CN105695473B - 真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的检测方法及检测试剂盒。该方法包括：先将DONApt与单链信号探针ssDNA杂交，形成DONApt‑ssDNA杂交链；然后向其加入待测样品，当待测样品存在DON时，DONApt‑ssDNA与DON反应生成DONApt‑DON，并释放ssDNA；体系中剩余DONApt‑ssDNA杂交链经DNA扩增形成双链DNA；双链DNA在外切酶催化下水解成单核苷酸除去，而体系中ssDNA被保留；再向体系中加入银离子和还原剂，在ssDNA诱导下，银离子还原生成近红外荧光银纳米簇；最后依据近红外荧光强度与DON的量的关系，计算待测样品中的DON含量。

Description

真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体涉及一种真菌霉素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又称呕吐毒素，是一种B型单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生，多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，也污染粮食制品。DON对人畜可以产生广泛的毒性效应，属于剧毒或中等毒物，可致呕吐、腹泻、发烧等急性中毒症状，与贫血、免疫抑制、食管癌、克山病也具有密切联系，另外，它还常与其它的霉卤毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响。DON是世界性的，特别是在中国、日本、美国、阿根廷、南非。在我国是胃癌、食管癌等恶性肿瘤高发区居民饮食中的主要污染霉菌毒素之一。如我国林县、磁县主要粮食面粉和玉米中的DON检出率分别为53.8％和100％，林县样品(玉米)中DON平均含量为384～9686ng/g；磁县霉菌污染更为严重，DON平均含量在玉米中为7959ng/g，面粉中为1032ng/g。因此粮食及制品中DON的含量监控意义重大。
目前检测DON的方法主要有薄层色谱、酶联免疫、气相色谱、液相色谱、免疫分析等，色谱法对操作技术要求高，检测成本较高，免疫法需要使用价格较昂贵的酶、抗体等生化试剂，而且这些生化试剂存在容易失活等不足。其中酶联免疫法(ELISA)具有快速、方便、预处理简捷等优点，但ELISA的所需DON高效、特异的单抗或多抗制备工艺复杂，所用抗体普遍存在与DON的乙酰化类似物的交叉反应，易出现假阳性；专利CN 102559686A公开了一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体并应用于DON的检测，该法用于DON检测具有高选择性和快速的特点，但需要用到价格昂贵的修饰的DNA。
发明内容
本发明提供一种简单、快速、灵敏的高选择性真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法，该方法主要包括以下步骤：
(1)将脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt与单链信号探针ssDNA杂交，形成DONAp-ssDNA杂交链；
(2)向DONApt-ssDNA杂交链溶液体系中加入待测样品，当待测样品中有脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON存在时，DONApt-ssDNA杂交链选择性地与DON反应生成DONApt-DON，同时释放出单链信号探针ssDNA；
(3)消除体系中剩余杂交链的干扰：DONApt-ssDNA杂交链经DNA扩增，形成双链DNA；双链DNA在核酸外切酶III选择性地催化作用下，迅速水解成单核苷酸而除去；体系中单链信号探针ssDNA不水解而被保留下来；
(4)向体系中加入柠檬酸钠、银离子溶液和还原剂，若体系中有单链信号探针检ssDNA存在，则银离子被诱导生成被ssDNA修饰的近红外荧光银纳米簇(DONApt-DON不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇，只有单链信号探针ssDNA能诱导生成具有强荧光的近红外银纳米簇)；
(5)测定体系中近红外荧光强度，根据近红外荧光强度与DON浓度的关系计算待测样品中的DON的含量。
上述的先后添加的柠檬酸钠、银离子和使银离子迅速还原成近红外荧光银纳米簇的还原剂维生素C构成银离子还原检测体系。
所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-3’。
所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCC GCACTTCACACGATA-3’。
进一步地，步骤(1)所述的杂交，脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt与单链信号探针ssDNA的物质的量之比为1：1；杂交前先分别配成各自的Tris-HCl溶液，然后在85～95℃加热5～10分钟后立即置于冰浴中5～10分钟，Tris-HCl溶液优选浓度50mmol/L，pH为7.5；杂交温度为37℃(此处的杂交温度要求非常严格，只能是37℃，低了，反应难趋于完全，高了，杂交链会重新分开)，时间为1小时以上(1小时就能确保反应完全)。
进一步地，步骤(2)中，DONApt-ssDNA杂交链的物质的量大于待测样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON的物质的量。
进一步地，步骤(3)的扩增水解，具体为：在步骤(2)所得反应液中依次加入扩增缓冲溶液、dNTP溶液和Phi29DNA聚合酶溶液，混匀后反应10～20分钟，再分别加入NH4F-NaCl和核酸外切酶III溶液，在37℃下继续反应20～30分钟；扩增缓冲溶液、dNTP溶液、Phi29DNA聚合酶溶液、NH4F-NaCl溶液、Exo III的体积比为10：18：2：10：2，扩增缓冲溶液由50mMTris-HCl,10mM MgCl2和10mM(NH4)2SO4组成，pH为7.5，dNTP溶液的浓度为10mM，Phi29DNA聚合酶溶液的浓度为10u/μl，NH4F-NaCl溶液由50mM的NH4F溶液与0.2M的NaCl溶液等体积混合而成，Exo III溶液的浓度为20u/μL；脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt、Phi29DNA聚合酶、Exo III的配比为120nmol：20u：40u。
