CN109187992A - 一种新型比率型免标记荧光传感器及其应用 - Google Patents

一种新型比率型免标记荧光传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型比率型免标记荧光生物传感器用于超灵敏高特异性检测铅离子(Pb2+)，其特征在于：所构建荧光生物传感器是基于以DNA为模板合成的具有双发射的荧光银纳米团簇，该荧光探针具有合成方法简单、稳定性好、成本低的显著优势，在560nm(绿色)和685nm(红色)处显示出两个特征发射峰。Pb2+存在时可引起560nm处荧光增强而685nm处的荧光降低。二者的荧光强度比值(F560/F685)与Pb2+在0.001nM至10nM浓度范围呈现良好的线性关系，且对Pb2+有很好的选择性，对铜、锌、锰、钙、镉、铁、镁、钾、镍、铬等金属离子无明显响应；本发明提供的方法能够满足现场快速、准确的检测要求，可进一步应用于研制相关试剂盒、试纸条。

Description

一种新型比率型免标记荧光传感器及其应用
技术领域
本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种重金属Pb2+的快速检测方法。本发明属于检测技术领域。
背景技术
铅离子(Pb2+)是一种不可降解的环境污染物，对人体健康的危害十分严重。例如，血液中即使存在微量的Pb2+也会对人体造成不可逆的脑损伤和精神发育的迟滞，特别是对于血脑屏障尚不完善的婴幼儿和儿童而言，其危害更甚。因此，开发可靠的超灵敏的Pb2+传感器来实现环境和生物样品中的Pb2+检测具有重要的意义。目前对于重金属Pb2+检测方法的文献报道较多(Chemical Communications,2015，51，979-995.；J.Am.Chem.Soc.,2007，129，262-263.；Analytical Chemistry,2012，84，3703-3709.；Chemical Communications,2011，47，6278-6280.；Analyst,2014，139，6326-6342.)，大多数是基于“8-17”DNAzyme的设计，利用不同的读出信号，如电化学，比色法和荧光技术实现对Pb2+的检测。其中荧光检测技术因具有超高的灵敏度而备受关注，然而单一荧光信号的荧光探针具有不可忽视的缺点，容易受环境因素影响从而产生假阴性或假阳性结果。因此，亟需开发出新型荧光探针用于Pb2+的超灵敏检测。比率型荧光探针具有内校正性质，可以有效消除环境因素的影响。基于以上考虑，我们开发了一种免标记、特异性强、稳定性好、检测速度快、操作简单且成本低的快速Pb2+检测方法。其检测结果具有良好的重现性，确保了检测结果的准确度。
发明内容
本发明针对Pb2+检测的重大需求，设计并合成出适用于现场快速、准确检测实际样品中低浓度Pb2+的新型比率型免标记荧光传感器。该体系也可进一步应用于研制相关试剂盒、试纸条。为达到上述目的，本发明创造的技术方案如下：
本方法将DNA为模板的银纳米团簇与Pb2+依赖的DNA酶相结合，基于Pb2+对其特异性识别位点的切割，在加入Pb2+室温孵育3.5h后，使得ds-DNA-AgNCs荧光发生变化，其荧光强度比值(F560/F685)与Pb2+浓度的对数呈现线性关系，可用于标准样品和实际样品中Pb2+的定量检测。
本发明Pb2+生物传感器的构建具体包括以下步骤：
(1)G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：首先将0.5μM G-DNA模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μM AgNO3溶液和3.0μM NaBH4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的G-DNA-AgNCs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度F560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度F685；
(2)Pb2+传感体系的构建：在G-DNA-AgNCs体系中加入R-DNA进行杂交反应，形成由G-DNA与R-DNA，双链的G-DNA/R-DNA为模板的银纳米团簇(命名为ds-DNA-AgNCs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本发明所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测Pb2+。
本发明新型比率型免标记荧光传感器的应用，用于快速检测Pb2+的具体方法是：
(1)所述ds-DNA-AgNCs传感体系中G-DNA包含形成Pb2+特异切割位点的DNAzyme序列G1及可结合AgNCs的模板序列G2；R-DNA包含有与G1互补的R1序列、Pb2+可切割位点的rA序列及与G2-1部分互补的模板R2-1序列，R-DNA被分裂为两部分，其中R2部分从ds-DNA-AgNCs中释放，导致685nm处荧光降低，而560nm处荧光得到显著恢复，以F560/F685为检测信号，以Pb2+浓度的对数为横坐标对检测数据进行处理，通过拟合得到线性回归方程；
(2)检测实际样品时在待测样品溶液中加入ds-DNA-AgNCs和不同浓度的Pb2+，室温孵育3.5小时后，用荧光分光光度仪检测ds-DNA-AgNCs的荧光强度，激发波长为470nm、610nm，发射波长为560nm、685nm；根据步骤(1)得到的线性回归方程计算样品中Pb2+的浓度。
因为所获得的实际水样、血样中不含有铅离子。所以需要人为的进行添加，以模拟实际样品中铅离子的检测，用以说明本发明的方法的准确性和有效性。
