CN102492075A

CN102492075A - 具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球及制备方法

Info

Publication number: CN102492075A
Application number: CN2011104061689A
Authority: CN
Inventors: 王冬梅; 徐亮; 赵海峰
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2012-06-13

Abstract

本发明涉及一种具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球及制备方法。以苯乙烯和丙烯酸作为混合单体，水为反应媒介，过硫酸钾为引发剂，十二烷基磺酸钠为乳化剂，采用乳液聚合的方法制备纳米级羧化聚苯乙烯微球A。在偶联剂EDC和Sulfo NHS的存在下，将4-氨基丁酸、6-氨基己酸或8-氨基辛酸连接到微球的表面，制备得到具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球。在纳米微球的表面引入了间隔臂，降低了偶联大分子的空间位阻，提高了大分子的活性和利用率，减少了大分子与聚苯乙烯微球的非特异性相互作用。同时该微球的粒径通过调节乳化剂的用量，间隔臂的长度和表面密度也可以调节。因此，该纳米微球作为载体和模板在免疫诊断和固相萃取等领域拥有广阔的应用前景。

Description

具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球及制备方法

技术领域

本发明属于新型纳米材料制备领域，主要涉及一种具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球及制备方法。

背景技术

高分子微球由于具有球形度好、尺寸小、比表面积大和表面易于通过共聚、改性等方式赋予多种功能基团等特点，在医疗和医学、生物化学和新型材料等领域具有非常广泛的应用。特别是应用在生物科学领域，对临床诊断，检验，免疫技术，细胞学等的研究具有重要意义(江兵兵，张洪涛，分散聚合法制备微米级聚苯乙烯微球[J]胶体与聚合物，2000，18(4)：31)自从70年代以来，众多的研究者已经开发出乳液聚合、微乳液聚合、分散聚合和悬浮聚合等多种行之有效的微球制备方法。乳液聚合是进行微球设计和合成的主要手段之一，可以制备得到粒径小于0.5μm且分布均匀的单分散型微球。可以很好的适应多种需求。

苯乙烯是一种常见的有机单体，价廉易得，同时具有很成熟的制备工艺，可以通过控制制备条件得到不同粒径的聚苯乙烯微球。但是由于苯乙烯中苯环的反应活性低，且对生物大分子具有很强的非特异性吸附作用，限制了聚苯乙烯微球在生物科学领域的应用。通过将苯乙烯与其他有机单体共聚的方法可以在微球的表面引入反应活性强的基团，提高共聚微球的反应活性和应用范围，同时也能克服苯乙烯的非特异性吸附作用。陈建定等人采用苯乙烯和丙烯酸共聚的方法制备了羧基化聚苯乙烯微球(公开号CN 1793187A)，在聚苯乙烯微球的表面引入了羧基基团。王娟等采用苯乙烯与聚乙二醇200二甲基丙双烯酸酯交联共聚的方法，制备得到了粒径在3μm左右，表面富集羟基的聚苯乙烯微球(公开号CN 1603348A)。这些活性强的基团的引入，大大增加了聚苯乙烯微球的反应活性，可以在其表面偶联蛋白质等生物大分子。吕军等在羧基化聚苯乙烯微球的表面交联C反应蛋白的抗体(申请号201010192601.9)，用于医学免疫检测。

蛋白质等生物大分子由于具有很大的分子量以及一定的空间结构，因此都具有较大的分子体积。在以微球为载体的表面偶联生物大分子时，必然会造成一定的空间位阻，从而影响生物大分子的偶联率和生物活性。以上研究所制备的各种粒径和具有不同表面基团的聚苯乙烯微球都不能克服这种缺陷。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有间隔臂的羧基化纳米级聚苯乙烯微球的制备方法。以本方法可以制备具有间隔臂的羧基化纳米微球，其结构式如下图，其中n取不同的值时(n＝1-5)可以调节间隔臂的长度。间隔臂在空间的伸展可以降低偶联生物大分子时的空间位阻，提高大分子的偶联率和活性利用率，同时降低大分子与微球表面的非特异性相互作用。微球的粒径和分布，以及表面的羧基密度都可以调控，可以很好的适应不同的需求，同时制备的微球具有很好的单分散性和长期稳定性。

