CN108410949B - 一种检测核酸外切酶i活性的探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用。所述探针是由单链DNA为模板制备的DNA/Au纳米簇，即ssDNA‑AuNCs；所述单链DNA由4‑30个重复的AC碱基序列构成。所述ssDNA‑AuNCs探针由水合氯金酸和单链DNA及抗坏血酸反应合成，以金纳米簇为荧光物质，制备方法简单，易操作，制得的探针荧光反应明显，本发明利用核酸外切酶I剪切单链DNA分子的特性，以及复合在单链DNA分子上的Au纳米簇在失去DNA分子保护后会聚集在一起失去荧光的特性，通过核酸外切酶I与所述探针反应后体系的荧光变化，判断核酸外切酶I的活性，检测方式简单，可靠性高。
Description
技术领域
本发明涉及酶活性的检测技术领域，具体涉及一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用。
背景技术
核酸外切酶I(Exonuclease I,ExoI)是单链特异性3’→5’核酸外切酶，从ssDNA的3’-OH末端分解生成5’-单核苷酸。对单链DNA的特异性非常高，不分解双链DNA及RNA。核酸外切酶I对单链DNA的高度特异性，使其成为分子生物学领域中一种非常重要的工具酶，应用非常广泛。金纳米簇(AuNCs)是一种新型的荧光纳米材料，其具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点。
荧光检测法在研究中不会破坏样品、灵敏度高，适应用来做生物技术领域的检测。近年来，有利用荧光法检测核酸外切酶活性的方法，而这些方法都存在一些缺点，如反应时间过长，需要对核酸探针进行荧光基团以及猝灭基团的双标记或者需要外加猝灭材料，灵敏度低、选择性差，需要严格精密地设计DNA的碱基序列，方能达到较好的猝灭效果，荧光染料分子标记的DNA探针非常昂贵等问题，大大地增加了实验体系的复杂性以及成本，从而限制了检测方法的应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用，所述ssDNA-AuNCs探针以AC碱基序列重复的单链DNA为模板，以合成的金纳米簇为荧光物质，不需要提前对DNA链进行修饰，合成金纳米簇的过程简单，探针荧光反应明显，且成本低、易操作、普及性强；本发明利用核酸外切酶I剪切单链DNA分子的特性，以及复合在单链DNA分子上的Au纳米簇在失去DNA分子保护后会聚集成较大粒子失去荧光的特性，通过核酸外切酶I与所述探针反应后体系的荧光变化，判断核酸外切酶I的活性，检测方式简单，可靠性高。
本发明的技术方案为：一种检测核酸外切酶I活性的探针，其特征在于：所述探针是由单链DNA为模板制备的DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述单链DNA由4-30个重复的AC碱基序列构成。
一种检测核酸外切酶I活性的探针的制备方法，其特征在于，通过以下方法制得：
1)将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到8-12μM DNA溶液；
2)将水合氯金酸加入到步骤1)所述DNA溶液中得到混合溶液，所述混合溶液中水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为16-20:1，搅拌3-10分钟；
3)再在所述混合溶液中加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为20-40:1，然后在70-90℃搅拌1-6小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；
所述单链DNA由4-30个重复的AC碱基序列构成。
一种检测核酸外切酶I活性的探针的制备方法，其特征在于，通过以下方法制得：
1)将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到10μM DNA溶液；
2)将水合氯金酸加入到步骤1)所述DNA溶液中得到混合溶液，所述混合溶液中水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为18:1，搅拌5分钟；
3)再在所述混合溶液中加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为30:1，然后在80℃搅拌1-6小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针。
所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0。
一种检测核酸外切酶I活性的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)配制缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl,溶液；
2)将ssDNA-AuNCs探针加入步骤1)所述缓冲液中得到混合液，所述ssDNA-AuNCs探针与所述缓冲液的体积比为5-15:1；所述ssDNA-AuNCs探针与所述缓冲液的优选体积比为10:1；
3)在步骤2)所述混合液中在加入不同活性的核酸外切酶I，然后在30-40℃下孵育30-60分钟，再用荧光光谱仪检测不同活性核酸外切酶I反应后所述混合液对应的荧光强度，绘制荧光强度随核酸酶活性变化的标准曲线；
4)按照步骤3)的方法检测待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确定酶的活性。
所述缓冲液的成分为20mM Tris-HCl，且含有0.5mM乙二胺四乙酸，1mM二硫苏糖醇和50％甘油，所述缓冲液pH值为7.5。
所述ssDNA-AuNCs探针为权利要求1所述ssDNA-AuNCs探针。
所述步骤2)中不同活性核酸外切酶I共有7个，活性依次为0.05U/ml、0.1U/ml、0.15U/ml、0.2U/ml、0.25U/ml、0.3U/ml、0.35U/ml。
本发明的技术效果为：
本发明所述探针的单链DNA由4-30个重复的AC碱基序列构成，碱基的总数量8到60之间，所述探针以Au纳米簇为荧光物质，合成过程简单易得且成本低，易操作；所述Au纳米簇复合在单链DNA上时粒径较小，能发出荧光，荧光强度高，当核酸外切酶I对单链DNA分子剪切后，DNA分子生成单核苷酸，Au纳米簇纳米粒子失去保护，聚集成团，从而减弱或者失去荧光，使得所述探针与核酸外切酶I反应完成后的体系荧光减弱，本发明利用所述探针的这一特性，绘制核酸外切酶I的活性与探针荧光强度变化关系标准曲线，快速检测核酸外切酶I的活性，所述单链DNA上AC重复序列在48个碱基时，合成的ssDNA-AuNCs探针的荧光是最强的，对核酸外切酶I的检测灵敏度高；经过实验检测，探针上Au纳米簇粒径在所述探针与核酸外切酶I反应前后变化明显，荧光强度区别大，所述探针在对核酸外切酶I活性的检测上，方法简单，操作方便，准确度高。
附图说明
