CN108659255A - 核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用 - Google Patents
核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种核酸适配体‑分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用。本发明所述的核酸适配体‑分子印迹协同识别磁性微球,包括磁性微球内核和核酸适配体‑分子印迹协同识别外壳,所述核酸适配体‑分子印迹协同识别外壳具有分子印迹聚合物刚性识别空穴,该分子印迹聚合物刚性识别空穴结构稳定、不易变形,特异性吸附强,所述核酸适配体不易酶解。
Description
技术领域
本发明属于化学分析测试技术领域,涉及固相微萃取技术,尤其涉及核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用。
背景技术
样品前处理是样品分析的第一步,也是整个分析过程中的关键步骤,直接影响样品分析的准确度和精密度。样品前处理主要目的在于分离和富集样品中的待测组分,减小基体或杂质干扰,满足后续测试仪器对样品形态、浓度、洁净程度等的要求。传统样品前处理技术如液液萃取、溶剂提取、索氏提取、柱色谱等,普遍存在耗时、低效、有毒有机溶剂用量大或操作较繁琐等问题,导致样品前处理成为整个分析过程中最费时费力的环节,占样品分析时间的60%~70%,同时分析过程中产生的误差至少三分之一来自于样品前处理。因此,急需发展简单、快速、高效、绿色、自动化的样品前处理技术。对于复杂样品如血浆、尿液、动植物组织等而言,由于基体干扰的多样性和复杂性,痕量或超痕量待测组分的分离、富集更为需要的是高亲和力、高选择性的样品前处理技术。
进入二十一世纪以来,日益突出的环境污染问题及民众对食品、药品安全意识的提高使仪器分析技术得到快速发展,仪器灵敏度大幅提高,对测试的样品提出了更高要求,因而样品前处理技术受到了越来越多的关注与重视。一些新的样品前处理技术如微波辅助萃取、加压溶剂萃取、超临界流体萃取、凝胶渗透色谱、吹扫捕集、膜分离、固相萃取、基质固相分散萃取、液相微萃取、固相微萃取等纷纷涌现。其中,固相微萃取由于集采样、萃取、浓缩及进样于一体,具有耗时少、操作简单、效率高、无溶剂或少溶剂、易与色谱仪器联用等优点,成为国内外样品前处理技术领域的研究热点,在环境、生物、食品及药物分析等领域中获得了广泛应用。传统固相微萃取技术采用石英纤维萃取头,操作简便,但石英纤维在使用过程中容易折断,且涂层体积及比表面积较小,使用寿命及萃取容量受到较大限制。为此,国内外研究者们开发了搅拌棒式、毛细管式及磁性微球式固相微萃取技术。其中,磁性微球固相微萃取技术通过在磁性纳米粒子表面包裹涂层材料,所制得的纳米、亚微米级微球具有比表面积大、萃取容量高等特性,且在磁场下可快速、定向分离,操作简便,受到普遍关注。选择性差是目前商品化固相萃取柱存在的主要问题,为了实现特异性吸附,相关研究者选择在吸附剂材料修饰选择性识别功能团如冠醚、杯芳烃、分子印迹聚合物、抗体等。其中具有选择性高、稳定性好、制备简单等特点的分子印迹聚合物(Molecularly imprintedpolymer,MIP)成为固相微萃取涂层材料的研究热点。MIP由于具有类似于酶-底物的“钥匙-锁”相互作用识别原理,选择性有进一步提高。但由于分子印迹技术自身的特点,尚存在极性溶剂干扰、“刚性识别空穴”易被破坏或变形等不足,在生物样品(常以水溶液形式存在)分析中的应用受到较大限制。
核酸适配体是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)经体外筛选得到的一段短的单链寡核苷酸序列(DNA或RNA),基于单链核酸结构和空间构象的多样性,适配体通过链内某些互补碱基间的配对和静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠形成稳定的三维结构,如发夹、假结、凸环、G2四分体等,通过空间构型互补与配体分子高亲和力、高特异性结合。高分辨三维结构研究发现,核酸适配体与配体能通过范德华力、氢键作用、静电作用及形状匹配等各种相互作用产生高特异性的结合力。通过化学改性技术可修饰于固体吸附剂表面,在固相萃取技术中具备极大的应用潜力。
适配体亲和力高、特异性强以及相对于抗体、酶生物大分子识别体系的诸多优点使其在固相微萃取技术方面具有广阔的应用潜力,但有研究结果表明核酸适配体在复杂样品如血浆、尿液中存在酶解问题,限制了其使用寿命,同时纤维状固相微萃取头适配体键合量有限,萃取容量低(小于1ng),制约了方法的应用。
发明内容
针对上述问题,本发明提供一种核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球,具有稳定的分子印迹聚合物刚性识别空穴和强特异性识别、吸附能力,而且其中的核酸适配体稳定性好、不易酶解。
本发明的技术方案如下:
一种核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球,包括磁性微球内核和核酸适配体-分子印迹协同识别外壳,微球内核和核酸适配体-分子印迹协同识别外壳之间通过化学键连接,所述核酸适配体-分子印迹协同识别外壳具有分子印迹聚合物刚性识别空穴。