进一步地，步骤(4)的还原具体为：在步骤(3)所得反应液中加入硝酸银溶液和柠檬酸钠缓冲液，再在室温下避光或暗室中放置10～15分钟后，快速搅拌下加入还原剂溶液，然后在45℃下反应5～10分钟；硝酸银溶液、柠檬酸钠缓冲液、还原剂的体积比为1：10：6；柠檬酸钠缓冲液的浓度为10mmol/L，pH为8；还原剂优选为维生素C溶液，浓度为1mmol/L，pH为8；硝酸银溶液与脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt的配比为0.5mmol：3μmol。
本发明的检测原理如下：先让DONApt与ssDNA杂交(下划线部分)，形成DONApt-ssDNA杂交链；向DONApt-ssDNA杂交链溶液体系中加入待测样品，当待测样品中有DON存在时，DONApt-ssDNA杂交链选择性地与DON反应生成DONApt-DON，同时释放出单链信号探针ssDNA；体系中存在DONApt-ssDNA(剩余的)，DONApt-DON和ssDNA。DONApt-DON不能诱导银离子还原生成近红外荧光的银纳米簇，对测定无干扰；杂交链可能有干扰；采取以下措施消除杂交链的干扰：a.DONApt-ssDNA杂交链经DNA扩增，形成双链DNA；b.双链DNA在核酸外切酶选择性地催化作用下，迅速水解成单核苷酸除去；此时体系中可诱导生成近红外荧光的银纳米簇的只有单链信号探针ssDNA；向体系中加入柠檬酸钠、银离子溶液和维生素C溶液，在ssDNA诱导下，银离子还原成被ssDNA修饰的近红外荧光银纳米簇；以波长为590nm左右的光为激发光，测定体系荧光发射(610-680nm)光谱的荧光强度，从而确定真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰，可以提高检测的灵敏度和精度。
本发明还提供了一种检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的试剂盒，包括：脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt、能够与脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。
所述银离子还原检测体系包括先后添加的柠檬酸钠溶液、银离子溶液及使银离子还原成近红外荧光银纳米簇的还原剂溶液，所述的还原剂优选维生素C。
所述脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGT ATCGTGTGAAGTGC-3’。
所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCC GCACTTCACACGATA-3’。
所述DNA扩增体系包括三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP溶液、Phi29DNA聚合酶、NH4F-NaCl溶液和扩增缓冲溶液，所述的扩增缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。
所述核酸外切酶为核酸外切酶III即Exo III。
本发明还提供了一种可用于检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt，其碱基序列为5’-GCATCACTACAGTCATTACG CATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGT ATCGTGTGAAGTGC-3’。
本发明的有益效果在于：
根据本发明的检测方法和试剂盒，可以消除背景荧光的干扰，提高了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测灵敏度和精度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于此。
实施例1
一种检测真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的试剂盒，包括：脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶III、银离子还原检测体系。DONApt为5’-GCATCACTACAGTCATTACG CATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-3’。单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATA-3’。DNA扩增体系包括三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP溶液、Phi29DNA聚合酶、NH4F-NaCl溶液和扩增缓冲溶液，扩增缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。核酸外切酶为ExoIII。所述的银离子还原检测体系包括柠檬酸钠溶液和还原剂维生素C溶液。
实施例2
一种检测真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，具体操作过程如下：
将脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt的Tris-HCl(50mM，pH7.5)溶液和单链信号探针ssDNA的Tris-HCl溶液在90℃下加热5分钟，迅速置于冰浴中5分钟，取出，使其在室温下保存备用。
