CN104402003A - 用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法，本发明磁性微球表面含有NHS（N-羟基丁二酰亚胺）基团，无需经EDC/NHS或戊二醛活化，可直接共价偶联含伯氨基的生物配基，具有操作简单、偶联条件温和、生物配基偶联快速高效的优点；此外，NHS通过5～50?的手臂链与微球表面连接，可减少生物配基与目标结合物相互作用时的空间位阻，使生物配基的活性及有效利用率大大提高；本发明NHS修饰磁性微球表面NHS含量为50～1000μmol/g，与现有技术相比具有更高的NHS基团含量，能偶联更多的生物配基，从而提高磁性微球与目标物质的结合量及灵敏度。

Description

用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种磁性微球及其制备方法，具体是一种可与含伯氨基生物配基快速高效偶联的磁性微球及该磁性微球的制备方法，属于生物材料领域。 

背景技术

生物磁性微球是近年发展起来的一项新免疫学技术，其原理包括：首先运用核/壳等方法合成外壳为无机材料、高分子材料、生物大分子等的磁性微球，这些磁性微球具有良好的理化稳定性、生物相容性和超顺磁性，且容易利用荧光等物质进行后期标记；其次利用磁性微球物质表面的功能基团如氨基、羧基、环氧基、醛基、巯基等进行蛋白、抗体、酶、核酸等生物分子的共价偶联或者物理包被，制备成磁性微球免疫试剂；最后经过活性位点封闭便可用于分离纯化、核酸提取、细胞分选、检测诊断等领域。正是因为生物磁性微球将固化试剂的特点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，使得生物磁性微球的应用已经渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域。 

其中，羧基磁性微球的应用最为广泛，其原理是利用磁性微球表面的羧基基团与EDC/NHS反应后，生成NHS活化的磁性微球中间体，继而利用NHS基团与含伯氨基的生物配基共价键结合，最终将含伯氨基的生物配基偶联到羧基磁性微球上。末端含N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydoxysuccinimide，NHS)基团的磁性微球共价结合含伯胺基 团的配基，是制备免疫亲和介质的首选，同时也可偶联特定短肽等小分子配基。NHS磁性微球与配基偶联时速度快、效率高，且NHS基团可使磁性微球和蛋白形成酰胺键，在使用过程中很少发生配基泄露，在pH为13的条件下仍很稳定。 

但现有利用羧基、氨基磁性微球偶联生物分子仍存在不足。如中国专利CN103275217公开了一种利用羧基磁性微球进行的抗体纯化技术，其主要步骤是在MES缓冲液中将羧基磁性微球和SPA蛋白通过EDC/NHS试剂共价键结合，然后利用该材料去纯化抗体；如中国专利CN103323603公开了一种羧基磁性微球表面共价偶联蛋白质的方法，其主要步骤是在MES缓冲溶液中进行羧基磁性微球表面的活化，得到NHS活化磁性微球后再与蛋白质结合，最后将残余的NHS活性基团进行封闭以便后续利用。 

上述羧基磁性微球偶联生物分子之前，必须要使用NHS对磁性微球进行预活化，需对活化条件进行长时间的摸索，这无疑使得羧基磁珠使用不便，操作繁琐，增加产品成本；此外，由于羧基磁性微球进行NHS活化时是在水溶液中进行，而NHS基团在水溶液中非常容易水解，其水解半衰期在1～15min不等，这使得NHS活化基团含量偏低，大大降低生物分子的偶联量。氨基磁性微球在偶联生物配基过程中，也需要事先用戊二醛对氨基进行活化，然后再通过醛基与生物配基上的氨基进行共价偶联，同羧基磁性微球一样，其操作繁琐，使用不方便，且戊二醛的引入有可能会损害某些生物配基的活性。因此开发一种含高密度NHS活化基团，无需活化可直接与含伯氨基生物 分子高效、快速偶联的磁性微球能够为用户使用带来极大的便利性。 

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明提供一种用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球及其制备方法。 

本发明的技术方案是： 

一种用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，所述磁性微球表面含有NHS基团，其结构式如下： 

所述NHS基团与磁性微球表面通过链长的手臂链连接，每克磁性微球表面含有50～1000μmol的NHS基团。 

优选地，所述手臂链为直链或枝链。 

优选地，所述磁性微球包括二氧化硅磁性微球或高分子磁性微球，所述高分子磁性微球包括聚苯乙烯磁性微球、聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、聚苯乙烯共聚甲基丙烯酸缩水甘油醚磁性微球、琼脂糖磁性微球、葡聚糖磁性微球等。 

以上所述任意一种磁性微球的制备方法，包括如下步骤： 

①对磁性微球本体的表面基团进行基团修饰，使其表面最终变为羧基，形成磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球； 