本发明所述的是一种快速检测Pb2+的新方法。相对于现有技术，本发明创造所述的Pb2+的检测方法具有以下优势：本发明将具有Pb2+特异性的DNA模板与银纳米团簇相结合(ds-DNA-AgNCs)，制备了有Pb2+响应的比率型荧光探针，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测速度快、免标记、操作简单且成本低的优势。
附图说明
构成本发明创造的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1为本发明创造实施例所述的ds-DNA-AgNCs单荧光团比率型探针用于Pb2+的超灵敏检测的原理验证相关实验数据。
图2为本发明创造实施例所述的ds-DNA-AgNCs的透射电子显微镜。
图3为本发明创造实施例所述DNA-AgNCs溶液中G2-1和R2-1碱基互补数对检测Pb2+生物传感体系的影响。
图4为本发明创造实施例所述的检测Pb2+所用缓冲溶液pH的优化实验。
图5为本发明创造实施例所述的在传感体系中加入Pb2+后反应时间的优化实验。
图6为本发明创造实施例所述的ds-DNA-AgNCs生物传感体系对不同浓度Pb2+的荧光响应。
图7为本发明创造实施例所述的方法检测Pb2+的特异性验证实验数据。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和发明创造中优化条件更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下ds-DNA-AgNCs与Pb2+二者反应的体系为300μL(包括DNA-AgNCs和不同浓度的Pb2+)，下面给出二者的浓度都是在300μL体系下的浓度。
实施例1
(1)G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：首先将0.5μM G-DNA模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μM AgNO3溶液和3.0μM NaBH4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的G-DNA-AgNCs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度F560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度F685；
(2)Pb2+传感体系的构建：在G-DNA-AgNCs体系中加入R-DNA进行杂交反应，形成由G-DNA与R-DNA，双链的G-DNA/R-DNA为模板的银纳米团簇(命名为ds-DNA-AgNCs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本发明所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测Pb2+。
传感体系荧光响应验证Pb2+检测原理：如图1所示，实施例1得到的G-DNA-AgNCs在560nm和685nm的特征峰(a和a')，此时该探针在560nm处响应比较强，因此呈现绿色荧光信号；与R-DNA形成双链后，得到实施例1的ds-DNA-AgNCs由于形成双链，R-DNA中的R2序列接近G-DNA-AgNCs，560nm处荧光响应降低，685nm处荧光响应得到增强(c和c')，导致绿色发射的G-DNA-AgNCs被转化为红色发射的双链DNA模板化AgNC(ds-DNA-AgNCs)；在Pb2+作用下，R-DNA的rA位点被Pb2+切割，释放出ds-DNA-AgNCs中的R2片段，从而引起绿色荧光信号恢复而红色荧光响应降低(b和b')；而在形成双链ds-DNA-AgNCs前，Pb2+对G-DNA-AgNCs的荧光响应不产生影响(d和d’)。以上结果证明所构建检测方法切实可行。所用激发波长为470nm、610nm，发射波长分别为560nm、685nm。
实施例2
图2为DNA-AgNCs的透射电子显微镜，由此可知ds-DNA-AgNCs的粒径约为3nm。
实施例3
优化R2-1与G2-1形成双链所含碱基对对传感体系荧光响应(F560/F685)的影响：探究影响Pb2+荧光传感体系因素的实验中，Pb2+的比率检测是基于G-DNA/R-DNA中释放R2引起信号改变，碱基配对数是影响G-DNA/R-DNA杂交过程的重要因素。如果互补碱基对数太少，则不能有效地形成依赖于Pb2+的切割位点，则Pb2+引起的信号改变不明显。当互补碱基对数越多，双链越稳定，就越难释放出R2，从而降低检测灵敏度。从图3得知，当互补碱基对数为9时，R-DNA存在时可以有效地将绿色发射的G-DNA-AgNCs转换为红色发射的ds-DNA-AgNCs。加入Pb2+后，可以恢复绿色荧光，产生最明显的荧光比率变化。因此，选择G2-1和R2-1为9个碱基对的G-DNA/R-DNA进行Pb2+检测。
实施例4
优化传感体系所用缓冲溶液pH优化。如图4所示，缓冲溶液pH值对ds-DNA-AgNCs的荧光响应影响不大；加入Pb2+后，在pH 7.4时传感体系检测信号变化达到最佳。
实施例5
图5说明在所构建生物传感体系加入Pb2+后，所引起的信号变化随反应时间的延长而增大，在反应时间达到210min时检测信号变化达到最高值，之后不再随时间的延长而增加。根据上述结果，孵育时间为210min为最佳反应条件。
实施例6
Pb2+灵敏度检测。如图6所示，随着Pb2+浓度的增加，传感体系在560nm处荧光逐渐增强，而685nm处荧光逐渐减弱，其比值(F560/F685)与Pb2+浓度的对数表现出极好的线性相关，检出限为1.0pM，检测线性范围为0.001nM至10nM(R2＝0.9987)，通过线性拟合获得线性方程：