所述核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备氨基修饰磁性微球:制备Fe3O4微球,并对所得Fe3O4微球进行SiO2包裹,得到SiO2/Fe3O4微球,然后加入氨基硅烷化试剂对SiO2/Fe3O4微球进行氨基改性,得到氨基修饰磁性微球;
(2)制备核酸适配体修饰磁性微球:将步骤(1)所得的氨基修饰磁性微球分散于缓冲溶液中,加入EDC/NHS溶液活化,然后加入核酸适配体溶液,振荡反应,得到核酸适配体修饰磁性微球;
(3)制备核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球:将步骤(2)所得的核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中,加入模板分子及功能单体,振荡孵育;然后加入交联剂及引发剂,在无氧条件下进行自由基聚合反应,得到核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球;
(4)制备核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球:采用洗脱溶剂洗脱除去步骤(3)所得微球中的模板分子,形成分子印迹聚合物刚性识别空穴,得到核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球。
进一步,在步骤(1)中,所述的氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷;所述的氨基硅烷化试剂与SiO2/Fe3O4微球的摩尔比为25:1~75:1。
进一步,在步骤(2)和步骤(3)中,所述的缓冲溶液为Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液,其pH值为4.5~8.5。优选地,所述Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.5。
进一步,在步骤(2)中,所述EDC/NHS溶液中的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的摩尔比为4:1~1:4。优选地,所述EDC/NHS溶液中的EDC与NHS的摩尔比为1:4。
进一步,在步骤(2)中,所述的核酸适配体为赭曲霉毒素A核酸适配体(OTA核酸适配体)。所述的核酸适配体与氨基修饰磁性微球的摩尔比为75:1~150:1。
进一步,在步骤(3)中,所述的振荡孵育包括以下步骤:a)将核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中,加入模板分子,在室温下振荡孵育;b)经磁分离后,用缓冲溶液清洗,除去未结合的模板分子;c)加入功能单体,在室温下振荡孵育。
进一步,在步骤(3)中,所述的模板分子为赭曲霉毒素A(OTA),所述的模板分子与核酸适配体修饰磁性微球的摩尔比为5:1~15:1;所述的功能单体为α-甲基丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、丙烯酰胺中任意一种,所述的功能单体与核酸适配体修饰磁性微球的摩尔比为1:1~6:1。优选地,所述的功能单体为α-甲基丙烯酸。
进一步,在步骤(3)中,所述的交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺;所述的引发剂为过硫酸铵溶液与四甲基乙二胺的混合物。
进一步,在步骤(4)中,所述的洗脱溶剂为甲醇与乙酸的混合溶液,其中,甲醇与乙酸的体积比为50:50~90:10。
本发明所述的核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球可用于分散固相微萃取技术,对复杂样品中痕量或超痕量物质组分进行分离和富集。
本发明利用SiO2包裹的Fe3O4微球作为磁性内核,不仅能够提高磁性微球的比表面积,大大提高核酸适配体的键合量,而且SiO2包覆层含有丰富的羟基,有利于进行后续的表面改性。使用氨基硅烷化试剂对SiO2/Fe3O4微球进行氨基改性,使得磁性内核表面增加活性氨基,氨基能够与带羧基的核酸适配体进行酰胺化反应,从而使核酸适配体牢固地衔接到磁性内核表面,使核酸适配体不易酶解,提高了核酸适配体的稳定性,亦提高了核酸适配体的利用率。在此基础上加入模板分子和功能单体进行孵育,形成适配体-模板-单体复合物,模板分子为后续分子印迹聚合物刚性识别空穴的形成提供基础,功能单体能够提供与模板分子相互识别的作用位点,对分子印迹聚合物的识别性能起着至关重要的作用。通过加入交联剂和引发剂与适配体-模板-单体复合物进行自由基聚合反应,使之形成牢固的交联骨架结构,能够提高适配体-模板-单体复合物的稳定性,并使核酸适配体在交联骨架结构中保持识别构象,维持核酸适配体的活性和稳定性。最后通过洗脱剂将模板分子脱除,原模板分子位置形成了与模板分子空间结构相匹配的分子印迹聚合物刚性识别空穴,核酸适配体和功能单体中留下能与模板分子精准识别的作用位点,使最终得到的核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球对模板分子具有极强的特异性识别、吸附能力。同时,洗脱剂并不与自由基、核酸适配体、功能单体发生作用,因此自由基与核酸适配体、功能单体仍然保持牢固连接,自由基聚合反应所形成的牢固的交联骨架结构并不受洗脱过程的影响,使得最终形成的分子印迹聚合物刚性识别空穴不易发生溶胀、变形,具有很好的稳定性。
