CN113552104A

CN113552104A - 一种dna三通结-银簇比率型荧光传感器及检测氯霉素的方法

Info

Publication number: CN113552104A
Application number: CN202110818931.2A
Authority: CN
Inventors: 郭亚辉; 董菡; 李恒超; 钱和; 成玉梁; 杨方威; 于航; 谢云飞; 姚卫蓉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113552104B

Abstract

本发明涉及一种DNA三通结‑银簇比率型荧光传感器及检测氯霉素的方法，属于分析检测技术领域。本发明采取3条DNA序列通过碱基互补配对两两连接，形成DNA三通结结构；其中两条链末端可合成AgNCs，另一条为氯霉素的适配体序列，获得含有二聚体的DNA‑AgNCs比率型荧光传感器。该比率传感器可以在较低浓度下检测氯霉素，有着出色的检测范围和灵敏度，避免了多种因素的干扰，提供了内置的自校准功能，减少环境的影响，能够灵敏地检测出样品中的氯霉素，选择性和特异性都更加出色。

Description

一种DNA三通结-银簇比率型荧光传感器及检测氯霉素的方法

技术领域

本发明涉及一种DNA三通结-银簇比率型荧光传感器及检测氯霉素的方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

氯霉素是一类具有抗菌活性的广谱抗生素，被广泛用作畜牧业控制疾病的兽药。但因其对人体具有较强毒性，我国农业部已明文规定将氯霉素及其盐、酯类列入禁止使用药物。但近年来，氯霉素在食品和环境中仍有检出。需要发展快速高灵敏的检测方法增强对氯霉素的残留监测。

目前，检测氯霉素的方法主要有仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱联用、液相色谱光电二极管、气相色谱法等，仪器分析法虽灵敏度高，检出限低，但此法需借助大型仪器，成本昂贵，且样品预处理耗时，操作专业度高。免疫分析法包括酶联免疫吸附法、荧光免疫法、免疫层析法等，该方法特异性和灵敏度强，可以达到快速检测的目的。但免疫分析法依赖免疫学反应，所用原料为抗体，生产成本高、周期长，不易保存且免疫活性易环境影响。两种方法在氯霉素的现场快速检测中均存在局限性。适配体是通过指数富集系统进化技术筛选获得的一段DNA或RNA序列，可识别并结合特定靶标，利用标记物质呈现的光学变化来进行快速检测。DNA碱基可与Ag⁺错配，当适配体核心区域聚集几个至几百个银原子时可形成分子级聚集体，即DNA银纳米簇(DNA-AgNCs)。该技术具有特异性强、亲和力好、合成方法简单、稳定性好、易于修饰、靶物种范围广、可重复使用等特点，被广泛应用于食品安全、食品包装、环境监测、生物学应用等领域。

目前，基于DNA-AgNCs的针对氯霉素检测的荧光传感器的信号输出模式多为单一波长的荧光淬灭型或荧光增强型，这两种方法现象显示明显但易出现假阴性和假阳性。

发明内容

为了解决上述残留氯霉素检测不便或不准确的问题，本发明基于银簇二聚体、DNA三通结和比率传感器的优良性质，提供了一种检测氯霉素的双信号比率检测方法。

本发明采取DNA三通结双信号传感器模式，3条DNA序列通过碱基互补配对两两连接，形成DNA三通结结构。其中两条链末端可合成AgNCs，另一条为氯霉素的适配体序列，构建得到含银簇二聚体的DNA-AgNCs检测传感器。当CAP不存在时，由于DNA三通结稳定的结构，AgNCs相互靠近发射强烈红色波长的荧光；当CAP存在时，CAP和其适配体结合，DNA三通结被打开，从而使得两条DNA-AgNCs的模板链被分开，此时红色荧光降低，而黄色荧光增强。此双信号比率传感器可以在较低浓度下检测氯霉素，有着出色的检测范围和灵敏度。相较于独立氯霉素适配体-银簇检测体系，本DNA三通结-银簇比率型传感器方法可利用在不同波长下两个或多个荧光信号值的变化，提高动态响应的范围，避免了多种因素的干扰，提供了内置的自校准功能，减少环境的影响，能够灵敏地检测出样品中的氯霉素，选择性和特异性都更加出色。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供一种制备DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的方法，包括如下过程：

