CN111693617B - 一种核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法，包括以下步骤：(1)对不锈钢网片依次进行有机溶剂浸泡、碱洗、去离子水清洗和烘干处理；(2)用单宁酸对步骤(1)得到的不锈钢网片进行表面处理；(3)对步骤(2)得到的不锈钢网片进行硅烷化处理；(4)在4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中加入步骤(3)得到的不锈钢网片、模板分子与核酸适配体，然后依次加入功能单体、交联剂和引发剂进行聚合反应，去除模板分子，得到核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片。本发明通过核酸适配体‑模板分子‑功能单体协同识别提高对配体模板分子的特异性识别能力，实现分子印迹与核酸适配体两种分子识别技术优势互补。

Description

一种核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法
技术领域
本发明涉及材料制备及固相萃取领域，特别是涉及一种核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法。
背景技术
随着社会经济的发展，人们越来越重视食品安全问题。目前，约有四分之一的粮食谷物以及饲料中含有真菌毒素，这些真菌毒素不仅会对畜牧产业造成直接的经济损失，部分真菌毒素还对人体具有致畸性和致癌性，其可能通过食物进入人体并在体内慢慢积累，对人体健康造成极大的危害。比如赭曲霉毒素A(OTA)和伏马毒素B1(FB1)会对人体的肝脏产生损伤，长期作用会引发肝癌。我国规定在谷物及其制品中OTA的含量不得超过5.0μg/kg，在饲料原料及产品中不得超过100μg/kg。欧盟对伏马毒素B1(FB1)和伏马毒素B2(FB2)含量总含量具有以下规定，在玉米中不得超过4mg/kg，在婴幼儿玉米制品中不得超过0.2mg/kg。因此，实现食品中多种微量毒素的同时快速检测显得尤为重要。
目前国内外关于食品中毒素和抗生素的检测方法报道包括薄层色谱法，酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。薄层色谱法虽然简单，但存在灵敏度低和重现性差等缺点；酶联免疫法灵敏度高，特异性强，但由于酶自身稳定性不足，容易导致复杂基质样品检测出现假阳性；高效液相色谱法以及液质联用法具有灵敏度高和重现性好等优点，利用各组分保留时间的不同，可以同时检测多种目标物。
分子印迹聚合物的合成包括通过非共价键作用使模板分子与溶液中的功能单体络合，在交联剂和引发剂的作用下，功能单体逐渐在模板分子的周围聚合。聚合完成后，通过充分洗涤将模板分子除去，从而使结合位点(即空腔)可以和与模板分子在官能团的大小，形状和位置方面相似的物质结合。分子印迹具有稳定性好、制备简单等特点，但特异性识别能力比较差。
核酸适配体是一段含有20-100个核苷酸的RNA或DNA片段，可通过指数富集配体系统进化技术筛选得到，核酸适配体具有与抗体和酶相匹敌的特异性靶向能力，能够与小分子、蛋白质甚至细胞特异性结合。同时核酸适配体还具有抗体和酶所不具备的优点：可化学合成，易化学修饰，分子量小，与目标对象结合空间位阻小，目标配体范围广等。
完整的样品分析过程包括样品的收集，制备，分析，数据处理和结果报告。从环境、食品、临床标本或生物液体中采集的样品，通常含有复杂的化学成分，直接分析可能无法准确检测到含量较低的目标分析物。另一方面，样品中的杂质还可能会形成堵塞，对分析仪器产生损伤。样品前处理是整个分析过程中的关键步骤，直接影响样品分析的准确度和精密度。目前各类前处理技术普遍存在两极化发展趋势，即追求高选择性时其适用性大幅下降，追求方法适用性以实现高通量分析目的时，样品前处理方法的选择性较差。如何同时实现高选择性、高通量及不同样品的可定制化检测具有研究价值。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法，在合成分子印迹聚合物的过程中加入核酸适配体，基于核酸适配体与分子印迹聚合物协同识别作用，通过核酸适配体-模板分子-功能单体协同识别提高对配体模板分子的特异性识别能力，同时通过在聚合物骨架结构中固载核酸适配体，增强核酸适配体稳定性，实现分子印迹与核酸适配体两种分子识别技术优势互补，实现高选择性识别目标物。
本发明采取的技术方案如下：
一种核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法，包括以下步骤：
(1)对不锈钢网片依次进行有机溶剂浸泡、碱洗、去离子水清洗和烘干处理；
(2)用单宁酸对步骤(1)得到的不锈钢网片进行表面处理；