本发明是通过下述技术方案加以实现的。

本发明的一种具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球，结构式如下：

其中A为羧化聚苯乙烯微球；n＝1-5，偶联间隔臂后微球的粒径为40-300nm。

本发明的微球的制备方法，步骤为：

(1)乳液聚合：配制浓度为0.05％-0.3％的过硫酸钾水溶液，加入浓度为0.006％-0.2％十二烷基磺酸钠(SDS)，超声使SDS完全溶解得到乳液聚合反应的水相；加入苯乙烯和丙烯酸的混合单体，混合单体中苯乙烯的加入量占90％-99.5％，丙烯酸的入量占0.5％-10％，混合单体的总质量与得到的水相质量比1∶9；通入氮气除去氧气，在振荡器上乳化30min后；置于恒温水浴振荡器中，在60-80℃，在200转/min的转速下反应10-24h，制备得到无间隔臂的羧基化聚苯乙烯微球A；

(2)微球表面活化：取步骤(1)透析好的纳米微球A，用电位滴定法测定微球羧基密度，分别加入与测得的羧基密度等量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo NHS)，室温反应20-60min，将微球表面的羧基活化；

(3)偶联间隔臂分子：向(2)制得的微球中加入间隔臂分子，其加入量为微球羧基密度的1-3倍，37℃反应3-12h；反应结束后，以水为透析液，将剩余的反应物透析除去，收集此纳米微球，于4℃保存。

所述的间隔臂分子为4-氨基丁酸、6-氨基己酸或8-氨基辛酸。

本发明的苯乙烯最好进行预处理，将苯乙烯用5％NaOH溶液洗涤四次，然后用蒸馏水洗涤苯乙烯至中性，分去水层，加入无水氯化钙干燥过夜；经减压蒸馏后得到精制的苯乙烯，于4℃保存备用。

首先采用乳液聚合的方法制备得到无间隔臂的羧基化聚苯乙烯微球(步骤1)，然后用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(SulfoNHS)将微球表面活化(步骤2)，最后将具有一定链长的间隔臂分子偶联到微球的表面，制备得到具有间隔臂的羧基化聚苯乙烯微球(步骤3)。

本发明的关键技术说明如下：

本发明涉及一种具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球及制备方法。以苯乙烯和丙烯酸作为混合单体，水为反应媒介，过硫酸钾为引发剂，十二烷基磺酸钠为乳化剂，采用乳液聚合的方法制备纳米级羧化聚苯乙烯微球。在偶联试剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo NHS)的存在下，将具有一定链长的分子(如4-氨基丁酸、6-氨基己酸、8-氨基辛酸)连接到微球的表面，制备得到具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球。该制备工艺在纳米微球的表面引入了间隔臂，降低了偶联大分子的空间位阻，提高了大分子的活性和利用率，减少了大分子与聚苯乙烯微球的非特异性相互作用。同时该微球的粒径通过调节乳化剂的用量，可以实现在一定范围内的可控制备(50-300nm)，间隔臂的长度和表面密度也可以调控。因此，该纳米微球作为载体和模板在免疫诊断和固相萃取等领域拥有广阔的应用前景。

通过实验确定SDS用量的调节。SDS的用量影响到纳米微球的粒径和粒度分布。通过调节SDS的用量可以调节微球的粒径为40-300nm。通过实验确定苯乙烯和丙烯酸的配比。苯乙烯和丙烯酸的配比将影响到纳米微球的羧基密度，进而影响间隔臂的密度。同时丙烯酸具有两亲性，其加入量会影响微球的粒径和单分散性。随着丙烯酸用量的增加，纳米微球的羧基密度逐渐增大，同时微球的粒径将减小。采用水浴摇床进行聚合反应，与传统的机械搅拌相比，水浴摇床反应条件更温和，有利于制备单分散的粒径分布窄，球性度好的纳米微球。通过实验确定对间隔臂链长的调控。通过使用碳原子数不同的间隔臂分子(如4-氨基丁酸、6-氨基己酸、8-氨基辛酸等)，可以制备具有不同链长的间隔臂，进而，更好的适应实际的需要。

