CN105717290B - 一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法，其特征在于，包括制备反应液步骤、制备胶体金步骤、制备胶体金颗粒‑链霉亲和素（AuNP‑SA）偶联物步骤以及检测步骤；相应的提供一种划有跟Click Azide片段互补核酸和Click CHCH核酸作为检测线和质控线的基于点击化学检测二价铜离子试剂盒，以解决目前二价铜离子的检测方法操作复杂，重复性差、灵敏度差的问题，由于检测结果使用肉眼就能观察到，因此被可广泛地应用于基层实验室中。

Description

一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种二价铜离子的检测方法及试剂盒，特别涉及一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法及试剂盒。

背景技术

环境中离子的浓度直接影响人们的健康，过高或过低都会影响人们的健康。在众多的离子中，重金属离子的危害性更大，因此有必要对其含量进行精确的测定。

传统的用于检测重金属离子的方法主要有石墨烯原子吸收光谱法（graphitefurnace atomic absorption spectrometry，AAS）和电感耦合等离子原子发射光谱法（inductive coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES）。这两种方法对于重金属离子的检测准确可靠，但使用的仪器价格昂贵，需要经验丰富的技术人员来操作，因而限制了其在基层实验室的广泛应用。近年来，各种检测重金属离子的生物传感器不断出现，其检测的原理都是依赖于重金属离子能够切割其DNA酶结合的底物链的特定位点，然后使用一系列的方法来检测释放的底物链，检测方法包括：荧光法，比色法，动力学光散射法和胶体金试纸条法等。

近年来，基于Cu⁺的点击化学由于其高效和特异性而得到了广泛的应用，它指的是一个分子的叠氮基团和另一个分子的炔基基团在Cu⁺的催化下，通过环加成反应形成一个三唑五元环而被连接在一起。并且，叠氮基团和炔基基团的之间的反应不受溶液中其它基团的干扰，特异性好。Cu⁺可以通过抗坏血酸钠还原Cu²⁺产生。基于Cu⁺的点击化学已经用于可视化检测Cu²⁺，其检测的原理多是基于比色法，操作复杂，重复性差，并且，这些方法的灵敏度都有待进一步提高。我们发明的这种检测方法操作简便，检测结果使用肉眼就能观察到，因此被可广泛地应用于基层实验室中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种简化操作时间和步骤的、灵敏度高的铜离子检测方法及试剂盒。

本发明首先提供一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法及试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：

制备反应液步骤：将修饰了叠氮基团的短单链核酸（Click Azide序列）、修饰了炔基基团的标记有生物素的短单链核酸（Click CHCH序列）、待检测样品和抗坏血酸钠先后加入磷酸缓冲液中，混匀，20℃-25℃条件下反应1小时，使Click Azide的叠氮基团和ClickCHCH的炔基基团在Cu⁺催化的作用下环加成反应连接起来，形成一条有生物素标记的长链序列；

制备胶体金步骤：在圆底烧瓶中加入100 ml 0.01%的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾，并向上述溶液中加入4 ml 1%枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌15分钟，得到胶体金溶液，胶体金溶液4℃避光保存；

制备胶体金颗粒-链霉亲和素（AuNP-SA）偶联物步骤：向1 mL 的上述胶体金溶液中加入0.1 M K₂CO₃ （6 µL）混匀，5分钟后加入10 µg的链霉亲和素（SA），室温振荡30分钟。加入100µL 10 %牛血清白蛋白后封闭30分钟，4°C离心（12×10³rpm）10 分钟，得到AuNP-SA偶联物。弃上清，用100µL硼酸缓冲液（0.2M，pH 9.0）重悬AuNP-SA偶联物；

检测步骤：将上述反应液加入2微升AuNP-SA偶联物，转移到试纸条上，加入40微升的上样缓冲液，进行检测，检测反应时间为5-10min。

相应的，本发明还提供了一种基于点击化学检测二价铜离子的试剂盒，其特征在于，具有粘性的底板；硝酸纤维素膜粘贴在所述底板的中部；所述硝酸纤维素膜上划有跟Click Azide片段互补核酸和Click CHCH核酸分别作为检测线和质控线；金标垫粘贴在所述硝酸纤维素膜的一侧的底板上，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜之间有2-3mm的重叠；吸水纸粘贴在所述硝酸纤维素膜的另一侧的底板上，所述吸水纸与所述硝酸纤维素膜之间有2-3mm的重叠；样品垫，粘贴在所述底板上，所述样品垫与所述金标垫之间有2-3mm的重叠。

与现有技术相比，上述技术方案的优点在于，其优点在于该检测方法操作简单，特异性好，不受反应体系中其它化学基团的影响；对样本的要求低，可以用于实际样品的定量检测；灵敏度高，对铜离子的检测限为200 nM，达到FDA规定的饮用水中铜离子的最低检测限（20µM）；实验结果用肉眼就能观察到，定量检测不需要使用复杂的仪器，使用普通的读卡仪就能读数。