分别取经上述处理过的含3.0μmol脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA溶液40μL置于2ml离心管中，在37℃下杂交反应1小时；按上述方法制备若干份杂交溶液，然后分别向上述杂交溶液中加入5μL浓度为0～1000ng/mL的脱氧雪腐镰刀菌烯醇,使浓度(按体积为470μL时计算的DON浓度)依次为0ng/mL、0.001ng/mL、0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL，混匀，反应2分钟后，再向上述各反应体系中分别加入10μL pH 7.5的扩增缓冲溶液(缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl,10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4)、18μL dNTP(10mM)溶液和2μL Phi29DNA聚合酶(10u/μl)溶液，混匀，反应10分钟后，再向上述各反应体系中分别加入10μL NH4F(25mM)-NaCl(0.1M)和2μL Exo III核酸外切酶(20u/μL)，在37℃下继续反应20分钟。
再分别向上述各反应液中加入20μL 1mmol硝酸银溶液和200μL柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH 8)。然后，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，再分别向上述各反应液中加入120μL浓度为1mM，pH 8的新制备的维生素C溶液。然后在45℃下反应5分钟。
将上述溶液分别转移至微量比色皿，以波长为590nm左右的光为激发光，测定体系荧光发射(610-680nm)光谱的荧光强度，根据DON浓度及荧光强度的数据可以得到标准曲线方程(为保证测定结果的准确性，每次对样品进行测定前，均重新采用标准样品测定标准曲线)，从而对脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行定量地测定，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测范围为0.01ng/mL–10ng/mL，检测限为9pg/mL。其它真菌毒素等生物小分子对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测无干扰。
实施例3
(1)样品处理
面粉样品1从某超市购得，本底DON值为0.927mg/Kg，实施例3中所用面粉均为面粉样品1中；在面粉样品中进行DON回收率测定。
取9只10mL洁净的小烧杯，分别编号为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3；精确称取0.1g面粉样品3份，分别置于编号为A1、A2、A3的烧杯中，然后再向编号为A1、A2、A3分别加入15μL浓度均为30μg/mL的DON溶液；再精确称取0.25g面粉样品3份，分别置于编号为B1、B2、B3的烧杯中,然后再向编号为B1、B2、B3分别加入15μL浓度均为15μg/mL的DON溶液；还精确称取0.5g面粉样品3份，分别置于编号为C1、C2和C3的烧杯中,然后再向编号为C1、C2、C3分别加入15μL浓度均为5μg/mL的DON溶液；再向上述离心管中加入5mL 0.1M PBS(pH 7.4)溶液，超声5分钟；用whaman 1号滤纸进行过滤；依次得到(样品)编号为A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3的滤液，作为DON(在粉面样品中)回收率测定的试样溶液，备用。
(2)DON回收率测定
将脱氧雪腐镰刀烯醇核酸适体DONApt的Tris-HCl(50mMTris-HCl，pH7.5)溶液和单链信号探针ssDNA的Tris-HCl溶液在90℃下加热5分钟,迅速置于冰浴中5分钟，取出使其保持至室温备用。
在9支2mL离心管中，分别加入经述处理过的含3.0μmol脱氧雪腐镰刀烯醇核酸适体DONApt溶液40μL和含3.0μmol单链信号探针ssDNA溶液40μL，在37℃下反应1小时；然后向上述各反应体系中加入DON回收率测定的试样溶液5μL，混匀，反应2分钟；再向上述各反应体系中分别加入10μL pH 7.5的扩增缓冲溶液(缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl,10mMMgCl2,10mM(NH4)2SO4)、18μL dNTP(10mM)溶液和2μL Phi29DNA聚合酶(10u/μL)溶液，混匀，反应10分钟后，再向上述各反应体系中分别加入10μL NH4F(25Mm)-NaCl(0.1M)溶液和2μLExoIII核酸外切酶(20u/μL)溶液，在37℃下继续反应20分钟。
再分别向上述各反应液中加入20μL 1mmol硝酸银溶液和200μL柠檬酸钠(10mM，pH8)溶液，然后，混合物在室温避光或暗室中放置10分钟，在快速搅拌下，加入120μL浓度为1mM，pH8的新制备的维生素C溶液。然后在45℃下反应5分钟。
将上述溶液分别转移至微量比色皿，以波长为590nm左右的光为激发光，测定各体系荧光发射(610-680nm)光谱的荧光强度，测得DON的回收率依次分别为93.5％、95.2％、96.1％；96.2％、97.2％、98.6％；89.3％、90.6％、91.8％，以上数据表明，回收率都保持在较高的水平，这说明用本发明的方法对DON含量进行检测，准确率高。
实施例4
(1)样品预处理
精确称取从超市购买的面粉(面粉样品2，后述面粉均为面粉样品2)0.25g，加入5mL 0.1M PBS(pH7.4)溶液，超声5分钟；将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤，制得面粉样品提取液，待用。
(2)面粉中DON的测定
将脱氧雪腐镰刀烯醇核酸适体DONApt的Tris-HCl(50mMTris-HCl，pH7.5)溶液和单链信号探针ssDNA的Tris-HCl溶液在90℃下加热5分钟,迅速置于冰浴中5分钟，取出使其保持至室温备用。
分别取经上述处理过的含3.0μmol DONApt溶液40μL和含3.0μmol ssDNA溶液40μL置于2mL离心管中，在37℃下反应1小时；然后，向上述反应溶液中加入面粉样品提取液5μL，混匀，反应2分钟后，再向上述反应体系中加入10μL pH7.5的扩增缓冲溶液(缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl，10mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4)、18μL dNTP(10mM)溶液和2μL Phi29DNA聚合酶(10u/μL)溶液，混匀，反应10分钟后，再向上述反应体系中加入10μL NH4F(25mM)-NaCl(0.1M)溶液和2μL ExoIII核酸外切酶溶液，在37℃下继续反应20分钟。
