CN110433738A - 抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，其制备方法及储存方法 - Google Patents

抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，其制备方法及储存方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，其制备方法及储存方法，所述制备方法包括：(1)向缓冲液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及催化剂使充分反应，得到反应液；(2)将步骤(1)所述反应液先超声使混合均匀，然后加热回流，完毕后离心洗涤，即得所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球。本发明所述方法制备得到的抗非特异性结合的聚苯乙烯微球表面被不同长短的葡聚糖链致密包覆而残留活性基团极少，聚苯乙烯微球表面裸露面积大幅降低，相比现有其它方法制备的表面改性处理的聚苯乙烯微球，本发明对非特异性抗体以及活性物质的吸附量显著降低，因而极大地提高了特异性结合分析信号的可信度。

Description

抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，其制备方法及储存方法
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，其制备方法及储存方法。
背景技术
聚苯乙烯微球和抗体偶联的方式主要有两种：一种为使用化学偶联剂在功能化(羧基/氨基/醛基等)与抗体之间产生共价键结合，另一种为物理吸附的方法，依靠静电力使抗体吸附到聚苯乙烯微球表面。但这两种方法都避免不了聚苯乙烯微球表面对非特异性抗体或其他活性物质的化学或物理吸附。非特异性物质的吸附对于下游检测结果有很大的干扰，造成聚苯乙烯微球表面的抗体结合量减少，后期检测信号不真实等问题。
虽然现有技术已有公开通过在聚苯乙烯微球表面进行改性处理，从而获得低的非特异性结合的聚苯乙烯微球的方法，但是目前的方法对工艺条件要求比较高，且表面处理效果仍不是特别理想，使得聚苯乙烯微球表面存在较多残留活性基团以及裸露面积，导致蛋白质等物质非特异性吸附，从而影响特异性结合抗体的检测信号。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，其制备方法及储存方法，所述制备方法能够显著减少聚苯乙烯微球表面活性基团及物理吸附位点，降低非特异性吸附，从而提高特异性抗体结合检出信号的可信度，对于实际应用有极其重要的意义。
本发明的技术方案为：
一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)向缓冲液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及催化剂使充分反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)所述反应液先超声使混合均匀，然后加热回流，完毕后离心洗涤，即得所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球。
优选地，步骤(1)中，所述缓冲液为DMSO的PBS溶液，所述缓冲液的pH值为7.4-9.0，所述缓冲液中DMSO的浓度为60-100mmol/L；所述葡聚糖为聚合度分别为5000、10000、40000以及80000的葡聚糖中的任意两种以上的混合物；所述催化剂为叔胺类碱性物质。本发明通过调控不同聚合度的葡聚糖的比例，使得聚苯乙烯微球表面接枝不同长短的葡聚糖链，从而降低聚苯乙烯微球表面裸露面积，同时增加聚苯乙烯微球的空间位阻，减少非特异性物质的物理吸附。
优选地，所述葡聚糖为聚合度分别为10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比3-6:1-3:2-8组成的混合物，该比例下，聚苯乙烯微球表面包覆最为致密，此时微球表面裸露面积最小，非特异性物质的物理吸附最少；所述催化剂为三丁胺、三甲胺、十二烷基二甲基胺、十六烷基二甲基胺、十二烷基苄基甲基胺以及N-甲基二环己胺中的任意一种。
优选地，所述环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及催化剂之间的摩尔比为0.5-1:0.9-2.0:0.1-0.3，此比例下，葡聚糖的用量相对于环氧聚苯乙烯微球过量，因而能够极大的减少环氧聚苯乙烯微球表面残留活性基团及裸露表面，进而减少非特异性结合几率。
优选地，步骤(1)中，所述反应的时间为4-20h，整个反应在pH值为7.4-9.0的条件下进行。
优选地，步骤(2)中，所述超声的频率为50-300w，所述超声的时间为10-30min。
优选地，步骤(2)中，所述加热回流的温度为90-100℃，所述加热回流的时间为10-24h。
优选地，步骤(2)中，进行所述离心洗涤3-5次，所述离心洗涤为先加入60±5℃的水，超声使混合均匀，然后离心去除上清液，进行所述离心洗涤至上清液为中性。在本发明中，如果使用常温或者低于50℃的温水洗涤，会有葡聚糖析出。
所述方法制备得到的抗非特异性结合的聚苯乙烯微球。
所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的储存方法，具体步骤为：将抗非特异性结合的聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％的十二烷基硫酸钠(简称SDS)水溶液中，即得。
本发明的有益效果为：