本发明所制得的核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球,具有稳定的分子印迹聚合物刚性识别空穴,特异性识别、吸附能力强,在水相体系中的选择性高,而且在分子印迹聚合物骨架结构中实现了多点支撑交联固载结构,所固载的核酸适配体稳定性好、不易酶解。同时本发明所提供的制备方法,具有环保、操作简单、产率高等优点。
本发明的核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球作为分散固相微萃取吸附剂,相比于传统的吸附剂,具有背景压力低、接触面积大、传质速率快等优点,可提高复杂样品的萃取选择性,增大萃取容量,提高富集效率,加快分析速度。其与高效液相色谱法结合,还能实现复杂生物样品中痕量、超痕量物质快速、高效、高选择性分离富集及检测。
附图说明
图1为本发明核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球的制备过程示意图;
图2为Fe3O4磁性微球透射电子显微镜照片;
图3为SiO2/Fe3O4微球透射电子显微镜照片;
图4为OTA核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球的透射电子显微镜照片;
图5为实施例五萃取容量结果图;
图6为实施例六八种萃物物的结构式;
图7为实施例六萃取容量对比图。
具体实施方式
本发明所述核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球的制备过程可参阅图1,下面通过具体实施例来详细说明该制备过程及结果。
实施例一:制备氨基修饰磁性微球
称量2.00g PEG-6000,2.40g NaOH于100mL烧杯中,加入50mL煮沸并冷却的去离子水溶解,转移到500mL两口烧瓶中。再称量2.70g FeCl3·6H2O和1.96g FeCl2·4H2O于250mL烧杯中,加入100mL煮沸并冷却的去离子水溶解后滴加至PEG-6000与NaOH的混合物中。保持水浴温度为40℃,搅拌反应1h后得Fe3O4磁性微球。
将所得的Fe3O4磁性微球置于盛有50mL正丙醇的烧瓶中,超声15min后加入5mL氨水,间隔10min后加入1ml TEOS,搅拌反应12h,然后加入10mL 10%HCl对其进行超声酸洗,最后加入10mL无水乙醇进行醇洗,得到SiO2/Fe3O4磁性微球。
将上述所得的SiO2/Fe3O4磁性微球置于75mL乙醇溶液中,然后加入1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷,置于50℃水浴中机械搅拌6h,得到氨基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球。
参阅图2,其是所得Fe3O4磁性微球的透射电子显微镜照片。本发明使用反滴定法制得的Fe3O4磁性微球均一性好、比表面积大,而且本方法不使用有机溶剂,还具有绿色环保、操作简单、产率高等优点。
参阅图3,其是所得SiO2/Fe3O4磁性微球的透射电子显微镜照片,本发明使用溶胶凝胶法制得的SiO2/Fe3O4磁性微球保持着良好的分散性和均一性。由于SiO2具有良好的生物相容性及抗分解能力,在Fe3O4磁性微球表面包裹一层SiO2后,能极大地降低粒子的零电点和屏蔽磁偶极子的相互作用,使粒子具有良好的水溶性、化学稳定性及生物相容性,且SiO2表面存在丰富的羟基,可使复合粒子容易进一步生物功能化。
将SiO2/Fe3O4磁性微球表面进行氨基修饰,方便通过化学键合方式进行下一步的固载操作。
实施例二:制备OTA核酸适配体修饰磁性微球
称取5mg实施例一所得氨基修饰SiO2/Fe3O4磁性微球,加入800μL Tris-HCl缓冲溶液(PH为7.5,含0.1mol/L NaCl、50mmol/L Tris、1mmol/L MgCl2),超声10min。再加入1.2mLEDC/NHS混合液(摩尔比EDC:NHS=1:4),静置活化10min后加入40μL OTA适配体溶液(6.5μg/mL),在25℃下振荡反应16h,得到OTA核酸适配体修饰磁性微球,标记为Apt-SF。
实施例三:制备OTA核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球
将实施例二所得的OTA核酸适配体修饰磁性微球分散在5mL Tris-HCl缓冲溶液(PH为7.5,含0.1mol/L NaCl、50mmol/L Tris、1mmol/L MgCl2)中,加入0.205μmol/L模板分子OTA,振荡孵育90min后进行磁力分离,然后用缓冲溶液反复清洗,以除去未结合的模板分子。接着加入145μmol功能单体MAA(甲基丙烯酸),常温下振荡反应30min。
