CN103558215B - 一种基于点击化学和g四聚体的铜离子检测试剂盒以及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于点击化学和具有HRP活性的G四聚体检测铜离子的试剂盒以及检测方法。在反应体系中使用点击化学使修饰有叠氮基团和炔基基团的两条DNA序列形成G四聚体形成序列，之后加入高铁血红素和KCl，形成高铁血红素/G四聚体结构。由于高铁血红素/G四聚体具有HRP的活性，能催化其无色底物TMB形成有颜色的底物，实验结果通过肉眼就能判别。定量分析时，将反应终溶液转移到酶标板中，用酶标仪读取溶液在450nm的OD值。本发明可用于Cu²⁺的浓度的定性和定量分析，检测体系简单，特异性好，不受其他物质的干扰，操作容易，反应迅速，检测结果可靠，适合在基层实验室使用。

Description

一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及检测方法

技术领域

本发明涉及一种铜离子检测试剂盒，特别涉及一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒。

背景技术

环境中离子的浓度直接影响人们的健康，过高或过低都会影响人们的健康。在众多的离子中，重金属离子的危害性更大，因此有必要对其含量进行精确的测定。

传统的用于检测重金属离子的方法主要有石墨烯原子吸收光谱法（graphitefurnaceatomicabsorptionspectrometry，AAS）和电感耦合等离子原子发射光谱法（inductivecoupledplasmaatomicemissionspectroscopy，ICP-AES）。这两种方法对于重金属离子的检测准确可靠，但使用的仪器价格昂贵，需要经验丰富的技术人员来操作，因而限制了其在基层实验室的广泛应用。近年来，各种检测重金属离子的生物传感器不断出现，其检测的原理都是依赖于重金属离子能够切割其DNA酶结合的底物链的特定位点，然后使用一系列的方法来检测释放的底物链，检测方法包括：荧光法，比色法，动力学光散射法和胶体金试纸条法等。

近年来，基于Cu⁺的点击化学由于其高效和特异性而得到了广泛的应用，它指的是一个分子的叠氮基团和另一个分子的炔基基团在Cu⁺的催化下，通过环加成反应形成一个三唑五元环而被连接在一起。并且，叠氮基团和炔基基团的之间的反应不受溶液中其它基团的干扰，特异性好。Cu⁺可以通过抗坏血酸钠还原Cu²⁺产生。基于Cu⁺的点击化学已经用于可视化检测Cu²⁺，其检测的原理多是基于观察胶体金溶液的变化来间接的反应Cu²⁺的浓度。但是，有些比色法需要通过改变反应温度才能观察到胶体金溶液的变化，并且，这些方法的灵敏度都有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，该试剂盒具有专门设计的能够形成G四聚体的富含G碱基的序列，可形成具有HRP活性的G四聚体，可用于Cu²⁺的浓度的定性和定量分析，检测体系简单，特异性好，不受其他物质的干扰，操作容易，反应迅速，检测结果可靠，适合在基层实验室使用。

本发明所述的一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，包括以下成分：两段G四聚体形成序列，第一序列G1为5’-GTGGGTAGG-N=N=N-3’，在其3’端修饰叠氮基团，第二序列G2为5’-CH≡CH-GCGGGTTGGG-3’，其5’端修饰炔基基团；所述第一序列的叠氮基团和所述第二序列的炔基基团通过Cu⁺催化的环加成反应而连接形成一条G四聚体形成序列；抗坏血酸钠，粉末形式；PBS反应液，含有0.2MNaCl；高铁血红素，粉末形式；1MKCl；0.05%（w/v）H₂O₂；0.05%（w/v）四甲基联苯胺，即TMB；以及浓H₂SO₄，作为终止反应液。

本发明的另一目的还在于提供根据本发明所述的铜离子检测试剂盒的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测方法。

本所述的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测方法，包括以下步骤：

1）将第一序列G1、第二序列G2、待检测样品和抗坏血酸钠先后加入PBS反应液中，混匀，20-25℃反应1小时，使G1的叠氮基团和G2的炔基基团通过Cu⁺催化的环加成反应而连接起来，形成一条G四聚体形成序列；

2）在上述反应液中加入高铁血红素和KCl，充分震荡反应，使高铁血红素和所述G四聚体形成序列形成具有HRP的活性高铁血红素/G四聚体结构；

3）在上述溶液中加入H₂O₂和TMB，所述高铁血红素/G四聚体能够催化无色的TMB形成有色的底物；

4）加入浓H₂SO₄终止反应，观察溶液颜色的变化；如果所述待检测样品含有Cu²⁺，溶液的初始颜色为无色，加入H₂SO₄后颜色变为黄色，黄色的深浅可以间接表明Cu²⁺的浓度；