本发明提供的制备工艺与现有的技术相比，其明显的优势在于，制备所用仪器设备简单经济；粒径可调且单分散性好；表面羧基密度可以调节，进而可以调节间隔臂的密度；制备的纳米微球具有间隔臂，可以大大降低抗体等生物大分子偶联的空间位阻，提高生物分子的偶联率和利用率，减弱大分子与聚苯乙烯微球表面的非特异性相互作用。间隔臂末端为羧基基团，可以与含有氨基、羟基等分子发生反应，克服了聚苯乙烯微球反应活性低的缺点，扩大了此纳米微球的应用范围，在免疫检测和诊断、固相萃取等方面拥有广泛的应用前景。

附图说明

图1平均粒径为296nm的微球的粒度分布图；

图2羧化聚苯乙烯微球偶联间隔臂前后红外光谱对照图(A无间隔臂羧化聚苯乙烯微球；B偶联间隔臂的羧化聚苯乙烯微球)；

图3平均粒径为133nm的微球透射电镜照片；

图4平均粒径为133nm的微球的粒度分布图；

图5平均粒径为43.3nm的微球的粒度分布图。

具体实施方式

实施例1：

将苯乙烯用5％NaOH溶液洗涤四次，然后用蒸馏水洗涤苯乙烯至中性，分去水层，加入无水氯化钙干燥过夜。干燥后的苯乙烯经减压蒸馏后放置于4℃冰箱中保存。配制浓度为0.05％的过硫酸钾(KPS)水溶液，移取40ml的过硫酸钾溶液加入到250ml的三角瓶中，加入0.0024g(0.006％)十二烷基磺酸钠(SDS)，待SDS完全溶解后，加入苯乙烯和丙烯酸的混合单体共4ml(混合单体与水相的质量比为1∶9)，其中苯乙烯为3.6ml，丙烯酸为0.4ml。通入氮气10分钟，以除去氧气，然后在振荡器上乳化30min。将此三角瓶置于60℃恒温水浴振荡器中，200转/min的转速下反应10h，制备得到无间隔臂的羧基化聚苯乙烯微球A。将制备得到的纳米微球置于透析袋中，用蒸馏水透析3天，以除去反应中剩余的反应物。精密收集透析好的微球溶液，并精密量取该溶液10ml，用0.1M NaOH为滴定液按电位滴定法测定其表面羧基密度为：0.825mmol/g(干球)。取透析好的上述纳米微球20ml置于三角瓶中，分别加入的0.158g(0.825mmol)EDC和0.179g(0.825mmol)sulfo NHS，水浴摇床中，37℃反应60min，使微球表面的羧基全部反应。然后向其中加入的0.294g 4-氨基丁酸(加入量为羧基密度的3倍)，反应12h。反应结束后，以水为透析液透析3天，将剩余的反应物透析除去，收集此纳米微球，保存于4℃冰箱中。用粒度分析仪测定其粒径及粒度分布，测定其平均粒径为296nm，粒径分布系数(pdI)为0.021(图1)。采用红外光谱法测定了具有间隔臂的羧化微球的结构并与偶联间隔臂前的微球的结构进行了比较(图2)，从红外光谱图中可以清晰的看到接入间隔臂分子后，1630cm^-1处出现了一个尖锐的吸收峰，此吸收峰为酰胺Ⅰ带，1600cm^-1处为氨基酸上羧酸中羰基的吸收峰，而偶联间隔臂前羧酸羰基吸收峰出现在1710cm^-1处，同时在1130cm^-1处出现了C-N单键的伸缩振动吸收峰，以上结果有力的证明了间隔臂的成功引入。微球的结构式为：

实施例2：

将苯乙烯用5％NaOH溶液洗涤四次，然后用蒸馏水洗涤苯乙烯至中性，分去水层，加入无水氯化钙干燥过夜。干燥后的苯乙烯经减压蒸馏后放置于4℃冰箱中保存。配制浓度为0.1％的过硫酸钾(KPS)水溶液，移取40ml的过硫酸钾溶液加入到250ml的三角瓶中，加入0.016g(0.04％)十二烷基磺酸钠(SDS)，待SDS完全溶解后，加入苯乙烯和丙烯酸的混合单体共4ml(混合单体与水相的质量比为1∶9)，其中苯乙烯为3.8ml，丙烯酸为0.2ml。通入氮气10分钟，以除去氧气，然后在振荡器上乳化30min。将此三角瓶置于70℃恒温水浴振荡器中，200转/min的转速下反应16h，制备得到无间隔臂的羧基化聚苯乙烯微球A。将制备得到的纳米微球置于透析袋中，用蒸馏水透析3天，以除去反应中剩余的反应物。精密收集透析好的微球溶液，并精密量取该溶液10ml，电位滴定法测定其表面羧基密度为：0.284mmol/g_(干球)。取透析好的上述纳米微球20ml置于三角瓶中，分别加入的54mg(0.284mmol)EDC和62mg(0.284mmol)sulfo NHS，水浴摇床中，37℃反应30min，使微球表面的羧基全部反应。然后向其中加入的75mg 6-氨基己酸(加入量为羧基密度的2倍)，反应6h。反应结束后，以水为透析液透析3天，将剩余的反应物透析除去，收集此纳米微球，保存于4℃冰箱中。取少量微球在透射电子显微镜下观测其形貌，参见图3，用粒度分析仪测定其微球粒径及粒度分布，测得平均粒径为133nm，粒径分布系数(pdI)为0.017(图4)。