图1为本发明实施例7中所述探针ssDNA-Au NCs的激发光谱及发射光谱；
图1中标识为a的为ssDNA-Au NCs的激发光谱，标识为b的为ssDNA-Au NCs的发射光谱。
图2为本发明实施例7中所述探针ssDNA-Au NCs加入5U/ml Exo I前的TEM图。
图3为本发明实施例7中所述探针ssDNA-Au NCs加入5U/ml Exo I后的TEM图。
图4为本发明实施例7中所述探针ssDNA-Au NCs加入不同活性核酸外切酶1的荧光光谱叠加图。
图5为本发明实施例7中所述探针ssDNA-Au NCs荧光强度与核酸外切酶1的活性关系线形图。
图4和图5为对应关系，图4中的a所标识的荧光光谱为未加入核酸外切酶1时，探针ssDNA-Au NCs的荧光光谱。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面将结合实施例和附图来做进一步说明。
所述实施例中单链DNA为市购获得，由“生工生物工程(上海)股份有限公司”合成；血清样本来源于人血清。
实施例1
将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到8μM DNA溶液，将水合氯金酸加入到所述DNA溶液中，所述水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为16:1，搅拌3分钟，再加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为20:1，然后在70℃搅拌6小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0；所述单链DNA由4个重复的AC碱基序列构成，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到12μM DNA溶液，将水合氯金酸加入到所述DNA溶液中，所述水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为20:1，搅拌10分钟，再加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为40:1，然后在90℃搅拌1小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0；所述单链DNA由6个重复的AC碱基序列构成，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例3
将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到10μM DNA溶液，将水合氯金酸加入到所述DNA溶液中，所述水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为18:1，搅拌5分钟，再加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为30:1，然后在80℃搅拌4小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0；所述单链DNA由8个重复的AC碱基序列构成，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例4
将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到10μM DNA溶液，将水合氯金酸加入到所述DNA溶液中，所述水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为18:1，搅拌5分钟，再加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为30:1，然后在80℃搅拌4小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0；所述单链DNA由12个重复的AC碱基序列构成，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例5
将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到10μM DNA溶液，将水合氯金酸加入到所述DNA溶液中，所述水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为18:1，搅拌5分钟，再加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为30:1，然后在80℃搅拌4小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0；所述单链DNA由16个重复的AC碱基序列构成，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.5所示。
实施例6
将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到10μM DNA溶液，将水合氯金酸加入到所述DNA溶液中，所述水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为18:1，搅拌5分钟，再加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为30:1，然后在80℃搅拌4小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0；所述单链DNA由20个重复的AC碱基序列构成，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例7
将单链DNA溶于磷酸缓冲液中得到10μM DNA溶液，将水合氯金酸加入到所述DNA溶液中，所述水合氯金酸与所述单链DNA的摩尔比为18:1，搅拌5分钟，再加入抗坏血酸，所述抗坏血酸与所述单链DNA的摩尔比为30:1，然后在80℃搅拌4小时后合成得到DNA/Au纳米簇，即ssDNA-AuNCs探针；所述磷酸缓冲液浓度为20mM，pH值为7.0；所述单链DNA由24个重复的AC碱基序列构成，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例8
将实施例7制得的ssDNA-AuNCs探针用荧光光谱仪进行检测，结果如图1所示，在激发光波长为301nm时，ssDNA-AuNCs探针在456nm的波长下荧光强度最大，从图1中可以看出制备的ssDNA-AuNCs探针能被激发出荧光，是带有荧光的探针。
实施例9
将实施例7制得的ssDNA-AuNCs探针在透射电子显微镜下观察，得到的TEM图如图2所示，金纳米簇的粒径在2-5nm，分散较均匀，将实施例7制得的ssDNA-AuNCs探针中5U/ml核酸外切酶I(Exo I)，所述核酸外切酶I反应完成后，在透射电子显微镜下观察，得到的TEM图如图3所示，失去DNA链段保护的金纳米簇聚集成团，分散不均。