本发明所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，以环氧聚苯乙烯微球和葡聚糖为原料，在催化剂和一定碱性条件下反应制备得到。本发明制备方法中，通过调控不同聚合度的葡聚糖的组成比例、葡聚糖的聚合度大小、葡聚糖的聚合度分布以及环氧聚苯乙烯微球与葡聚糖之间的用量比例，使得最终制备得到的抗非特异性结合的聚苯乙烯微球表面被不同长短的葡聚糖链致密包覆而残留活性基团极少，聚苯乙烯微球表面裸露面积大幅降低，相比现有其它方法制备的表面改性处理的聚苯乙烯微球，本发明对非特异性抗体以及活性物质的吸附量显著降低，因而极大地提高了特异性结合分析信号的可信度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)向pH值为7.4，浓度为60mmol/L DMSO的PBS溶液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及三丁胺使充分反应4h，得到反应液，所述葡聚糖为聚合度分别为10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比3:1:2组成的混合物，所述环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及三丁胺之间的摩尔比为1:1.6:0.2；
(2)将步骤(1)所述反应液先以100w的功率超声30min使混合均匀，然后90℃油浴回流24h，完毕后先加入55℃的水，超声使混合均匀，然后离心去除上清液，如此离心洗涤3次，上清液呈中性，得到抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，将所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％的SDS水溶液中，即得。
实施例2
本实施例提供一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)向pH值为9.0，浓度为100mmol/L DMSO的PBS溶液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及三甲胺使充分反应20h，得到反应液，所述葡聚糖为聚合度分别为10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比6:3:8组成的混合物，所述环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及三甲胺之间的摩尔比为1:1.5:0.1；
(2)将步骤(1)所述反应液先以200w的功率超声20min使混合均匀，然后100℃油浴回流10h，完毕后先加入65℃的水，超声使混合均匀，然后离心去除上清液，如此离心洗涤5次，上清液呈中性，得到抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，将所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％的SDS水溶液中，即得。
实施例3
本实施例提供一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)向pH值为8.0，浓度为70mmol/L DMSO的PBS溶液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及十二烷基二甲基胺使充分反应12h，得到反应液，所述葡聚糖为聚合度分别为10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比3.5:1:2.8组成的混合物，所述环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及十二烷基二甲基胺之间的摩尔比为0.5:2.0:0.3；
(2)将步骤(1)所述反应液先以300w的功率超声20min使混合均匀，然后90℃油浴回流20h，完毕后先加入60℃的水，超声使混合均匀，然后离心去除上清液，如此离心洗涤5次，上清液呈中性，得到抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，将所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％的SDS水溶液中，即得。
实施例4
本实施例提供一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)向pH值为8.5，浓度为70mmol/L DMSO的PBS溶液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及十二烷基苄基甲基胺使充分反应18h，得到反应液，所述葡聚糖为聚合度分别为10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比5:2:3组成的混合物，所述环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及十二烷基苄基甲基胺之间的摩尔比为0.5:0.9:0.2；
(2)将步骤(1)所述反应液先以50w的功率超声30min使混合均匀，然后90℃油浴回流15h，完毕后先加入60℃的水，超声使混合均匀，然后离心去除上清液，如此离心洗涤3次，上清液呈中性，得到抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，将所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％的SDS水溶液中，即得。
实施例5
本实施例提供一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)向pH值为7.6，浓度为90mmol/L DMSO的PBS溶液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及十六烷基二甲基胺使充分反应16h，得到反应液，所述葡聚糖为聚合度分别为5000、10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比3:2:1:2组成的混合物，所述环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及十六烷基二甲基胺之间的摩尔比为1:1.8:0.2；