5）将上述液体转移到酶标板中，使用酶标仪读取每个孔中的溶液在450nm处的OD值，对Cu²⁺的含量进行定量分析。

本发明所述的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及铜离子检测方法的优点是：

1）检测体系中，避免使用铜离子依赖型DNA酶与其底物DNA链形成酶-底物复合体，简化了操作时间和步骤。

2）本发明中使用基于Cu⁺的点击化学，特异性好，不受反应体系中其它化学基团的影响，因此在Cu²⁺的检测中，对样本的要求低，可以用于实际样品的定量检测。

3）Cu⁺的来源广泛，可以通过抗坏血酸盐还原Cu²⁺得到。

4）检测体系中形成的hemin/G四聚体用具有HRP的活性，能够催化无色的底物TMB生成有颜色的产物，实现检测信号的放大。

5）本发明所述的方法灵敏度高，对铜离子的检测限为240nM，达到FDA规定的饮用水中铜离子的最低检测限（20μM）。

6）本发明的实验结果用肉眼就能观察到，定量检测不需要使用复杂的仪器，使用普通的酶标仪就能读数。

7）本发明中所述的用于Cu²⁺的检测方法具有很高的特异性，其他离子对检测不产生明显的干扰。

附图说明

图1为本发明所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的原理图。

图2为本发明所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的灵敏度实验结果图。

图3为本发明所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的特异性实验结果图。

图4为本发明所述的铜离子检测试剂盒在自来水和人血清中检测铜离子的回收率结果图。

具体实施方式

下面结合附图，示例性说明本发明所述的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及铜离子检测方法。

如图1所示，本发明所述的铜离子检测方法的原理是：基于铜离子的点击化学（clickchemistry）是指一个分子上的叠氮基团可以和另一个分子上的炔基基团在Cu⁺（一价铜离子）的存在下，通过环加成反应连接在一起，形成一个三唑五元环。Cu⁺可以通过抗坏血酸盐还原Cu²⁺（二价铜离子）产生。本发明所述的G四聚体形成序列是一段富含G碱基的DNA序列，在反应体系中使用基于铜离子的点击化学使修饰有叠氮基团和炔基基团的两条DNA序列形成G四聚体形成序列。具体地，本发明将能够形成G四聚体的富含G碱基的序列（5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’）分为两小段，分别为G1和G2。G1的序列为5’-GTGGGTAGG-N=N=N-3’，其3’端修饰叠氮（azide）基团；G2的序列为5’-CH≡CH-GCGGGTTGGG-3’，其5’端修饰炔基（alkyne）基团。当溶液中存在Cu²⁺时和抗坏血酸钠时，叠氮基团修饰的G1和炔基基团修饰的G2序列通过Cu⁺的环加成反应被连接在一起，成为一条G四聚体形成序列。在高铁血红素（hemin）和KCl同时存在的情况下，G四聚体形成序列可与hemin形成hemin/G四聚体结构，此结构具有HRP活性，在催化剂过氧化氢（H₂O₂）存在时，可以将其无色底物四甲基联苯胺（tetrazmethylbenzidine，TMB）氧化为有色的产物即双偶氮联苯胺化合物，此催化反应可被H₂SO₄终止。在检测Cu²⁺的实验中，溶液的初始颜色为无色，加入H₂SO₄后颜色变为黄色，黄色的深浅可以间接表明Cu²⁺的浓度，检测结果可通过肉眼观察。定量分析时，将溶液转移到96孔板中，使用酶标仪记录每个孔中的溶液在450nm的光密度值（OD值）。因此，利用hemin/G四聚体具有HRP的活性这一性质来检测Cu²⁺的含量具有明显的优势。

本发明所述的一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，包括以下成分：

（1）两段G四聚体形成序列，第一序列G1为5’-GTGGGTAGG-N=N=N-3’，在其3’端修饰叠氮基团，第二序列G2为5’-CH≡CH-GCGGGTTGGG-3’，其5’端修饰炔基基团；所述第一序列的叠氮基团和所述第二序列的炔基基团通过Cu⁺催化的环加成反应而连接形成一条G四聚体形成序列；

（2）抗坏血酸钠，粉末形式；

（3）PBS反应液，含有0.2MNaCl；

（4）高铁血红素，粉末形式；

（5）1MKCl；

（6）0.05%（w/v）H₂O₂；

（7）0.05%（w/v）四甲基联苯胺，即TMB；以及

（8）2MH₂SO₄，作为终止反应液。

基于上述的铜离子检测试剂盒，本发明提供了一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测方法，包括如下步骤：

1）将G1,G2,Cu²⁺和抗坏血酸钠先后加入PBS（含有0.2MNaCl）反应液中，混匀，室温反应1小时,使G1的叠氮基团和G2的炔基基团通过Cu⁺催化的环加成反应而连接起来，形成一条G四聚体形成序列；