实施例10
按实施例7制备7份ssDNA-AuNCs探针，每一份探针中加入Tris-HCl缓冲溶液得到混合液，所述混合液中ssDNA-AuNCs探针与Tris-HCl缓冲液的体积比为10:1；所述缓冲液的成分为20mM Tris-HCl，且含有0.5mM乙二胺四乙酸，1mM二硫苏糖醇和50％甘油，pH值为7.5，再在所述混合液中加入一份核酸外切酶I形成反应体系，共有7份核酸外切酶I，所述核酸外切酶I的活性依次为0.05U/ml、0.1U/ml、0.15U/ml、0.2U/ml、0.25U/ml、0.3U/ml、0.35U/ml，然后在37℃下孵育40分钟，再用荧光光谱仪测定每份ssDNA-AuNCs探针所在体系的荧光强度，结果如图4所示，未加入核酸外切酶I的ssDNA-AuNCs探针发射光谱和反应完成后7个所述反应体系发射光谱的叠加图；根据图4，选定各个反应体系在456nm波长下的荧光强度为标准值，绘制所述荧光强度随核酸外切酶性变化的标准曲线，结果如图5所示。
实施例11
对待测核酸外切酶I进行活性检测：
首先处理血清样品：将血清在10000rpm作用下离心10分钟，加入甲醇，血清样品与甲醇体积比为1:3，充分振荡2分钟，再在12000rpm转速下离心10分钟，取上清液，在所述上清液中加入按实施例7步骤制得的ssDNA-AuNCs探针得到A溶液，所述A溶液中上清液与ssDNA-AuNCs探针的体积比为1：10，再在所述A溶液中加入20mM Tris-HCl缓冲液得到混合液，所述混合液中Tris-HCl缓冲液与所述A溶液的体积比为1：10，所述Tris-HCl缓冲液还含有0.5mM乙二胺四乙酸，1mM二硫苏糖醇和50％甘油，pH值为7.5，将上述混合溶液分成三份，分别加入0.05U/ml,0.1U/ml,0.2U/ml的标准核酸外切酶I，测定每份上清液反应完成后的的荧光值，荧光分别降为582,527，440。对比图5得到检测的浓度分别为0.06U/ml,0.12U/ml,0.21U/ml，分析结果如表1所示。
表1.在人血清样本中测定核酸外切酶的浓度。
从上述实施例1-11可以看出，本发明所述探针制备过程简单，操作简易，制备成本低，制得的探针上金纳米簇分散均匀，粒径小，能发出荧光，荧光强度高，当核酸外切酶I加入后，所述探针与核酸外切酶I反应完成后，金纳米簇发生聚集，分散不均，体系荧光减弱，本发明利用所述探针和核酸外切酶I的特性，测定所述探针与不同活性核酸外切酶I反应后的荧光强度，绘制核酸外切酶I的活性与探针荧光强度变化关系标准曲线，利用所述标准曲线快速检测核酸外切酶I的活性，如实施例11所示，在血清环境中，测得的核酸外切酶I活性准确度高，说明本发明所述检测方法实际应用性强。实施例7中单链DNA上AC重复序列在48个碱基时，合成的ssDNA-AuNCs探针的荧光是最强的，检测最灵敏，因此，所述探针在对核酸外切酶I活性的检测上，方法简单，操作方便，准确度高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变性和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种检测核酸外切酶I活性的探针及其制备方法和应用
<130> 2017.12
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 1
acacacac 8
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 2
acacacacac ac 12
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 3
acacacacac acacac 16
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 4
acacacacac acacacacac acac 24
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 5
acacacacac acacacacac acacacacac ac 32
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 6
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(artificial synthesis)
<400> 7
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacac 48
Claims (3)
1.一种检测核酸外切酶I活性的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)配制缓冲液，所述缓冲液为Tris-HCl溶液；
2)将ssDNA-AuNCs探针加入步骤1)所述缓冲液中得到混合液，所述 ssDNA-AuNCs 探针与所述缓冲液的体积比为10:1；
3)在步骤2)所述混合液中再加入不同活性的核酸外切酶I，然后在 30-40℃下孵育30-60 分钟，再用荧光光谱仪检测不同活性核酸外切酶I反应后所述混合液对应的荧光强度，绘制荧光强度随核酸酶活性变化的标准曲线；
4)按照步骤3)的方法检测待测样品的荧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确定酶的活性；
所述ssDNA-AuNCs探针为由单链 DNA 为模板制备的 DNA/Au 纳米簇，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述一种检测核酸外切酶 I 活性的方法，其特征在于，所述缓冲液的成分为20mM Tris-HCl，且含有0.5mM 乙二胺四乙酸，1mM 二硫苏糖醇和50％甘油，所述缓冲液pH值为7.5。
3.根据权利要求1所述一种检测核酸外切酶I活性的方法，其特征在于，所述步骤2)中不同活性核酸外切酶I共有7个，活性依次为0.05U/ml、0.1U/ml、0.15U/ml、0.2U/ml、0.25U/ml、0.3U/ml、0.35U/ml。
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| 罗岚.金属纳米簇的合成与光分析应用.《中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2018,(第2期), * |
| 金属纳米簇的合成与光分析应用;罗岚;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180215(第2期);B020-631 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108410949A (zh) | 2018-08-17 |
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