(1)DNA三通结的构建：利用氯霉素适配体、模板I链、模板II链进行相互杂交，然后在95℃下退火5min，结束后，冷却，获得DNA三通结溶液；其中，氯霉素适配体的序列如SEQID NO.1所示；模板I链的序列如SEQ ID NO.2所示；模板II链的序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)银簇的制备：将步骤(1)所得的DNA三通结溶液分散在水中形成分散液，分散液与TAE/Mg²⁺缓冲液、AgNO₃水溶液混合，混匀形成混合液，避光放置；然后向混合液中加入NaBH₄水溶液，DNA三通结、NaBH₄与AgNO₃的摩尔比为1:20:20，混匀反应，反应结束后，即得DNA三通结-银簇比率型荧光传感器。

在本发明的一种实施方式中，模板I链的序列为5’-CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTT-3’；模板II链的序列为5’-AAAAAAACCCCCTAATTCCCCC-3’；氯霉素适配体的序列为5’-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，是通过预先配制3种DNA样品溶液，混合并控制3种DNA终浓度相同，进行相互杂交；其中，DNA三通结溶液为100μmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中，相互杂交时，控制氯霉素适配体、模板I链、模板II链的摩尔比为1:1:1。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，分散液中DNA三通结溶液与水的体积用量比为1:10-12；具体可选1：10.7。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，TAE/Mg²⁺缓冲液的稀释倍数为1×。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，稀释倍数为10×的TAE/Mg²⁺缓冲液的配制为C₄H₆O₄Mg·4H₂O 2.68g、EDTA 0.29g、Tris 4.85g定容至100ml。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，TAE/Mg²⁺缓冲液的pH值为7.5。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，分散液与TAE/Mg²⁺缓冲液的体积用量比为8.8:1。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，DNA三通结在混匀后的终体系中浓度为2.5μmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，AgNO₃水溶液的浓度为5mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，NaBH₄水溶液的浓度为5mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，AgNO₃、NaBH₄在混匀后的终体系中浓度均为50μmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中，混匀反应的时间为3h；温度为20℃。

在本发明的一种实施方式中，制备DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的方法具体包括：

(1)DNA三通结的构建：

取等摩尔的DNA样品(序列1：5’-CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTT-3’、序列2：5’-AAAAAAACCCCCTAATTCCCCC-3’、序列3：5’-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’)进行相互杂交，使体系中不同DNA终浓度相同，将装有DNA样品的离心管放入水浴锅中95℃退火5min，然后取出DNA链缓慢降温(约1min降1℃)，冷却至室温，获得DNA三通结溶液，备用；

(2)AgNCs的制备：

取(1)中的DNA三通结溶液分散在水中，加入pH值为7.5的TAE/Mg²⁺缓冲液及AgNO₃溶液，然后强力振荡30s，混合均匀后避光放置1h，加入现配的NaBH₄溶液，使选择DNA三通结，NaBH₄与AgNO₃的浓度比为1:20:20，强力振荡1min，得到的溶液于恒温培养器中震摇3h。

本发明利用上述方法制备提供了一种DNA三通结-银簇比率型荧光传感器。

本发明提供一种氯霉素残留检测方法，包括以下过程：

(a)步骤(2)中的混匀反应结束后，获得含有DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的混合体系；然后将一系列已知氯霉素浓度的标准样品加入到含有DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的混合体系中、混匀反应，然后分别测得相应荧光强度F，以及氯霉素浓度为0时的荧光强度F₀，并计算获得相对荧光强度I_F＝(F₀-F)/F₀；利用相对荧光强度与氯霉素浓度进行线性关联，获得定量检测模型；

(b)待测样品溶液加入到含有DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的混合体系中，获得其相对荧光强度，然后通过步骤(a)所得定量检测模型，测得待测样品溶液中氯霉素含量。