(3)用γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷对步骤(2)得到的不锈钢网片进行硅烷化处理；
(4)在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液中加入步骤(3)得到的不锈钢网片、模板分子与核酸适配体，然后依次加入功能单体、交联剂和引发剂进行聚合反应，最后用洗脱剂洗涤去除模板分子，得到核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片。
其中，针对不同的目标物可以在步骤(4)中选择不同模板分子，从而制得多种对应的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片(也可以称为核酸适配体-分子印迹聚合物涂层滤片，根据分析需求可以将特异性识别目标物不同的多种滤片在固相萃取小柱中堆叠组合，以实现可定制、高通量、高选择性识别复杂基质中多种毒素。
本发明制得的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片可用于复杂基质中多种毒素分子的分析检测。与传统的分子印迹聚合物相比，本发明所述核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片具有以下优点：1、在识别体系中加入了核酸适配体，通过分子印迹与核酸适配体协同识别作用，大大增强材料对目标物的选择性，达到一加一大于二的效果；2、通过更换加入的模板分子和核酸适配体种类，可以得到特异性识别不同毒素分子的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片，通过将它们作为填料在固相萃取柱中组合使用，实现可定制、高通量、高选择性地同时识别多种毒素；3、通过在聚合物骨架结构中固载核酸适配体，增强了核酸适配体稳定性。
另外，本发明选取不锈钢网片作为基材进行分子印迹，经实验验证具备可行性，其与印迹物接触的面积较大。同时，不锈钢网片作为一个整体可以在在固相萃取中根据需求进行组装以及拆卸，便于实现后续一种或两种以上分子印迹材料在固相萃取柱中的自由组合，使用方便。
具体地，步骤(1)的有机溶剂浸泡处理中，所述有机溶剂为丙酮或苯，浸泡时间为50-100 小时，且每隔20-30小时更换一次有机溶剂。
具体地，步骤(1)的碱洗处理中，采用的碱液中含有质量比为5:2:2的氢氧化钠、碳酸钠和磷酸钠，碱洗在70-90℃水浴加热条件下进行，碱洗时间为20-40分钟。
具体地，步骤(2)包括：将步骤(1)得到的不锈钢网片浸泡在由单宁酸、氯化铁与4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液配制而成的混合溶液中，室温下进行表面处理1-3分钟，再将不锈钢网片取出，用去离子水洗净并烘干。单宁酸和氯化铁可以在pH＝7.45条件下发生络合反应从而在基底材料上成膜，从而使不锈钢网片表面带有羟基。反应在室温下进行，振荡1-3 分钟，反应结束后将不锈钢网片取出，用去离子水洗净并烘干。
具体地，步骤(2)的所述混合溶液中，氯化铁与单宁酸的摩尔比为37:24。
具体地，步骤(3)包括：将步骤(2)得到的不锈钢网片加入由γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、甲醇与水配制而成的硅烷化试剂中，进行硅烷化处理，使得不锈钢网片上化学处理得到的羟基可以转化为双键，从而参与分子印迹的聚合。反应结束后将不锈钢网片取出，用甲醇洗净并烘干。
具体地，步骤(3)中的所述硅烷化试剂中，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、甲醇与水的体积比为1:1:8。
具体地，步骤(4)中，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰，所述引发剂是溶液体积比为17:1的过硫酸铵和四甲基乙二胺。
本发明还提供所述制备方法制得的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片，该网片可以应用于固相萃取中。
本发明还提供一种固相萃取柱，其包括由所述的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片组成的填料。将特异性识别不同目标物的网片在所述固相萃取柱中组合使用，可以实现多种毒素的高通量、高选择性和定制化检测。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法的流程图；
图2为核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的扫描电镜和能谱表征元素图；
