂修饰的纳米球；将螯合剂修饰的纳米球与金属盐反应，获得金属螯合聚苯乙烯纳米球；
所述金属盐为溶于水的金属盐，具体包括铜盐，锌盐，钴盐或镍盐中的一种以上；
所述金属螯合剂为氨三乙酸及其盐，乙二胺四乙酸及其盐，二亚乙基三胺五乙酸及其盐中一种以上；
所述金属螯合剂的用量为羧基化聚苯乙烯纳米球质量的1～10％；所述金属盐的用量为羧基化聚苯乙烯纳米球中羧基摩尔量的1倍以上；所述羧基活化是指采用活化剂进行活化，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-N-羟基琥珀酰亚胺；
在进行羧基活化时，将活化剂与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合，配成混合溶液使用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述铜盐为氯化铜、硫酸铜或硝酸铜；所述锌盐为氯化锌、硫酸锌或硝酸锌；所述钴盐为氯化钴；所述镍盐为氯化镍。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：加入金属螯合剂进行反应的反应时间12～24h，反应温度为20～30℃；
螯合剂修饰的纳米球与金属盐反应的时间为1～12h。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述羧基活化的时间为1～4h。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述羧基化聚苯乙烯纳米球通过以下方法制备：
在保护性氛围以及含有乳化剂的水中，将苯乙烯在碱性条件下进行加热搅拌，随后加入引发剂反应，再加入丙烯酸类单体聚合反应，后续处理，获得羧基化聚苯乙烯纳米球；
所述加热搅拌的时间为20～35min，加热搅拌的温度为50～70℃；
所述加入引发剂反应的时间为20～35min，加入引发剂反应的温度为50～70℃；
聚合反应的时间为12～48h，聚合反应的温度为60～90℃。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述丙烯酸类单体为丙烯酸或甲基丙烯酸；
所述乳化剂为十二烷基硫酸钠；所述引发剂为过硫酸钾；所述碱性条件是指在水中加入碳酸钠。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述乳化剂的质量与苯乙烯的体积比为(0.3～1.5)g:100mL，引发剂的质量与苯乙烯的体积比为(0.05～1)g：100mL，丙烯酸类单体的用量为苯乙烯体积用量的10～80％。
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