在本发明的一种实施方式中，步骤(a)中混匀反应的温度为20℃，时间为1.5h。

在本发明的一种实施方式中，一系列已知氯霉素浓度为0.01-0.5nmol/L。

在本发明的一种实施方式中，将氯霉素样品溶液加入含有DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的混合体系中，充分震荡1min，使其混合均匀，置于恒温培养器中20℃恒温震摇1.5h，进行荧光测定。

本发明的优点和效果：

本发明运用适配体结合技术检测氯霉素，具有特异性强、亲和力好、合成方法简单、稳定性好、易于修饰、靶物种范围广等优点。

本发明利用DNA-AgNCs作为信号输出探针，具有波长可协调、合成方法简单、生物相容性好、量子产率高、荧光性质稳定等优点。

本发明采用比率型传感模式，减少了假阴性和假阳性率，提高动态响应的范围，避免了多种因素的干扰，提供了内置的自校准功能，减少环境的影响。靶标的有无对应现象为黄红两色，颜色色调特征变化大，视觉感知明显。

本发明最低检出限可达9.8pmol/L，回收率为90.37％～106.72％，准确性良好；对氯霉素检测的相对荧光强度为其他类抗生素的5～7倍，对氯霉素有着良好的选择性和特异性，可在成分复杂的样品中进行检测。

附图说明

图1为比率型荧光传感器检测氯霉素原理示意图。

图2为相对荧光强度与氯霉素目标浓度(0.01-0.5nmol/L)之间的线性范围图。

具体实施方式

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的构建

(1)DNA三通结的连接：

将3种DNA样品按照1:1:1摩尔比(序列1：5’-CCCCCTTAATCCCCCTTTTTTT-3’、序列2：5’-AAAAAAACCCCCTAATTCCCCC-3’、序列3：5’-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3’)在离心管中进行相互杂交，使体系中不同DNA终浓度相同，为100μmol/L，将装有杂交后的DNA样品的离心管放入水浴锅中95℃退火5min，然后取出离心管缓慢降温(约1min降1℃)，冷却至室温，获得浓度为33.33μmol/L的DNA三通结样品液，备用。

(2)AgNCs的制备：

取(1)中获得的DNA三通结样品液75μL于805μL超纯水中，配制成DNA分散液；将分散液加入pH值为7.5的TAE/Mg²⁺缓冲液(10×，100μL)及AgNO₃水溶液(5mmol/L，10μL)，然后强力振荡30s，混合均匀后避光放置1h，加入现配的NaBH₄水溶液(5mmol/L，10μL)，使选择DNA三通结，NaBH₄与AgNO₃的摩尔比为1:20:20，强力振荡1min，得到的溶液于恒温培养器中震摇3h，获得含有DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的分散液。

实施例2

将一系列已知浓度的氯霉素标准样品(0.01nmol/L、0.05nmol/L、0.1nmol/L、0.2nmol/L、0.3nmol/L、0.4nmol/L、0.5nmol/L、1nmol/L、2nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L、80nmol/L、100nmol/L)加入到实施例1获得的含有DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的分散液中，获得浓度为0时的荧光强度F₀，以及浓度不为0时的荧光强度F，计算获得各浓度对应的相对荧光强度I_F＝(F₀-F)/F₀，利用相关荧光强度和氯霉素浓度构建线性检测模型(如图2所示)。回归方程是Y＝1.0543X+0.0867，线性相关关系(R₂＝0.9887)，线性范围在0.01-0.5nmol/L内，最低检出限是9.8pmol/L。

如图1为DNA三通结比率型荧光传感器检测氯霉素原理示意图。包括：银纳米簇1，AgCNs合成模板Ⅰ链2，AgCNs合成模板Ⅱ链3，氯霉素适配体4，氯霉素5。该策略包含了三个反应阶段：

