CN106841156A - 一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其包括如下步骤:(1)分别设计并合成Cu‑Sub序列、Cu‑Enzyme1序列和Cu‑Enzyme2序列;(2)将Cu‑Enzyme1序列,Cu‑Enzyme2序列和Cu‑Sub序列在50mM的PBS缓冲溶液中杂交1h得到杂交液;(3)在上述杂交液中加入2 µL 1 M SA和不同浓度的Cu(II)引发CuAAC和DNA切割反应;(4)在室温下用荧光分光光度计进行样品测量;(5)根据收集的荧光强度信号,记录监测结果。本发明兼具了Cu‑Enzyme的高灵敏度,又具备极好的特异性与专一性,使其它常见金属离子不会干扰Cu(II)的测定。
Description
技术领域
本发明涉及荧光定量分析方法技术领域,尤其涉及一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法。
背景技术
点击化学(Click chemistry)是美国化学家Sharpless在2001年提出的一种合成概念(Kolb et al.,2001.Angew.Chem.40,2004-2021.)。它具有模块化、可靠、高效率、高选择性、反应条件温和、产物收率高、副反应少、分离提纯简单等特点。其中Cu(I)催化含叠氮和含端炔基团物质Huisgen偶极环加成反应(CuAAC反应)作为点击化学反应的其中一种,被广泛应用于环境、化学及生物医学等众多领域。
DNAzymes是一段具有催化活性的DNA序列,在1994年被Gerald Joyce和RonaldBreaker发现(Breaker,R.R.,Joyce,G.F.,1994.chem biol.1,223-229.),具有稳定性好,易合成,灵敏度高等特点。由于金属离子作为DNAzymes的辅酶因子可以催化对应的金属离子依赖的DNA切割型DNAzymes特异性切割其对应的DNA或RNA底物链,因此DNAzymes已经被广泛地应用于构建金属离子的传感器,如Mg2+,Pb2+,Ca2+,Hg2+,Cu2+,Zn2+,Mn2+等(Liu etal.,J.Am.Chem.Soc.,2004,126,12298-12305.;Yin et al.,C.Xie,J.Am.Chem.Soc.,2009,131,14624-14625.;Zhou et al.,Anal.Chem.,2015,87,4001-4007.;Liu et al.,Angew.Chem.,2007,119,7731-7734.)。铜离子依赖的DNA切割型脱氧核酶(Cu(II)-DNAzyme,简称Cu-Enzyme)被Carmi等人通过体外筛选技术第一次发现(Carmi et al.,Bioorg.Med.Chem.,2001,9,2589-2600.,Carmi et al.,Chem.Biol.,1996,3,1039-1046.),从此Cu-Enzyme频繁地被用于设计各种传感平台的Cu(II)检测。例如Lu等人根据Cu-Enzyme可以在Cu(II)作为辅酶因子存在的情况下,不可逆的催化氧化分裂其对应的基底链(Cu-Substrate,简称Cu-Sub)而产生带有荧光信号的短链DNA游离到溶液中使系统荧光增强的原理,设计了一个高灵敏的快速检测Cu(II)的荧光传感器(Liu et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,9838-9839.)。Li等人设计了一种基于DNAzyme的新型的双色荧光纳米探针可以在活细胞中实现同时对Zn(II)和Cu(II)成像(Li et al.,Anal.Chem.,2015,87,4829-4835.)。Ge等人建立了一种基于自组装的DNA多联体和SYBR Green I的信号放大策略检测Cu(II)(Ge et al.,Analyst,2013,138,4737-4740.)。虽然上述的基于Cu-Enzyme的荧光传感器能够高灵敏度地检测Cu(II)。值得注意的是,传统的Cu-Enzyme传感系统容易受其他金属离子干扰,如Co2+,Pb2+,Ca2+,Mn2+等,导致非特异性的DNA断裂,产生假阳性信号。例如上述的Li课题组虽然能实现在活体细胞中Cu(II)的成像,但是金属离子Ca2+,Mn2+,Co2+和Pb2+的存在也能够引起可检测到的荧光信号,特别是Pb2+,实验中必须加入掩蔽剂2,6-吡啶二羧酸(PDCA)来排除Pb2+的干扰。此外,在Ge课题组的测定结果中显示Pb2+和Co2 +的存在一定程度的干扰并且不能有效的消除。因此我们需要寻找一些方法来解决此问题,并提高传感器的特异性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的Cu(II)-DNAzyme特异性不专一等问题,提出一种基于改进的Cu(II)-DNAzyme的高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法。
本发明采用的技术方案是:
一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其包括如下步骤:
(1)分别设计并合成Cu-Sub序列、Cu-Enzyme 1序列和Cu-Enzyme 2序列;
(2)将Cu-Enzyme 1链、Cu-Enzyme 2链和Cu-Sub链在50mM PBS缓冲溶液中杂交1h;
(3)在上述杂交液中加入2μL 1M SA和不同浓度的Cu(II)引发CuAAC和DNA切割反应;
(4)在室温下用荧光分光光度计进行样品测量;
(5)根据收集的荧光强度信号,记录监测结果。
进一步地,所述步骤(1)中的Cu-Sub序列为从左到右5’到3’:猝灭基团-AGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-荧光基团。
进一步地,所述步骤(1)中的Cu-Enzyme 1序列为从左到右5’到3’:猝灭基团-GGTAAGCCTGGGCCTC-炔基。
进一步地,所述步骤(1)中的Cu-Enzyme 2序列为从左到右5’到3’:叠氮基-TTTCTTTTTAAGAAAGAAC。
进一步地,所述步骤(2)中的Cu-Sub链、Cu-Enzyme 1链和Cu-Enzyme 2链的浓度均为0.5μM,杂交温度为37℃,使用到的缓冲溶液为50mM PBS缓冲溶液。缓冲溶液的具体组成为50mM PB,pH 7.4,10mM MgCl2,50mM NaCl。
进一步地,所述步骤(3)中引发CuAAC和DNA切割反应的时间为2h。
进一步地,所述步骤(4)中设置的激发和发射的狭缝宽度均为5.0nm,激发波长为480nm,荧光发射光谱的收集范围为490-600nm。
进一步地,所述荧光分光光度计为日立的型号F4600的荧光分光光度计。
本发明采用以上技术方案,优点在于:首先,本发明的三种修饰DNA合成方法简单、快速、反应条件温和、容易控制,得到的DNA化合物具有良好的活性和稳定性。其次,对于传统Cu-Enzyme,虽然对于检测Cu(II)具有较高的灵敏度,较快的反应时间,但其它离子大量的存在也会干扰,因此限制了它在实际样品中的测定,而本方法兼具了Cu-Enzyme的高灵敏度,又具备极好的特异性与专一性,使其它常见金属离子不会干扰Cu(II)的测定。另外,点击化学反应具有反应条件温和,操作简单,产率高,选择性好等优点,同时荧光检测具有高效,快速,稳定性好等优点。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明;
图1为本发明一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法的流程示意图;
图2为本发明一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法的原理示意图;
图3为本发明一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法的荧光检测效果图;
图4为基于传统的Cu(II)-Enzyme传感器检测Cu(II)的方法的荧光检测效果图。
具体实施方式
如图1-4之一所示,本发明公开一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其包括如下步骤:
(1)分别设计并合成Cu-Sub序列、Cu-Enzyme 1序列和Cu-Enzyme 2序列;具体地,参考文献(Liu et al.,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,9838-9839.),设计并合成Cu-Sub序列、Cu-Enzyme 1和Cu-Enzyme 2序列。进一步地,所述步骤(1)中的Cu-Sub序列为从左到右5’到3’:猝灭基团-AGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-荧光基团。Cu-Enzyme1序列为从左到右5’到3’:猝灭基团-GGTAAGCCTGGGCCTC-炔基。Cu-Enzyme 2序列为从左到右5’到3’:叠氮基-TTTCTTTTTAAGAAAGAAC。
(2)将Cu-Enzyme 1链、Cu-Enzyme 2链和Cu-Sub链在50mM PBS缓冲溶液中杂交1h;具体地,将0.5μM的Cu-Enzyme 1,0.5μM的Cu-Enzyme 2与0.5μM Cu-Sub序列溶液在200μL的PBS缓冲溶液中37℃杂交1h,形成DNA三倍体杂交结构,如图1所示。使用到的缓冲溶液为50mM PBS缓冲溶液。缓冲溶液的具体组成为50mM PB,pH 7.4,10mM MgCl2,50mM NaCl。
(3)在上述杂交液中加入2μL 1M SA和不同浓度的Cu(II)引发CuAAC和DNA切割反应;形成的Cu-Enzyme能够在分裂位点切割Cu-Sub序列链,此过程于37℃反应2h。
(4)在室温下用荧光分光光度计进行样品测量;进一步地,所述荧光分光光度计为日立的型号为F4600的荧光分光光度计(F4600Hitachi,Inc.)。所述步骤(4)中设置的激发和发射的狭缝宽度均为5.0nm,激发波长为480nm,荧光发射光谱的收集范围为490-600nm。