图3为核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的激光共聚焦成像图；
图4为引发剂APS和TMEDA用量优化结果图；
图5为交联剂MBA用量优化结果；
图6为不同印迹不锈钢网片对OTA的萃取效果对比图；
图7为不同印迹不锈钢网片对FB1的萃取效果对比图；
图8为OTA核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片中核酸适配体的稳定性效果图；
图9为直接化学键合在不锈钢网片表面的OTA核酸适配体的稳定性效果图；
图10为FB1核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片中核酸适配体的稳定性效果图；
图11为直接化学键合在不锈钢网片表面的FB1核酸适配体的稳定性效果图；
图12为核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的选择性效果图。
具体实施方式
请参阅图1，本发明所述的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法，包括以下步骤：
(1)对不锈钢网片依次进行有机溶剂浸泡、碱洗、去离子水清洗和烘干处理；
(2)用单宁酸对步骤(1)得到的不锈钢网片进行表面处理；
(3)用γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH570)对步骤(2)得到的不锈钢网片进行硅烷化处理；
(4)在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中加入步骤(3)得到的不锈钢网片、模板分子与核酸适配体，然后依次加入功能单体、交联剂和引发剂进行聚合反应，最后用洗脱剂洗涤去除模板分子，得到核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片。
通过改变模板分子和核酸适配体的种类，可得到特异性识别不同目标物的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片。
具体地，步骤(1)的所述有机溶剂浸泡处理中，采用有机溶剂为丙酮或苯，浸泡时间为50-100小时，且每隔20-30小时更换一次有机溶剂。步骤(1)的碱洗处理中，采用的碱液中含有质量比为5:2:2的氢氧化钠(NaOH)、碳酸钠(Na2CO3)和磷酸钠(Na3PO4)，碱洗在 70-90℃水浴加热条件下进行，碱洗时间为20-40分钟。
步骤(2)具体为：将步骤(1)得到的不锈钢网片浸泡在由单宁酸、氯化铁(FeCl3)与HEPES缓冲溶液配制而成的混合溶液中，室温下进行表面处理1-3分钟，再将不锈钢网片取出，用去离子水洗净并烘干；所述混合溶液中，FeCl3与单宁酸的摩尔比为37:24。
步骤(3)具体为：将步骤(2)得到的不锈钢网片加入由KH570、甲醇与水配制而成的硅烷化试剂中，进行硅烷化处理，处理后将不锈钢网片取出，用甲醇洗净并烘干；所述硅烷化试剂中，KH570、甲醇与水的体积比为1:1:8。
步骤(4)中，所述功能单体为甲基丙烯酸(MAA)，所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰 (MBA)，所述引发剂为过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)，更优地，APS与TMEDA 的体积比为17:1；聚合反应在60℃、振荡下进行；
将制得的所述核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片排列堆叠，作为填料装填于固相萃取柱的管体中，得到如图1所示的固相萃取柱。
本发明基于不同类型分析对象可以选择不同模板分子，按上述制备方法分别制得多种对应的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片(也可以称为核酸适配体-分子印迹聚合物涂层滤片)，然后根据分析需求将多个滤片在固相萃取小柱中堆叠组合，得到图1所示固相萃取装置，从而实现可定制、高通量、高选择性识别复杂基质中多种毒素。
实施例1
本实施例中，选取赭曲霉毒素A(OTA)作为模板分子，按如下步骤制备OTA核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片：