(1)AgCNs合成模板Ⅰ链2、AgCNs合成模板Ⅱ链3、氯霉素适配体4三条DNA链连接形成DNA三通结阶段6。

(2)DNA三通结结合银纳米簇1合成AgNCs阶段7。

(3)氯霉素5和DNA三通结的反应阶段8。

在最终的检测体系中含有3条DNA序列，分别通过碱基互补配对两两连接，AgCNs合成模板Ⅰ链2、AgCNs合成模板Ⅱ链3末端为可合成AgNCs的序列。当氯霉素5不存在时，由于DNA三通结稳定的结构，AgCNs合成模板Ⅰ链2、AgCNs合成模板Ⅱ链3的末端相互靠近发射强烈红色波长的荧光；当氯霉素5存在时，由于氯霉素5和氯霉素适配体4的结合力较强，故此时溶液中的DNA三通结被打开，从而使得AgCNs合成模板Ⅰ链2、AgCNs合成模板Ⅱ链3的模板被分开，此时红色荧光降低，而黄色荧光增强。

实施例3加标回收验证

为了考察本方法的准确性和可靠性，在处理后的牛奶中，对添加线性范围内的氯霉素浓度(0.01nmol/L、0.1nmol/L、0.5nmol/L)进行了回收实验。回收率为90.37％～106.72％，结果显示该方法具有良好的准确性，可以在复杂的原料奶中进行检测。

对比例1：

单纯适配体DNA-AgCNs：

按照实施例1中的步骤(2)，使用单独的氯霉素适配体DNA替换DNA三通结，其他不变，获得相应的DNA-AgCNs传感器。

结果发现：独立使用该氯霉素适配体形成的DNA-AgCNs传感器检测氯霉素的线性相关性显著低于本发明，且检测限不低于0.05nmol/L之间，是本发明最低检测限的5倍以上。且对氯霉素选择性较差，在实际样品检测过程中易出现假阳性或假阴性。本发明所构建的DNA三通结与银纳米簇结合的检测方法，灵敏度高，准确性好，是检测氯霉素的有益方法。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种DNA三通结-银簇比率型荧光传感器及检测氯霉素的方法

<130> BAA210922A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag 40

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccccttaat cccccttttt tt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaaaaccc cctaattccc cc 22

Claims

1.一种制备DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的方法，其特征在于，包括如下过程：

(1)DNA三通结的构建：利用氯霉素适配体、模板I链、模板II链进行相互杂交，然后在95℃下退火5min，结束后，冷却，获得DNA三通结；其中，氯霉素适配体的序列如SEQ ID NO.1所示；模板I链的序列如SEQ ID NO.2所示；模板II链的序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)银簇的制备：将步骤(1)所得的DNA三通结分散在水中形成分散液，分散液与TAE/Mg²⁺缓冲液、AgNO₃水溶液混合，混匀形成混合液，避光放置；然后向混合液中加入NaBH₄水溶液，混匀反应，反应结束后，即得DNA三通结-银簇比率型荧光传感器。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，DNA三通结、NaBH₄、AgNO₃的摩尔比为1:20:20。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，相互杂交时，控制氯霉素适配体、模板I链、模板II链的摩尔比为1:1:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，混匀后，DNA三通结的浓度为2.5μmol/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，TAE/Mg ²⁺缓冲液的pH值为7.5；分散液与TAE/Mg ²⁺缓冲液的体积用量比为8.8:1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，AgNO₃水溶液的浓度为5mmol/L；NaBH₄水溶液的浓度为5mmol/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，混匀后，AgNO₃、NaBH₄水溶液的浓度均为50μmol/L。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，混匀反应的时间为3h；温度为20℃。

9.权利要求1-8任一项所述方法制备的一种DNA三通结-银簇比率型荧光传感器。

10.一种氯霉素残留检测方法，其特征在于，包括以下过程：

(a)将一系列已知氯霉素浓度的标准样品加入到含有权利要求9所述的DNA三通结-银簇比率型荧光传感器的混合体系中、混匀反应，然后分别测得相应荧光强度F，以及氯霉素浓度为0时的荧光强度F₀，并计算获得相对荧光强度I_F＝(F₀-F)/F₀；利用相对荧光强度与氯霉素浓度进行线性关联，获得定量检测模型；