再向上述反应溶液中加入20μL 1mmol硝酸银溶液和200μL柠檬酸钠(10mM，pH8)，混匀，混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入120μL浓度为1mM,pH8的新配制的维生素C溶液。然后在45℃下反应5分钟。
将上述反应液转移至微量比色皿中，以波长为590nm左右的光为激发光，测定体系荧光发射(610～680nm)光谱的荧光强度，测得面粉中脱氧雪腐镰刀烯醇的含量为0.862mg/Kg。
Figure IDA0000937865300000011

Claims (3)

1.一种非诊断目的的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt与单链信号探针ssDNA杂交，形成DONApt-ssDNA杂交链；
（2）向DONApt-ssDNA杂交链体系中加入待测样品中，当待测样品中有DON时，DONApt-ssDNA杂交链中DONApt的部分能选择性地与DON反应,生成DONApt- DON，同时释放出单链信号探针ssDNA；
（3）体系中剩余的DONApt-ssDNA杂交链经DNA扩增，形成双链DNA，双链DNA在核酸外切酶III选择性地催化作用下水解成单核苷酸而除去，体系中单链信号探针ssDNA被保留下来；
（4）制备近红外银纳米簇：向该体系中加入柠檬酸钠、银离子溶液和还原剂，单链信号探针ssDNA诱导银离子还原生成强荧光的近红外银纳米簇；
（5）检测体系的近红外荧光强度，根据近红外荧光强度与DON浓度的关系计算待测样品中的DON的含量；
所述的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-3’；
所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATA-3’；
步骤（1）所述的杂交，脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt与单链信号探针ssDNA的物质的量之比为1：1；杂交前先分别配成各自的Tris-HCl溶液，然后在85~95℃加热5~10分钟后立即置于冰浴中处理5~10分钟，Tris-HCl溶液的浓度50 mmol/L，pH为7.5；杂交温度为37℃，时间为1小时以上；
步骤（2）中，DONApt-ssDNA杂交链的物质的量大于待测样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇DON的物质的量；
步骤（3）的扩增水解，具体为：在步骤（2）所得反应液中依次加入扩增缓冲溶液、dNTP溶液和Phi29 DNA 聚合酶溶液，混匀后反应10~20分钟，再加入NH4F -NaCl和Exo III核酸外切酶溶液，在37℃下继续反应20~30分钟；扩增缓冲溶液、dNTP溶液、Phi29 DNA 聚合酶溶液、 NH4F-NaCl溶液、Exo III的体积比为10：18：2：10：2，扩增缓冲溶液由50mM Tris-HCl,10 mM MgCl2和10 mM (NH4)2SO4组成，pH 为7.5，dNTP溶液的浓度为10 mM， Phi29 DNA 聚合酶溶液的浓度为10 u/µl， NH4F-NaCl溶液由50 mM的NH4F溶液与0.2M的NaCl溶液等体积混合而成，Exo III溶液的浓度为20 u/μL；脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt、Phi29DNA 聚合酶、Exo III的配比为120 nmol：20u：40u；
步骤（4）的还原具体为：在步骤（3）所得反应液中加入硝酸银溶液和柠檬酸钠缓冲液，再在室温下避光或暗室中放置10~15分钟后，快速搅拌下加入还原剂溶液，然后在45℃下反应5~10分钟；硝酸银溶液、柠檬酸钠缓冲液、还原剂的体积比为1：10：6；柠檬酸钠缓冲液的浓度为10 mmol/L，pH为 8；还原剂为维生素C溶液，浓度为1mmol/L，pH为 8；硝酸银溶液与脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt的配比为0.5 mmol：3 μmol。
2.一种真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测试剂盒，其特征在于，包括：脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体系；所述DONApt为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCC CGGAGGCGGTATCGTGTGAA GTGC-3’；
所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCC GCACTTCACACGATA-3’；
所述DNA扩增体系包括三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP溶液、Phi29 DNA 聚合酶溶液、NH4F-NaCl溶液 和扩增缓冲溶液, 所述的扩增缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2和 (NH4)2SO4组成；
所述的外切酶为核酸外切酶III即Exo III；
所述的银离子还原检测体系包括先后添加的柠檬酸钠溶液、银离子溶液及使银离子还原成近红外荧光银纳米簇的还原剂。
3.一种可用于检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体DONApt，其特征在于，其碱基序列为5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTA AGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-3’。
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