在烧杯中加入不锈钢网片和丙酮，用丙酮浸泡不锈钢网片72h，丙酮每24h更换一次。配制含有50g/L NaOH、20g/L Na2CO3、20g/L Na3PO4的混合碱液250mL，将丙酮浸泡后的不锈钢网片放入该混合碱液中，在80℃水浴搅拌加热下清洗30min，取出不锈钢网片后用去离子水清洗干净后烘干备用。然后，在一个干净的反应容器中，依次加入5mL pH＝7.45 的HEPES缓冲溶液、干净的不锈钢网片、37μL 50mM的FeCl3溶液以及24μL 50mM单宁酸溶液，在室温下振荡反应1min，反应结束后取出不锈钢网片用去离子水洗干净并烘干。接着，在另一干净的反应容器中，加入单宁酸处理过的不锈钢网片、10mL KH570、10mL 甲醇和80mL去离子水，该反应容器置于摇床中，在温度30℃、摇床转速250rpm 条件下反应30min，反应结束后用甲醇将不锈钢网片洗涤干净，并烘干备用。
在10mL离心管中加入3mL pH＝7.45的HEPES缓冲溶液、经过上述处理的不锈钢网片， 10μL 1mg/mL OTA溶液、50μL 66μg/mL OTA核酸适配体溶液和25μL MAA，向离心管中充入氮气，然后将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250rpm 条件下预反应20min，再加入交联剂36.0mg MBA，向离心管中充入氮气，然后将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250rpm 条件下预聚合30min，最后加入引发剂34μL 0.2499mol/L APS溶液与2μL6.6695mol/L TMEDA 溶液，重新向离心管中充入氮气，再将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250rpm 条件下聚合反应20h。反应结束后，用含10％乙酸的甲醇(v/v)多次洗涤不锈钢网片去除模板分子，得到OTA核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片。
所得的OTA核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片组合堆叠，作为填料装填于固相萃取柱的管体中，得到的固相萃取柱用于对实际样品中OTA毒素进行检测。
实施例2
本实施例中，选取伏马毒素B1(FB1)作为模板分子，按如下步骤制备FB1核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片：
在烧杯中加入不锈钢网片和丙酮，用丙酮浸泡不锈钢网片72h，丙酮每24h更换一次。配制含有50g/L NaOH、20g/L Na2CO3、20g/L Na3PO4的混合碱液250mL，将丙酮浸泡后的不锈钢网片放入该混合碱液中，在80℃水浴搅拌加热下清洗30min，取出不锈钢网片后用去离子水清洗干净后烘干备用。然后，在一个干净的反应容器中，依次加入5mL pH＝7.45 的HEPES缓冲溶液、干净的不锈钢网片、37μL 50mM的FeCl3溶液以及24μL 50mM单宁酸溶液，在室温下振荡反应1min，反应结束后取出不锈钢网片用去离子水洗干净并烘干。接着，在另一干净的反应容器中，加入单宁酸处理过的不锈钢网片、10mL KH570、10mL 甲醇和80mL去离子水，该反应容器置于摇床中，在温度30℃、摇床转速250rpm 条件下反应30min，反应结束后用甲醇将不锈钢网片洗涤干净，并烘干备用。
在10mL离心管中加入3mL pH＝7.45的HEPES缓冲溶液、经过上述处理的不锈钢网片， 10μL 1mg/mL FB1溶液、50μL 66μg/mL FB1核酸适配体溶液和25μL MAA，向离心管中充入氮气，然后离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250rpm 条件下预反应20min，再加入交联剂36.0mg MBA，向离心管中充入氮气，然后将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250rpm 条件下预聚合30min，最后加入引发剂34μL 0.2499mol/L APS溶液与2μL6.6695mol/L TMEDA 溶液，重新向离心管中充入氮气，再将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250rpm 条件下聚合反应8h。反应结束后，用含10％乙酸的甲醇(v/v)多次洗涤不锈钢网片去除模板分子，得到FB1核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片。
所得的FB1核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片组合堆叠，作为填料装填于固相萃取柱的管体中，得到的固相萃取柱用于对实际样品中FB1毒素进行检测。