②将①中羧基磁性微球上的羧基在有机溶剂中进行NHS活化， 得到表面含有NHS基团的磁性微球；所述有机溶剂为N,N-二甲基乙酰胺、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇、二甲基亚砜中的一种溶剂或一种以上溶剂所组成的混合溶剂。 

③将②制得的表面含有NHS基团的磁性微球用有机溶剂制成悬浮液进行保存，所述悬浮液的浓度为1mg/mL～100mg/mL，所述有机溶剂包括异丙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺的一种或多种组合。 

优选地，以上步骤②中所述羧基磁性微球上的羧基进行NHS活化，包括如下步骤： 

首先，采用有机溶剂洗涤羧基磁性微球，除去水分； 

其次，除水后的羧基磁性微球依次加入有机溶剂和NHS，室温反应1～48h得到表面含有NHS基团的磁性微球，其中，羧基磁性微球与有机溶剂的固液比为1mg︰0.01mL～1mg︰10mL，羧基磁性微球与NHS质量比为1︰0.1～1︰10。 

优选地，步骤①所述表面基团包括羟基、环氧基、氨基、羧基等。 

优选地，表面基团为羟基时，采用以下方法改性为羧基： 

方法一，当磁性微球本体为二氧化硅磁性微球时，将二氧化硅磁性微球本体分散至有机溶剂中，加入含氨基的硅烷偶联剂对二氧化硅磁性微球进行改性，得到表面基团末端含有氨基的磁性微球，接着将氨基磁性微球与酸酐反应，得到羧基磁性微球； 

所述有机溶剂包括甲苯、异丙醇或乙醇，所述含氨基的硅烷偶联剂包括N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基 -甲基-三甲氧基硅烷、γ-氨丙基-三甲氧基硅烷或γ-氨丙基-三乙氧基硅烷，所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐； 

方法二，当磁性微球本体为磁性琼脂糖或磁性葡聚糖微球时，采用活化试剂对磁性微球本体上的羟基进行活化，再与氨基酸反应得到羧基磁性微球； 

所述活化试剂包括溴化氰、羰基二咪唑、环氧氯丙烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚等，所述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基庚酸。 

优选地，表面基团为环氧基时，将含有环氧基的磁性微球本体在pH为8～11的条件下与氨基酸反应得到羧基磁性微球，所述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基庚酸。 

优选地，表面基团为氨基时，将含有氨基的磁性微球本体与酸酐在pH为5～9的条件下反应，酸化后得羧基磁性微球，所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐； 

或者将表面为氨基的磁性微球在甲醇中与丙烯酸甲酯反应得到丙烯酸甲酯改性的磁性微球，然后将丙烯酸甲酯改性的磁性微球在甲醇中与乙二胺反应得到乙二胺改性的磁性微球，最后将乙二胺改性的磁性微球在pH为5～9的条件下与酸酐反应得到枝化的羧基磁性微球；所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐。 

本发明的有益效果主要体现在： 

⑴减少了空间位阻，提高了有效利用率。本发明在NHS活化基 团与微球表面间加入较长的手臂链，以减少生物配体在使用过程中的空间位阻，使得生物配体的活性和有效利用率更高。 

⑵本发明在油相中进行NHS磁珠制备，与现有水相制备技术相比，其具有更高的NHS活化基团含量，能偶联更多的生物配基，提高了磁性微球与目标物质的结合量以及使用时的灵敏度。 

⑶本发明适用范围较广，可连接任何含有伯氨基的生物配体。 

⑷本发明无需操作者对磁性微球进行预活化，只需将待偶联的生物配基溶解在一定pH值的缓冲溶液中，然后与本发明磁性微球混合1～2h便可轻松将生物配基偶联到磁性微球上，简化了偶联工艺，缩短了偶联时间，操作十分简便。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行说明，所举的实施例仅是对本发明产品或方法作概括性例示，有助于更好地理解本发明，但并不会限制本发明范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 

本发明用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，磁性微球表面含有N-羟基丁二酰亚胺基团(NHS基团)，其与磁性微球表面通过链长 的手臂链连接，每克磁性微球的表面含有50～1000μmol的所述N-羟基丁二酰亚胺基团。由于该N-羟基丁二酰亚胺基团与磁性微球表面间加入的一定长度的手臂链，减少该生物配体与目标结合物相互作用时的空间位阻，使生物配体的活性及有效利用率更高。 

本发明用于偶联含伯氨基生物配体的磁性微球的制备方法，其要 旨是，首先对磁性微球本体的表面基团进行改性或活化，然后将活化后的表面基团与羧基化合物或酸酐化合物反应，形成磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球；最后对羧基磁性微球上的羧基进行NHS活化，得到表面含有NHS基团的磁性微球。该方法在油相中制备，与现有水相中制备技术相比，其具有更高的NHS基团含量，能偶联更多的生物配体，提高了磁性微球与目标物质的结合量，同时引入了较长的手臂链，减少了生物配体与目标物质作用时的空间位阻，使生物配体的活性及有效利用率更高。具体实施例如下： 