接着,在反应混合液中加入11.1mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺及33.3μL 0.0438mol/L过硫酸铵与1μL四甲基乙二胺,在25℃无氧条件下振荡反应4h,得到OTA核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球。
实施例四:制备OTA核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球
在实施例三所得OTA核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球中加入甲醇-乙酸(80:20,V/V),振荡洗脱15min,共15次,得到OTA核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球,标记为Apt-MIP SF。
参阅图4,其是所得Apt-MIP SF的透射电子显微镜照片。与Fe3O4磁性微球、SiO2/Fe3O4磁性微球相比,Apt-MIP SF颗粒发生明显聚集,粒径增大;并且可观察到Apt-MIP SF包含实心内核和外壳。
实施例五:Apt-MIP SF萃取实验
配制一系列浓度范围为2~22μg/L的OTA标准溶液,分别用5mg实施例四所得Apt-MIP SF进行萃取,萃取结果见图5。
根据图5可以发现,在OTA标准溶液浓度在2~15μg/L范围内,萃取量随着浓度的增加呈近线性增长,在15μg/L之后萃取量趋于平衡,最高萃取量约为37.5ng。
实施例六:选择性萃取比较实验
(1)制备羧基及双键修饰核酸适配体制备的适配体-分子印迹协同识别磁性微球
将OTA适配体进行羧基及双键修饰,修饰后得到羧基及双键修饰核酸适配体,所述羧基及双键修饰核酸适配体为5′-COOH-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGGACA-3′;然后以羧基及双键修饰核酸适配体替代OTA适配体,运用实施例一至实施例四的方法制备得到羧基及双键修饰核酸适配体制备的适配体-分子印迹协同识别磁性微球,标记为CHCH-Apt-MIP-SF。
(2)制备OTA为模板分子制备的分子印迹聚合物
称取5mg OTA核酸适配体,分散在5mL Tris-HCl缓冲溶液(PH为7.5,含0.1mol/LNaCl、50mmol/L Tris、1mmol/L MgCl2)中,加入0.205μmol/L模板分子OTA,振荡孵育90min后进行磁力分离,然后用缓冲溶液反复清洗,以除去未结合的模板分子。接着加入145μmol功能单体MAA(甲基丙烯酸),常温下振荡反应30min。接着,在反应混合液中加入11.1mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺及33.3μL 0.0438mol/L过硫酸铵与1μL四甲基乙二胺,在25℃无氧条件下振荡反应4h。加入甲醇-乙酸(80:20,V/V),振荡洗脱15min,共15次,得到OTA为模板分子制备的分子印迹聚合物,标记为MIP。
(3)制备乱序单链DNA修饰适配体-分子印迹协同识别磁性微球
将本实施例步骤(1)中所述5′-COOH-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAGCAT CGG ACA-3′进行乱序处理,得到5′-COOH-GAG GAA TGA GGG TGA GGC CTT GCG AGCGTT AGG AGC-3′;然后以5′-COOH-GAG GAA TGA GGG TGA GGC CTT GCG AGC GTT AGG AGC-3′替代OTA适配体,运用实施例一至实施例四的方法制备得到乱序单链DNA修饰适配体-分子印迹协同识别磁性微球,标记为ScrApt-MIP-SF。
(4)萃取比较
分别称取5mg实施例四所得Apt-MIP-SF、本实施例步骤(1)所得CHCH-Apt-MIP-SF、本实施例步骤(2)所得MIP、实施例二所得Apt-SF、本实施例步骤(3)所得ScrApt-MIP-SF,分别萃取1μg/L OTA(赭曲霉毒素A)、OTB(赭曲霉毒素B)、AFB1(黄曲霉毒素B1)、AFB2(黄曲霉毒素B2)、AFG1(黄曲霉毒素G1)、AFG2(黄曲霉毒素G2)、AFM1(黄曲霉毒素M1)和ZEN(玉米赤霉烯酮)标准溶液,所述8种萃取物的结构参阅图6,萃取结果参阅图7。
参阅图7的萃取结果,在相同条件下,Apt-MIP SF对OTA的萃取量为36.8ng,是对其他结构类似物萃取量的1.9~60倍,说明Apt-MIP SF对OTA具有很高的选择性分离和富集能力;相比之下,CHCH-Apt-MIP-SF对OTA及其他7种结构类似物的萃取选择性较差,MIP、Apt-SF、ScrApt-MIP-SF对OTA及其他7种结构类似物的萃取选择性也较差。