本发明还将实施例1和2分别制备得到的OTA、FB1两种核酸适配体分子印迹不锈钢网片组合使用，共同用于分离检测霉变葡萄、玉米和饲料等中的OTA和FB1。
表征与测试结果
请参阅图2，该图为本发明制得的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的扫描电镜和能谱表征元素图，从元素能谱图中可以看出Fe、Cr、Ni元素为不锈钢网片基底材料含有的主要元素，即Fe、Cr、Ni元素的分布位置对应于不锈钢网片基底材料所在的位置；C、N、 O元素的分布位置对应于按本发明的制备方法形成的分子印迹涂层所在的位置；从该图中可以看出，所有元素分布位置重合，说明按本发明的制备方法所形成的在不锈钢网片上的分子印迹涂层，其所在位置与不锈钢网片基底材料所在位置重合，表明分子印迹涂层均匀地分布在不锈钢网片表面上。
请参阅图3，该图为本发明制得的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的激光共聚焦成像的3D图像。通过将荧光基团标记的核酸适配体后用于本发明的制备方法中，合成带有荧光基团的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片，在激光共聚焦显微镜下用荧光基团所对应的激发波长对不锈钢网片进行激发，从得到的该3D共聚焦图像可以看到，荧光均匀地分布在不锈钢网片上，说明核酸适配体均匀地分布在整个不锈钢网片表面。
请参阅图4和图5，分别示出了核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的制备方法中，引发剂APS与TMEDA用量、交联剂MBA用量的优化结果。用碳元素的重量百分比表征不锈钢网片上形成分子印迹涂层的厚度，图4的结果表明，当引发剂APS用量为34μL，TMEDA 用量为2μL时，分子印迹涂层中碳元素的百分含量最高，表明引发剂APS与TMEDA最佳用量分别为34μL和2μL；图5的结果表明，当交联剂MBA用量为36.0mg时，分子印迹涂层中碳元素的百分含量最高，表明交联剂MBA最佳用量为36.0mg，在最佳条件下合成的分子印迹涂层厚度适中。
请参阅图6，该图为不同印迹不锈钢网片对OTA的萃取效果对比图，图中，MIP-Apt为实施例1合成的OTA核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片；MIP为只有分子印迹而没有加入核酸适配体合成的印迹网片；Apt为只加核酸适配体没有加MAA功能单体的印迹网片；NIP为加入乱序OTA适配体和MAA、不加模板分子的空白印迹网片。从该图6中可以看到，MIP-Apt印迹网片对OTA的萃取量大于MIP印迹网片与Apt印迹网片对OTA的萃取量之和，且明显大于NIP印迹网片的萃取量，说明按照本发明合成的MIP-Apt印迹网片，实现了分子印迹与核酸适配体协同识别的效果，大大增强了印迹网片对OTA的选择性。
请参阅图7，该图为不同印迹不锈钢网片对FB1的萃取效果对比图，图中，MIP-Apt为实施例1合成的FB1核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片；MIP为只有分子印迹而没有加入核酸适配体合成的印迹网片；Apt为只加核酸适配体没有加MAA功能单体的印迹网片； NIP为加入乱序OTA适配体和MAA、不加模板分子的空白印迹网片。从该图7中可以看到，MIP-Apt印迹网片对FB1的萃取量大于MIP印迹网片与Apt印迹网片对FB1的萃取量之和，且明显大于NIP印迹网片的萃取量，说明按照本发明合成的MIP-Apt印迹网片，实现了分子印迹与核酸适配体协同识别的效果，大大增强了印迹网片对FB1的选择性。
请参阅图8和图9，图8示出了实施例1合成的MIP-Apt不锈钢网片经过酶解作用前后对OTA萃取量对比图；图9示出了核酸适配体直接化学键合在不锈钢网片表面上，经过同样酶解作用前后对OTA萃取量对比图。从图9可以看出，核酸适配体直接键合在不锈钢网片表面，经过酶解作用，不锈钢网片对OTA的萃取量明显下降，说明部分核酸适配体被酶解，从而导致网片对OTA的萃取量下降。由图8萃取量变化图可以看出，本发明制备的 MIP-Apt网片在同样的酶解作用下萃取性能保持较好，因为核酸适配体被包覆在分子印迹聚合物骨架中，分子印迹聚合物骨架对核酸适配体起到保护作用，抑制了核酸适配体的酶解。
请参阅图10和图11，图10示出了实施例2合成的MIP-Apt不锈钢网片经过酶解作用前后对FB1萃取量对比图；图11示出了核酸适配体直接化学键合在不锈钢网片表面上，经过同样酶解作用前后不锈钢网片对FB1萃取量的对比图。从图11可以看出，核酸适配体直接键合在不锈钢网片表面，经过酶解作用，不锈钢网片对FB1的萃取量明显下降，说明部分核酸适配体被酶解，从而导致网片对FB1的萃取量下降。由图10萃取量变化图可以看出，本发明制备的MIP-Apt网片在同样的酶解作用下萃取性能保持较好，因为核酸适配体被包覆在分子印迹聚合物骨架中，分子印迹聚合物骨架对核酸适配体起到保护作用，抑制了核酸适配体的酶解。