(2)将步骤(1)所述反应液先以300w的功率超声10min使混合均匀，然后90℃油浴回流12h，完毕后先加入60℃的水，超声使混合均匀，然后离心去除上清液，如此离心洗涤5次，上清液呈中性，得到抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，将所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％的SDS水溶液中，即得。
对比例1
与实施例1的区别仅在于加入的葡聚糖为聚合度为40000的单一聚合度葡聚糖。
对比例2
与实施例1的区别仅在于加入的葡聚糖为聚合度分别为20000、40000以及80000的葡聚糖按质量比3:1:2组成的混合物。
对比例3
与实施例1的区别仅在于加入的葡聚糖为聚合度分别为10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比3:3:1组成的混合物。
对比例4
与实施例1的区别仅在于加入的环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及三丁胺之间的摩尔比为1:0.5:0.1。
实验例
1、实验原理
聚苯乙烯微球(简称ps微球)表面通过非特异性吸附IgG，利用碱性条件下IgG与FITC能生成稳定结合物，从而使ps微球带荧光这一特点。向非特异性吸附后的ps微球中加入FITC荧光标记物，然后通过测试相对荧光强度，即可确定ps微球表面非特异性吸附IgG的相对含量，相对荧光强度越大，非特异性吸附越多，相对荧光强度越小，非特异性吸附越少。
2、实验步骤
分别取1mg未修饰ps微球、实施例1～5以及对比例1～4制备得到的抗非特异性结合的聚苯乙烯微球，置于浓度为0.1mg/mL的IgG溶液中，于37℃保存4h，然后离心分离取沉淀，将沉淀分散于水中，并加入FITC荧光标记物。
3、检测方法
通过全自动化学发光测定仪分别检测未修饰ps微球、各实施例以及对比例抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的相对荧光强度。
4、实验结果见表1
表1相对荧光强度检测结果
组别 未修饰ps 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
相对荧光强度 6000 650 400 320 1280
组别 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
相对荧光强度 220 180 210 205 186
5、结果分析
结果表明，本发明制备得到的抗非特异性结合的聚苯乙烯微球较对比例具有更明显的降低非特异性吸附效果，各对比例抗非特异性结合效果由强至弱依次为对比例3>对比例2>对比例1>对比例4，进一步分析认为，在本发明提供的实验条件范围内，影响抗非特异性吸附效果的因素由大到小依次为不同聚合度的葡聚糖的组成比例、葡聚糖的聚合度大小、葡聚糖的聚合度分布以及环氧聚苯乙烯微球与葡聚糖之间的用量比例。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向缓冲液中依次加入环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及催化剂使充分反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)所述反应液先超声使混合均匀，然后加热回流，完毕后离心洗涤，即得所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述缓冲液为DMSO的PBS溶液，所述缓冲液的pH值为7.4-9.0，所述缓冲液中DMSO的浓度为60-100mmol/L；所述葡聚糖为聚合度分别为5000、10000、40000以及80000的葡聚糖中的任意两种以上的混合物；所述催化剂为叔胺类碱性物质。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖为聚合度分别为10000、40000以及80000的葡聚糖按质量比3-6:1-3:2-8组成的混合物；所述催化剂为三丁胺、三甲胺、十二烷基二甲基胺、十六烷基二甲基胺、十二烷基苄基甲基胺以及N-甲基二环己胺中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述环氧聚苯乙烯微球、葡聚糖以及催化剂之间的摩尔比为0.5-1:0.9-2.0:0.1-0.3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的时间为4-20h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超声的频率为50-300w，所述超声的时间为10-30min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加热回流的温度为90-100℃，所述加热回流的时间为10-24h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，进行所述离心洗涤3-5次，所述离心洗涤为先加入60±5℃的水，超声使混合均匀，然后离心去除上清液，进行所述离心洗涤至上清液为中性。
9.权利要求1-8所述方法制备得到的抗非特异性结合的聚苯乙烯微球。
10.权利要求9所述抗非特异性结合的聚苯乙烯微球的储存方法，其特征在于，具体步骤为：将抗非特异性结合的聚苯乙烯微球分散在浓度为0.25％的十二烷基硫酸钠水溶液中，即得。
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