y＝0.245x+0.985(R2＝0.9987)(1)
本发明所构建的DNA-AgNCs传感体系检测限低于大多数之前文献报道值。且检测误差分布在一个非常窄的范围内，表明所发展的分析方法具有良好的重现性。
实施例7
Pb2+特异性检测。选择K+，Ca2+，Cr3+，Ni2+，Cu2+，Pb2+，Mn2+，Mg2+，Cd2+，Fe2+，Zn2+和Fe3+等金属离子(5000nM)作为本实验检测的干扰物质，研究该方法的特异性。如图7所示，只有Pb2+可引起明显的荧光增强，而其它金属离子都没有引起明显的荧光响应。结果表明所制备的传感器对Pb2+具有良好的选择性，能够满足实际样品检测要求。
实施例8
以湖水、自来水及稀释过的人血清作为实际样品，在待测样品溶液中加入ds-DNA-AgNCs和不同浓度的Pb2+，室温孵育3.5小时后，用荧光分光光度仪检测ds-DNA-AgNCs的荧光强度，激发波长为470nm、610nm，发射波长为560nm、685nm；根据实施例1步骤(3)得到的线性回归方程(1)计算样品中Pb2+的浓度。所发展的比率荧光检测结果与ICP-MS的检测结果相一致，证实了所构建的比率型荧光传感器适用于实际样品中Pb2+的测定。湖水(表1)、自来水(表2)及稀释过的人血清(见表3)中Pb2+加标回收率分布在81％-110.2％，证明此方法可应用于实际样品检测。
表1
表2
表3
实施例8
本发明研究中使用的DNA模板如下：
实施例9
(1)G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：首先将0.5μM G-DNA模板进行退火处理(90℃，8min)，降至室温后加入3.0μM AgNO3溶液和3.0μM NaBH4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。生成的G-DNA-AgNCs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度F560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度F685；
(2)Pb2+传感体系的构建：在G-DNA-AgNCs体系中加入R-DNA进行杂交反应，形成由G-DNA与R-DNA，双链的G-DNA/R-DNA为模板的银纳米团簇(命名为ds-DNA-AgNCs)，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强。本发明所构建新型比率型免标记荧光传感器用于快速检测Pb2+。
同样可以按照实施例1的方法进行验证。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例，并不用于限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种新型比率型免标记荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：以合成的DNA保护的银纳米团簇为分子探针所构建的传感体系，可实现对水样和血样中铅离子的高灵敏度高特异性检测。
2.根据权利要求1所述一种新型比率型免标记荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：
(1)G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：将G-DNA模板进行退火处理后，加入AgNO3溶液和NaBH4溶液进行反应，生成G-DNA-AgNCs纳米团簇，在470nm波长激发下发射绿色荧光，在560nm处达到最大荧光强度F560，在610nm波长激发下发射较弱的红色荧光，在685nm处达到最大荧光强度F685；
(2)Pb2+传感体系的构建：在G-DNA-AgNCs体系中加入R-DNA进行杂交反应，形成由G-DNA与R-DNA双链的G-DNA/R-DNA为模板的银纳米团簇ds-DNA-AgNCs，由于双链的形成，银纳米团簇在560nm处的荧光降低，而685nm处的荧光得到极大增强；
(3)铅离子检测：在ds-DNA-AgNCs传感体系中加入的铅离子引起R-DNA分裂成两部分，其中所含的R2部分从ds-DNA-AgNCs中释放，引起银纳米团簇在560nm处的荧光增强，而685nm处的荧光降低。
3.权利要求2求所述的一种比率型荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：步骤(1)所述G-DNA-AgNCs纳米团簇的合成：将G-DNA模板进行退火处理，退火温度90℃，退火时间8min，降至室温后加入AgNO3溶液和NaBH4溶液，4℃过夜反应后，用荧光分光光度仪器检测该体系的荧光强度。
4.权利要求3求所述的一种比率型荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：所述本发明反应中G-DNA模板，AgNO3溶液和NaBH4溶液的摩尔比为1：6：6或1：12：6。
5.权利要求2求所述的一种比率型荧光检测铅离子的新方法，其特征在于：步骤(3)铅离子检测具体步骤是：
(1)以ds-DNA-AgNCs所具有的两个发射荧光强度比值F560/F685为纵坐标，以Pb2+浓度的对数值为横坐标对检测数据进行处理，然后进行线性拟合，得到线性回归方程；
(2)检测实际样品时在待测样品溶液中加入ds-DNA-AgNCs和不同浓度的Pb2+，室温孵育3.5小时后，用荧光分光光度仪检测ds-DNA-AgNCs的荧光强度，激发波长为470nm、610nm，发射波长为560nm、685nm；根据步骤(1)得到的线性回归方程计算样品中Pb2+的浓度。
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