2）在上述反应液中加入hemin和KCl，充分反应，使hemin和G四聚体形成序列形成具有HRP活性的G四聚体结构；

3）溶液中加入H₂O₂和TMB，则hemin/G四聚体能够催化无色的TMB形成有色的底物；

4）加入浓H₂SO₄终止反应，观察溶液颜色的变化；

5）将上述液体转移到酶标板中，使用酶标仪读取每个孔中的溶液在450nm处的OD值，对Cu²⁺的含量进行定量分析。

参照图1，叠氮基团和炔基基团分别修饰的DNA在二价铜离子和抗坏血酸盐同时存在的情况下，会连接成一条单链DNA。这条DNA序列富含G碱基，加入在hemin和KCl后，形成hemin/G四聚体结构，此结构具有HRP的活性，在H₂O₂的催化下，能够使HRP的无色底物转变为有色的底物，浓硫酸可终止反应，实验结果可用肉眼观察。

下面结合实施例，进一步说明本发明。

铜离子浓度检测方法：

1）准备一系列的Eppendorf（EP）管，每管中加入12μL的PBS（含有0.2MNaCl）反应液，再分别加入2μL的G1和G2（各10μM），使其终浓度分别为1μM。

2）用去离子水配置一系列不同浓度的铜离子溶液，分别取2μL加入不同的EP管中，使其终浓度分别为0,400nM,800nM,1μM,5μM,10μM,100μM,每个管盖上做好标记。再向每管中加入2μL的抗坏血酸钠溶液，使其终浓度为100μM，震荡混匀，短暂离心，将管壁上的液体甩到管底，室温反应1小时，使G1和G2序列上的叠氮和炔基基团充分反应，从而形成G四聚体形成序列。

3）向2）中的每个反应管中加入hemin和KCl,使其终浓度分别为0.9μM和10mM,室温震荡反应20分钟。

4）向3）中的每个反应管中加入TMB和H₂O₂各30μL，室温反应20分钟后，再加入30μL2M的H₂SO₄终止反应，观察溶液颜色变化。

5）将4）中每管中的溶液吸到酶标板中，用酶标仪读取每个孔中溶液在450nm处的OD值。

对不同浓度的铜离子的检测：

配制一系列不同浓度的铜离子溶液，浓度分别为4μM，8μM，10μM,50μM,100μM,1mM,按上述的铜离子浓度检测方法进行铜离子浓度检测，检测结果如图2所示。

由图2可知，随着铜离子浓度的增加，溶液在450nm处的光密度值（OD:opticaldensity）也随着增加。检测铜离子的线性范围是0.4μM-10μM，检测限为240nM，达到了美国环境保护局（FDA）规定的饮用水中铜离子浓度的检测限（20μM）。

特异性实验：

按照上述的铜离子浓度检测方法，分别配制100μM不同重金属离子的标准溶液，这些重金属离子分别是Ca²⁺，Pb²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Mn²⁺，Cd²⁺，检测其OD值。实验结果如图3所示。

实验结果显示，与100μM的其他重金属离子相比，使用10μM的铜离子检测可以产生很高的OD值，说明该传感器选择性好，不容易受其他物质的干扰。

回收率实验：

为了验证本发明能否在实际样品中用于铜离子的检测，将不同浓度的铜离子溶液分别加入到自来水和人血清中样品中，使铜离子在这两种溶液中的终浓度分别为2μM，4μM和8μM。检测结果如图4所示，自来水中检测铜离子的回收率为87.88-102.95%，人血清中对铜离子检测的回收率为83.73-102.08%，说明本发明在实际应用中能够用于自来水和人血清中铜离子的检测。

Claims (2)

1.一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

两段G四聚体形成序列，第一序列G1为5’-GTGGGTAGG-N=N=N-3’，在其3’端修饰叠氮基团，第二序列G2为5’-CH≡CH-GCGGGTTGGG-3’，其5’端修饰炔基基团；所述第一序列的叠氮基团和所述第二序列的炔基基团通过Cu⁺催化的环加成反应而连接形成一条G四聚体形成序列；

抗坏血酸钠，粉末形式；

PBS反应液，含有0.2MNaCl；

高铁血红素，粉末形式；

1MKCl；

0.05%H₂O₂；

0.05%四甲基联苯胺，即TMB；以及

浓H₂SO₄，作为终止反应液。

2.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒的铜离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将第一序列G1、第二序列G2、待检测样品和抗坏血酸钠先后加入PBS反应液中，混匀，20-25℃反应1小时，使G1的叠氮基团和G2的炔基基团通过Cu⁺催化的环加成反应而连接起来，形成一条G四聚体形成序列；

2）在上述反应液中加入高铁血红素和KCl，充分震荡反应，使高铁血红素和所述G四聚体形成序列形成具有HRP的活性高铁血红素/G四聚体结构；

3）在上述溶液中加入H₂O₂和TMB，所述高铁血红素/G四聚体能够催化无色的TMB形成有色的底物；

4）加入浓H₂SO₄终止反应，观察溶液颜色的变化；如果所述待检测样品含有Cu²⁺，溶液的初始颜色为无色，加入H₂SO₄后颜色变为黄色，黄色的深浅可以间接表明Cu²⁺的浓度；

5）将上述液体转移到酶标板中，使用酶标仪读取每个孔中的溶液在450nm处的OD值，对Cu²⁺的含量进行定量分析。