[实施例1] 

以二氧化硅磁性微球为基材制备羧基磁性微球 

取二氧化硅磁性微球1g，分散于300mL异丙醇溶剂中，然后加入硅烷偶联剂γ-氨丙基-三乙氧基硅烷0.2mL，80℃水浴条件下，机械搅拌反应3h，结束反应。产物采用磁吸分离，去除液体，最后采用乙醇洗涤数次得到表面为氨基修饰的磁性微球。取氨基修饰的磁性微球1g分散于0.1M NaCl水溶液中，加入6.4g丁二酸酐固体，室温摇床反应5h，结束反应。产物采用磁吸分离，去除液体，最后依次用1M NaCl水溶液、去离子水洗涤数次，得到磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球，反应式如下： 

[实施例2] 

以磁性琼脂糖微球为基材制备羧基磁性微球 

将磁性琼脂糖微球于砂芯滤斗中抽滤，称取抽滤后的磁性琼脂糖微球1g分散于丙酮溶剂中，加入3mL羰基二咪唑(CDI)丙酮溶液，室温垂直混合反应3h，结束反应。得到的产物采用磁吸分离去除液体，用丙酮洗涤数次得CDI活化的磁性琼脂糖微球。取CDI活化的磁性琼脂糖微球1g，分散于10mL去离子水中，然后称取氨基乙酸固体加入其中，使其最终浓度为1mol/L，最后调节pH值为9.0～10.0，室温反应16h，结束反应。得到的固体采用磁吸分离去除液体，依次用去离子水、2M NaCl、去离子水洗涤，得到磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球。 

通过改变加入的羧基改性试剂，如将氨基乙酸改成3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸等可以制备不同手臂链长的羧基磁性微球。 

[实施例3] 

以表面含有环氧基的磁性微球为基材制备羧基磁性微球 

取环氧基磁性微球1g于三口烧瓶中，加入100mL pH为9.6的0.6M氨基己酸溶液，室温下机械搅拌反应8h，结束反应。得到的产物采用磁吸分离去除液体，依次用去离子水、1M NaCl、去离子水交替洗涤数次，得到磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球。 

通过改变加入的羧基改性试剂，如将氨基己酸改成2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、7-氨基庚酸等可以制备不同 手臂链长的羧基磁性微球。 

[实施例4] 

以表面含有氨基的磁性微球为基材制备羧基磁性微球 

取氨基磁性微球1g分散于0.1M NaCl水溶液中，加入6.4g丁二酸酐固体，室温摇床反应5h，结束反应。产物采用磁吸分离，去除液体，最后依次用1M NaCl水溶液、去离子水洗涤数次，得到磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球。 

[实施例5] 

以表面含有氨基的磁性微球为基材制备具有枝链结构的羧基磁性微球 

取氨基磁性微球1g，丙烯酸甲酯54mL，甲醇300mL，室温下机械搅拌反应48h。产物经甲醇洗涤后磁性分离去除溶液得到丙烯酸甲酯改性的磁性微球。将固体转移到反应容器中，加甲醇150mL，乙二胺150mL，室温下机械搅拌反应48h。产物经甲醇洗涤后磁性分离去除溶液得到乙二胺改性的磁性微球。将乙二胺改性的磁性微球依次用100mL去离子水洗和100mL 0.1M NaCl洗涤1次，然后磁性分离去除液体，接着于反应容器中依次加入75mL 0.1M NaCl溶液和4g丁二酸酐，室温下摇床振荡反应5h，结束反应。得到的产物采用磁性分离去除液体，依次用去离子水、1M NaCl、去离子水洗涤数次，如下述反应式所示，得到磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球。 

[实施例6] 

羧基磁性微球进行NHS改性，制备表面含NHS的磁性微球 

取5g手臂链长为的羧基磁性微球，依次用梯度二氧六环溶液洗涤，将磁性微球中的水分洗涤干净。然后后依次加入二氧六环10mL和NHS固体0.17g，室温反应24h，结束反应。反应后的产物用二氧六环、异丙醇洗涤，最后将所得到的表面含有NHS基团的磁性微球保存在异丙醇中。 

按照上述方法，可分别采用手臂链长在范围内的羧基磁性微球为原料，制备手臂链长为表面含有NHS基团的磁性微球。 

[实施例7] 