(5)根据收集的荧光强度信号,记录监测结果。根据记录的读数拟合相关线性方程。随着Cu(II)浓度升高,相对应的荧光值升高。
本发明的具体应用于自来水中Cu(II)浓度的检测时的具体方法如下:
向0.5μM杂交过的DNA混合物中加入10mM SA和自来水样品,37℃培育(2.0±0.05)小时,最后将200μL液体移置于荧光微量石英比色皿中于荧光分光光度计中进行检测。记录数据,算出该自来水中Cu(II)的含量。检测结果显示三组自来水品中Cu(II)浓度分别为0μM、0.27μM、0μM。
为了检测本发明所述的方法对Cu(II)检测的特异性,将本发明中所使用的Cu(II)换成其他干扰离子,分别为Cu2+,Pb2+,Fe3+,Ba2+,Sn2+,Ca2+,Ni2+,Cr3+,Ag+,Na+,K+,Mn2+,Mg2+,Co2+,Zn2+,Fe2+和空白溶液,Cu(II)的浓度为5μM,其他干扰离子的浓度均为100μM。
如图3所示,对于改进的Cu-Enzyme的传感器,在Cu(II)存在的时候检测到的明显的增强的荧光信号,但是其它金属离子的荧光强度几乎与空白溶液是相同的,这表明,所提出的传感器对其它金属离子是没有响应的,并且所提出的Cu(II)传感器有着显著的特异性。
如图4所示,对于传统的Cu-Enzyme传感器,Cu(II)也可以产生的增强的荧光信号。然而,100μM的其他金属离子,如Pb2+,Ni2+,Ag+,Mg2+,Co2+,Zn2+等也能够产生可测得的荧光信号变化,这表明传统的Cu-Enzyme与改进后的Cu-Enzyme相比,具有较差的特异性。这些结果清晰地证明了提出的改进后的Cu-Enzyme具有高特异性。
本发明采用以上技术方案,优点在于:首先,本发明的三种修饰DNA合成方法简单、快速、反应条件温和、容易控制,得到的DNA化合物具有良好的活性和稳定性。其次,对于传统Cu-Enzyme,虽然对于检测Cu(II)具有较高的灵敏度,较快的反应时间,但其它离子大量的存在也会干扰,因此限制了它在实际样品中的测定,而本方法兼具了Cu-Enzyme的高灵敏度,又具备极好的特异性与专一性,使其它常见金属离子不会干扰Cu(II)的测定。另外,点击化学反应具有反应条件温和,操作简单,产率高,选择性好等优点,同时荧光检测具有高效,快速,稳定性好等优点。
Claims (8)
1.一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:其包括如下步骤:
(1)分别设计并合成Cu-Sub序列、Cu-Enzyme 1序列和Cu-Enzyme 2序列;
(2)将Cu-Enzyme 1链、Cu-Enzyme 2链和Cu-Sub链在50 mM的PBS缓冲溶液中杂交1 h得到杂交液;
(3)在上述杂交液中加入2 µL 1M SA和不同浓度的Cu(II)引发CuAAC和DNA切割反应;
(4)在室温下用荧光分光光度计进行样品测量;
(5)根据收集的荧光强度信号,记录监测结果。
2.根据权利要求1所述的一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:所述步骤(1)中的Cu-Sub序列为从左到右5’到3’:猝灭基团-AGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-荧光基团。
3.根据权利要求1所述的一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:所述步骤(1)中的Cu-Enzyme 1序列为从左到右5’到3’:猝灭基团-GGTAAGCCTGGGCCTC-炔基。
4.根据权利要求1所述的一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:所述步骤(1)中的Cu-Enzyme 2序列为从左到右5’到3’:叠氮基-TTTCTTTTTAAGAAAGAAC。
5.根据权利要求1所述的一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:所述步骤(2)中的Cu-Sub链、Cu-Enzyme 1链和Cu-Enzyme 2链的浓度均为0.5 µM,杂交温度为37°C。
6.根据权利要求1所述的一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:所述步骤(3)中引发CuAAC和DNA切割反应的时间为2 h。
7.根据权利要求1所述的一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:所述步骤(4)中设置的激发和发射的狭缝宽度均为5.0 nm,激发波长为480 nm,荧光发射光谱的收集范围为490-600 nm。
8.根据权利要求1所述的一种基于高选择性荧光传感器检测Cu(II)的方法,其特征在于:所述荧光分光光度计为日立的型号F4600的荧光分光光度计。
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