附图说明：

图1为本发明所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的原理图。

图2为本发明所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的灵敏度实验结果图。

图3为本发明所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的特异性实验结果图。

图4为本发明所述的铜离子检测反应时间优化实验结果图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

实施例一，铜离子检测方法：

如图1所示，本发明所述的铜离子检测方法的原理是：

反应液的制备：基于铜离子的点击化学（click chemistry）是指一个分子上的叠氮基团可以和另一个分子上的炔基基团在Cu⁺（一价铜离子）的存在下，通过环加成反应连接在一起，形成一个三唑五元环。Cu+可以通过抗坏血酸盐还原Cu²⁺（二价铜离子）产生。本发明所述的一种基于点击化学的铜离子检测试剂盒，包括以下成分：两段核酸序列，第一序列Click Azide为5’- ATACTCCCCCAGGTGCCG -N=N=N-3’，在其3’端修饰叠氮基团，第二序列Click CHCH为5’- AGCTTCTTTCTAATACG -3’，其5’端修饰炔基基团，3’端修饰生物素；所述第一序列的叠氮基团和所述第二序列的炔基基团通过Gu⁺催化的环加成反应而连接形成一条生物素标记的长链产物。

金纳米（胶体金）溶液的制备：在500 ml的圆底烧瓶中加入100 ml 0.01%的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入4 ml 1%枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌15分钟，得到金纳米（胶体金）溶液。胶体金溶液4℃避光保存，纳米金通过520 nm最大吸光度值鉴定。

AuNP-SA偶联物的制备：向1 mL 的胶体金溶液中加入0.1 M K₂CO₃（6 µL）混匀，5分钟后加入10 µg的SA（链霉亲和素），室温振荡30分钟。加入10 % BSA （100µL）封闭30分钟，4°C离心（12×10³rpm，10 分钟），得到AuNP-SA（金纳米颗粒-链霉亲和素）偶联物。弃上清，用100µL硼酸缓冲液（0.2M，pH 9.0）重悬AuNP-SA偶联物。

将上述液体加入2微升链酶亲和素标记的纳米金，转移到试纸条上，加入40微升的上样缓冲液，进行检测，检测反应时间为30-90min（图4）。

结果肉眼可见，也可以在试纸条读数仪上进行进一步的结果扫描数值分析。

实施例二，对不同浓度的铜离子的检测：

配制一系列不同浓度的铜离子溶液，检测结果如图2所示。由图2可知，随着铜离子浓度的增加，检测线的红色线的亮度也随着增加。检测铜离子的线性范围是0.4 µM -10 µM，检测限为200 nM，达到了美国环境保护局（FDA）规定的饮用水中铜离子浓度的检测限（20µM）。

实施例三，特异性实验：

按照上述的铜离子浓度检测方法，分别配制100 µM不同重金属离子的标准溶液，，检测其OD值。实验结果如图3所示。

实验结果显示，与100 µM的其他重金属离子相比，使用10 µM的铜离子检测可以产生很高的OD值，说明该传感器选择性好，不容易受其他物质的干扰。

实施例四，回收率实验：

为了验证本发明能否在实际样品中用于铜离子的检测，将不同浓度的铜离子溶液分别加入到自来水和人血清中样品中，使铜离子在这两种溶液中的终浓度分别为2 µM，4 µM和8µM。自来水中检测铜离子的回收率为89.82 -102.91 %，人血清中对铜离子检测的回收率为85.23-104.05 %，说明本发明在实际应用中能够用于自来水和人血清中铜离子的检测。

以上内容是结合具体的实施例对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备反应液步骤：将修饰了叠氮基团的Click Azide序列短单链核酸、修饰了炔基基团的标记有生物素的Click CHCH序列短单链核酸、待检测样品和抗坏血酸钠先后加入磷酸缓冲液中，混匀，20℃-25℃条件下反应1小时，使Click Azide的叠氮基团和Click CHCH的炔基基团在Cu+催化的作用下环加成反应连接起来，形成一条有生物素标记的长链序列；

制备胶体金步骤：在圆底烧瓶中加入100ml 0.01％的HAuCl₄溶液，磁力搅拌加热至沸腾，并向上述溶液中加入4ml、1％枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸10分钟，停止加热继续搅拌15分钟，得到胶体金溶液，胶体金溶液4℃避光保存；

制备胶体金颗粒-链霉亲和素(AuNP-SA)偶联物步骤：向1mL的上述胶体金溶液中加入6μL的0.1M K₂CO₃混匀，5分钟后加入10μg的链霉亲和素，室温振荡30分钟；加入100μL、10％牛血清白蛋白后封闭30分钟，在12×10³rpm条件下，4℃离心10分钟，得到AuNP-SA偶联物；弃上清，用100μL、0.2M浓度、pH9.0硼酸缓冲液重悬AuNP-SA偶联物；

检测步骤：将上述反应液加入2微升AuNP-SA偶联物，转移到划有跟Click Azide序列互补的核酸和跟Click CHCH序列互补的核酸分别作为检测线和质控线的试纸条上，加入40微升的上样缓冲液，进行检测，检测反应时间为30-90min。

2.一种基于点击化学检测二价铜离子的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的反应液和胶体金颗粒-链霉亲和素(AuNP-SA)偶联物以及粘性的底板；硝酸纤维素膜粘贴在所述底板的中部；所述硝酸纤维素膜上划有跟Click Azide序列互补的核酸和跟Click CHCH序列互补的核酸分别作为检测线和质控线；吸水纸粘贴在所述硝酸纤维素膜一侧的底板上，所述吸水纸与所述硝酸纤维素膜之间有2-3mm的重叠；样品垫粘贴在底板上。