NHS磁性微球与生物配体偶联 

a.取300μg含伯氨基的生物配体溶解在100μL碳酸缓冲液(pH 8.3)中，配制完后置于4℃冰箱待用； 

b.取10mgNHS磁性微球于离心管中，加入平衡缓冲液快速洗涤1次，磁吸去除上清液； 

c.将a中所配溶液加入b中装有NHS磁性微球的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15s，然后室温旋转混合1～2h，便可将生物配体快速、高效地共价偶联到磁性微球上； 

d.反应结合后，磁性分离去上清液，往离心管中加入pH9.0的3M乙醇胺封闭液，室温旋转混合15min，将未反应的NHS基团淬灭，经保存液洗涤便可得到与生物配体偶联后的最终产品。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和变型，这些改进和变型也应该视为本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.一种用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述磁性微球表面含有NHS基团，其结构式如下：

所述NHS基团与磁性微球表面通过链长的手臂链连接，每克磁性微球表面含有50～1000μmol的NHS基团。

2.根据权利要求1所述的用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述手臂链为直链或枝链。

3.根据权利要求1所述的用于偶联含伯氨基生物配基的磁性微球，其特征在于：所述磁性微球包括二氧化硅磁性微球或高分子磁性微球，所述高分子磁性微球包括聚苯乙烯磁性微球、聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、聚苯乙烯共聚甲基丙烯酸缩水甘油醚磁性微球、琼脂糖磁性微球、葡聚糖磁性微球。

4.权利要求1至3所述任意一种磁性微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

①对磁性微球本体的表面基团进行基团修饰，使其表面最终变为羧基，形成磁性微球本体—手臂链—羧基结构的羧基磁性微球；

②将①中羧基磁性微球上的羧基在有机溶剂中进行NHS活化，得到表面含有NHS基团的磁性微球；

③将②制得的表面含有NHS基团的磁性微球用有机溶剂制成悬浮液进行保存，所述悬浮液的浓度为1mg/mL～100mg/mL。

5.根据权利要求4所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤②中有机溶剂为N,N-二甲基乙酰胺、丙酮、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇、二甲基亚砜中的一种溶剂或一种以上溶剂所组成的混合溶剂，所述步骤③中有机溶剂包括异丙醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺的一种或多种组合。

6.根据权利要求5所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述羧基磁性微球上的羧基进行NHS活化，包括如下步骤：

首先，采用有机溶剂洗涤羧基磁性微球，除去水分；

其次，除水后的羧基磁性微球依次加入有机溶剂和NHS，室温反应1～48h得到表面含有NHS基团的磁性微球，其中，羧基磁性微球与有机溶剂的固液比为1mg︰0.01mL～1mg︰10mL，羧基磁性微球与NHS质量比为1︰0.1～1︰10。

7.根据权利要求4所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：步骤①所述表面基团包括羟基、环氧基、氨基、羧基。

8.根据权利要求7所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：表面基团为羟基时，采用以下方法改性为羧基：

方法一，当磁性微球本体为二氧化硅磁性微球时，将二氧化硅磁性微球本体分散至有机溶剂中，加入含氨基的硅烷偶联剂对二氧化硅磁性微球进行改性，得到表面基团末端含有氨基的磁性微球，接着将氨基磁性微球与酸酐反应，得到羧基磁性微球；

所述有机溶剂包括甲苯、异丙醇或乙醇，所述含氨基的硅烷偶联剂包括N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基-甲基-三甲氧基硅烷、γ-氨丙基-三甲氧基硅烷或γ-氨丙基-三乙氧基硅烷，所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐；

方法二，当磁性微球本体为磁性琼脂糖或磁性葡聚糖微球时，采用活化试剂对磁性微球本体上的羟基进行活化，再与氨基酸反应得到羧基磁性微球；

所述活化试剂包括溴化氰、羰基二咪唑、环氧氯丙烷或1,4-丁二醇二缩水甘油醚，所述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基庚酸。

9.根据权利要求7所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：表面基团为环氧基时，将含有环氧基的磁性微球本体在pH为8～11的条件下与氨基酸反应得到羧基磁性微球，所述氨基酸包括2-氨基乙酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸或7-氨基庚酸。

10.根据权利要求7所述的磁性微球的制备方法，其特征在于：表面基团为氨基时，将含有氨基的磁性微球本体与酸酐在pH为5～9的条件下反应，酸化后得羧基磁性微球，所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐；

或者将表面为氨基的磁性微球在甲醇中与丙烯酸甲酯反应得到丙烯酸甲酯改性的磁性微球，然后将丙烯酸甲酯改性的磁性微球在甲醇中与乙二胺反应得到乙二胺改性的磁性微球，最后将乙二胺改性的磁性微球在pH为5～9的条件下与酸酐反应得到枝化的羧基磁性微球；所述酸酐包括丁二酸酐或戊二酸酐。