本发明并不局限于上述实施方式,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些变形和改进都属于本发明的保护范围。因此本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序 列 表
<110> 华南师范大学
<120> 核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球及其制备方法和应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OTA核酸适配体
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 乱序单链DNA
<400> 2
gaggaatgag ggtgaggcct tgcgagcgtt aggagc 36
Claims (10)
1.一种核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备氨基修饰磁性微球:制备Fe3O4微球,并对所得Fe3O4微球进行SiO2包裹,得到SiO2/Fe3O4微球,然后加入氨基硅烷化试剂对SiO2/Fe3O4微球进行氨基改性,得到氨基修饰磁性微球;
(2)制备核酸适配体修饰磁性微球:将步骤(1)所得的氨基修饰磁性微球分散于缓冲溶液中,加入EDC/NHS溶液活化,然后加入核酸适配体溶液,振荡反应,得到核酸适配体修饰磁性微球;
(3)制备核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球:将步骤(2)所得的核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中,加入模板分子及功能单体,振荡孵育;然后加入交联剂及引发剂,在无氧条件下进行自由基聚合反应,得到核酸适配体-分子印迹涂层磁性微球;
(4)制备核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球:采用洗脱溶剂洗脱除去步骤(3)所得微球中的模板分子,形成分子印迹聚合物刚性识别空穴,得到核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在步骤(1)中,所述的氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷;所述的氨基硅烷化试剂与SiO2/Fe3O4微球的摩尔比为25:1~75:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在步骤(2)和步骤(3)中,所述的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液,其pH值为4.5~8.5。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在步骤(2)中,所述EDC/NHS溶液中的EDC与NHS的摩尔比为4:1~1:4。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在步骤(2)中,所述的核酸适配体为赭曲霉毒素A核酸适配体;所述的核酸适配体与氨基修饰磁性微球的摩尔比为1:75~1:150。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在步骤(3)中,所述的振荡孵育包括以下步骤:a)将核酸适配体修饰磁性微球分散于缓冲溶液中,加入模板分子,在室温下振荡孵育;b)经磁分离后,用缓冲溶液清洗,除去未结合的模板分子;c)加入功能单体,在室温下振荡孵育。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在步骤(3)中,所述的模板分子为赭曲霉毒素A,所述的功能单体为α-甲基丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、丙烯酰胺中任意一种;所述的交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺;所述的引发剂为过硫酸铵溶液与四甲基乙二胺的混合物;所述的模板分子与核酸适配体修饰磁性微球的摩尔比为5:1~15:1;所述的功能单体与核酸适配体修饰磁性微球的摩尔比为1:1~6:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:在步骤(4)中,所述的洗脱溶剂为甲醇与乙酸的混合溶液,其中,甲醇与乙酸的体积比为50:50~90:10。
9.由权利要求1至8其中之一所述的制备方法制得的核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球,其特征在于:包括磁性微球内核和核酸适配体-分子印迹协同识别外壳,微球内核和核酸适配体-分子印迹协同识别外壳之间通过化学键连接,所述核酸适配体-分子印迹协同识别外壳具有分子印迹聚合物刚性识别空穴。
10.权利要求9所述的核酸适配体-分子印迹协同识别磁性微球在分散固相微萃取中的应用。
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