实施例3：

将苯乙烯用5％NaOH溶液洗涤四次，然后用蒸馏水洗涤苯乙烯至中性，分去水层，加入无水氯化钙干燥过夜。干燥后的苯乙烯经减压蒸馏后放置于4℃冰箱中保存。配制浓度为0.3％的过硫酸钾(KPS)水溶液，移取40ml的过硫酸钾溶液加入到250ml的三角瓶中，加入0.08g(0.2％)十二烷基磺酸钠(SDS)，待SDS完全溶解后，加入苯乙烯和丙烯酸的混合单体共4ml(混合单体与水相的质量比为1∶9)，其中苯乙烯为3.98ml，丙烯酸为0.02ml。通入氮气10分钟，以除去氧气，然后在振荡器上乳化30min。将此三角瓶置于80℃恒温水浴振荡器中，200转/min的转速下反应24h，制备得到无间隔臂的羧基化聚苯乙烯微球A。将制备得到的纳米微球置于透析袋中，用蒸馏水透析3天，以除去反应中剩余的反应物。精密收集透析好的微球溶液，并精密量取该溶液10ml，电位滴定法测定其表面羧基密度为：0.030mmol/g_(干球)。取透析好的上述纳米微球20ml置于三角瓶中，分别加入的5.8mg(0.030mmol)EDC和6.5mg(0.030mmol)sulfo NHS，水浴摇床中，37℃反应20min，使微球表面的羧基全部反应。然后向其中加入的4.8mg 8-氨基辛酸(加入量为羧基密度的1倍)，37℃反应3h。反应结束后，以水为透析液透析3天，将剩余的反应物透析除去，收集此纳米微球，保存于4℃冰箱中。取少量微球用粒度分析仪测定其粒径及粒度分布，结果参见图5，由图可知平均粒径为43.3nm，粒径分布系数(pdI)为0.056。其结构式为：

Claims

1.一种具有间隔臂的纳米级羧化聚苯乙烯微球，其特征是结构式如下：

2.如权利要求所述的微球的制备方法，其特征是步骤为：

(1)乳液聚合：配制浓度为0.05％-0.3％的过硫酸钾水溶液，加入浓度为0.006％-0.2％十二烷基磺酸钠，超声使十二烷基磺酸钠完全溶解得到乳液聚合反应的水相；加入苯乙烯和丙烯酸的混合单体，混合单体中苯乙烯的加入量占90％-99.5％，丙烯酸的加入量占0.5％-10％，混合单体的总质量与得到的水相质量比1∶9；通入氮气除去氧气，在振荡器上乳化30min后；置于恒温水浴振荡器中，在60-80℃，在200转/min的转速下反应10-24h，制备得到无间隔臂的羧基化聚苯乙烯微球A；

(2)微球表面活化：取步骤(1)透析好的纳米微球A，用电位滴定法测定微球羧基密度，分别加入与测得的羧基密度等量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应20-60min，将微球表面的羧基活化；

3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的间隔臂分子为碳原子数为4-8个，带有氨基和羧基的化合物(如4-氨基丁酸、6-氨基己酸或8-氨基辛酸)。

4.如权利要求2所述的方法，其特征是苯乙烯进行预处理，将苯乙烯用5％NaOH溶液洗涤四次，然后用蒸馏水洗涤苯乙烯至中性，分去水层，加入无水氯化钙干燥过夜；经减压蒸馏后得到精制的苯乙烯，于4℃保存备用。