请参阅图12，该图为核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片的选择性效果图，将实施例1合成的OTA MIP-Apt印迹网片，以及对照组OTA MIP网片、OTA Apt网片、OTA NIP网片，以及实施例2合成的FB1 MIP-Apt印迹网片，以及对照组FB MIP网片、FB Apt网片和FBNIP网片，对OTA、FB1、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素 G2(AFB2)五种毒素进行分离检测，从图中可以看出OTA MIP-Apt印迹网片对OTA具有良好的选择性，FB1MIP-Apt印迹网片对FB1具有良好的选择性，实验结果表明其他三种毒素 ZEN、AFG2和AFB2对核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片分离检测目标物干扰较小。
本发明制得的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片可用于复杂基质中多种毒素分子的分析检测。与传统的分子印迹聚合物相比，本发明所述核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片具有以下优点：1、在识别体系中加入了核酸适配体，通过分子印迹与核酸适配体协同识别作用，大大增强材料对目标物的选择性，达到一加一大于二的效果；2、通过更换加入的模板分子和核酸适配体种类，可以得到特异性识别不同毒素分子的核酸适配体分子印迹协同识别不锈钢网片，通过将它们作为填料在固相萃取柱中组合使用，实现可定制、高通量、高选择性地同时识别多种毒素；3、通过在聚合物骨架结构中固载核酸适配体，增强了核酸适配体稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种固相萃取柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在烧杯中加入不锈钢网片和丙酮，用丙酮浸泡不锈钢网片72 h，丙酮每24 h更换一次；配制含有50 g/L NaOH、20 g/L Na2CO3、20 g/L Na3PO4的混合碱液250 mL，将丙酮浸泡后的不锈钢网片放入该混合碱液中，在80℃水浴搅拌加热下清洗30 min，取出不锈钢网片后用去离子水清洗干净后烘干备用；然后，在一个干净的反应容器中，依次加入5 mL pH=7.45的HEPES缓冲溶液、干净的不锈钢网片、37 μL 50mM的FeCl3溶液以及24 μL 50 mM单宁酸溶液，在室温下振荡反应1 min，反应结束后取出不锈钢网片用去离子水洗干净并烘干；接着，在另一干净的反应容器中，加入单宁酸处理过的不锈钢网片、10 mL KH570、10 mL甲醇和80mL去离子水，该反应容器置于摇床中，在温度30℃、摇床转速250 rpm 条件下反应30 min，反应结束后用甲醇将不锈钢网片洗涤干净，并烘干备用；
在10 mL离心管中加入3 mL pH=7.45的HEPES缓冲溶液、经过上述处理的不锈钢网片，10 μL 1 mg/mL模板分子溶液、50 μL 66 μg/mL核酸适配体溶液和25 μL MAA，向离心管中充入氮气，然后将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250 rpm 条件下预反应20min，再加入交联剂36.0 mg MBA，向离心管中充入氮气，然后将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250 rpm 条件下预聚合30 min，最后加入引发剂34 μL 0.2499 mol/L APS溶液与2 μL 6.6695 mol/L TMEDA 溶液，重新向离心管中充入氮气，再将离心管置于摇床中，在温度60℃、摇床转速250 rpm 条件下聚合反应20 h；反应结束后，用含体积比10%的乙酸的甲醇多次洗涤不锈钢网片去除模板分子；其中，所述模板分子为赭曲霉毒素A和/或伏马毒素B1；所述核酸适配体对应于所述模板分子，且末端通过炔基修饰；
将所得的不锈钢网片组合堆叠，作为填料装填于固相萃取柱的管体中，得到所述固相萃取柱。
2.一种固相萃取柱，其特征在于：是由权利要求1所述的制备方法得到。
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