CN113125399A

CN113125399A - 一种基于g-四联体比例荧光的铅离子检测方法

Info

Publication number: CN113125399A
Application number: CN202110401115.1A
Authority: CN
Inventors: 刘玉梅; 何强; 赵志峰
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2021-07-16

Abstract

本发明公开了一种基于G‑四联体比例荧光的铅离子检测方法，利用6‑羧基荧光素（FAM）基团标记的核酸适配体对Pb²⁺的构象响应及FAM荧光的稳定性和能特异识别G‑四联体构型的N‑甲基卟啉二丙酸IX（NMM）分子对Pb²⁺进行快速定量分析。本发明公开的方法只在适配体的5’端修饰了FAM基团，避免了核酸探针的复杂设计。同时FAM作为内参荧光，减少了实验加样过程中可能存在的试剂误差、仪器误差。另一方面，本发明所述方法是在室温条件下的一管内反应，避免了变温操作和复杂的分离过程。本发明具有结果准确、操作简单、反应快速、成本低廉、灵敏度高以及选择性好的优点，对Pb²⁺的检测限为1.04 nM，并能对不同的食品样品进行准确检测，是目前食品安全行业内急需的一种Pb²⁺快速检测方法。

Description

一种基于G-四联体比例荧光的铅离子检测方法

技术领域

本发明涉及食品安全快速检测技术领域，具体涉及一种基于G-四联体比例荧光的铅离子检测方法。

背景技术

一些重金属离子如铅离子（Pb²⁺）对人体健康危害极大，人体可以通过空气、灰尘、饮食等途径摄入Pb²⁺，过量的Pb²⁺可以进入人体血液循环从而作用于全身靶器官。Pb²⁺和许多疾病都有一定相关性，比如脑神经功能异常、肥胖症、生殖功能障碍等。特别是Pb²⁺对儿童的成长具有明显的影响，包括智力、免疫系统等方面。根据联合国相关组织的报道，一些落后国家和地区的儿童更容易受到Pb²⁺的伤害，并且对儿童的成长造成不可逆转的影响，因此能够快速定量检测Pb²⁺的方法是全球范围内急需的。目前检测铅离子污染的方法如原子炉火焰法，成本较高，需要大型仪器和专业人员，虽然能准确检测出食品中Pb²⁺的含量，然而这些方法不适用于现场即时检测（POCT, Point of care test），也不适用于落后国家和偏远地区的铅离子检测。

核酸适配体是利用SELEX筛选出能特异性识别小分子物质如金属离子、蛋白质、毒素的核酸序列。SELEX技术即指数富集的适配体系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)。利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出与靶物质高度亲和的核酸适配体(Aptamer)。另一方面，传统的适配体检测方法并不精确，受环境因素影响较大，比如加样误差、系统误差等。为了解决上述问题，比率荧光检测的方法诞生了。通过修饰荧光基团作为内参荧光，可以很好地消除加样误差等外界环境变化对实验结果的影响。

CN111562299A公开了一种用于Pb²⁺检测的电化学适配体传感器件的构建与分析应用。以碳离子液体电极（CILE）为基底电极，通过电还原法在CILE表面形成一层还原氧化石墨烯（rGO）薄膜，进一步修饰羧基化多壁碳纳米管制得具有优良导电性和大比表面积的修饰电极。采用电沉积法于修饰电极表面形成一层金纳米粒子，利用Au-S键合力将巯基化适配体探针自组装于电极表面，并以硫代乙醇酸封闭活性位点来消除非特异性吸附，得到用于检测Pb²⁺的电化学适配体传感器。然而该方法操作复杂，仍不能用于现场检测。

综上所述，一种快速、准确、简单易行的Pb²⁺定量方法是食品行业所必需的，因此为了更好地监控环境及食品中Pb²⁺污染的程度、缓解食品重金属污染问题，需要开发能快速检测食品中Pb²⁺的可靠方法。

发明内容

鉴于上述不足，本发明的目的在于提供一种简单的、快速的、准确的基于G-四联体比例荧光的Pb²⁺检测方法。通过绘制标准曲线确定该方法的检出限并验证其在实际样品检测中的可行性及选择性，从而得到一种方便快速、更为精准的Pb²⁺检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案:

一种基于G-四联体比例荧光的铅离子检测方法，包括如下步骤：

（1）制备荧光比值(EX485/EX399)随Pb²⁺浓度变化而变化的标准曲线；

（2）参照上述标准曲线的浓度范围及制备方法进行实际样品的检测，得到实际样品的荧光值比值，通过上述标准曲线计算实际样品中Pb²⁺的浓度。

其中，制备标准曲线的步骤包括：

（1）向1X缓冲溶液体系中加入2 μM 的NMM；500 nM核酸适配体；以及不同浓度Pb²⁺溶液，得铅离子待检溶液；

（2）将铅离子待检溶液涡旋混匀后于25-35 ℃条件下反应25-35 min，得反应液；

（3）测定反应液在399 nm及612 nm波长下的荧光强度并计算比值，得到荧光比值随Pb²⁺浓度变化而变化的标准曲线。

步骤（1）所述缓冲溶液组成为330 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 660 mM KCl (pH 7.9, 25℃ )；所述NMM染料为能特异识别G四联体的卟啉分子；所述核酸适配体在其5’端标记有FAM荧光基团，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述Pb²⁺溶液为醋酸铅溶液；

步骤（3）所述荧光强度的测定仪器为多功能酶标仪（BioTek，USA），FAM基团的激发波长为485 nm，发射波长范围为515 nm到650 nm, 步幅为2 nm; NMM的激发波长为399nm，发射波长范围为550 nm到700 nm，步幅为2 nm。

本发明的基本原理如图1所示，一方面，适配体在钾离子存在条件下会形成松散的G-四联体结构，此时溶液中的NMM可以轻易地嵌入到G-四联体中，当外界给予一定波长的激发时，因为NMM禁锢在G-四联体中，所以NMM吸收的能量无法以旋转的形式释放出去，只能以冷发光（荧光）的形式释放能量。当溶液中有Pb²⁺时，Pb²⁺会诱导适配体形成十分紧密的G-四联体结构，此时G-四联体无法容纳NMM这种卟啉大分子，只能以一种自由的状态分散在溶液中，因此从外界吸收的能量能以旋转的形式释放出去，而不是荧光形式。另一方面，修饰在适配体5’端的FAM基团，其荧光只与适配体的浓度有关，不受其它因素影响，因此可以通过比率法消除适配体浓度的变化、加样误差及系统误差对实验结果造成的影响,将荧光信号的比值作为信号输出，从而实现为铅离子的定量分析。

本发明与现有产品和技术相比，具有如下优点：

1、本发明提供的一种基于G-四联体比例荧光的铅离子检测方法，体系组成简单，在常温下进行反应，且在一管内反应，避免了复杂的升温和分离操作，适合POCT（Point ofcare test）；

2、本发明提供的检测方法，通过比例荧光的方法降低外界环境变化对实验结果的影响，可以更准确地对样品中的Pb²⁺进行定量；

3、本发明提供的检测方法，适用于检测不同食品样品如鸡蛋、自来水中的Pb²⁺含量；

4、本发明提供的检测方法，通过修饰不同的适配体，对于其他食品重金属污染物同样具有实践的通用性和设计的简洁性，如汞离子、铜离子、铊离子等。

附图说明

图1是本发明提供的方法用于检测Pb²⁺的原理图。

图2是实施例2绘制的标准曲线及对应光谱图。

图3是实施例3中检测鸡蛋、自来水中Pb²⁺的结果。

图4是实施例4对其他金属离子的选择性测试结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整。

实施例1

一种基于G-四联体比例荧光的Pb²⁺检测方法，包括以下步骤：

（1）Pb²⁺待检溶液的配置：向4μL缓冲液体系（330 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂,660 mM KCl，pH 7.9，25℃）中加入4 μL 20 μM NMM溶液、4μL的5 μM适配体溶液，及4 μL不同浓度的Pb²⁺溶液，再用分子生物水补足至40 μL，混匀后在30 ℃下反应30 min，得到Pb²⁺待检溶液。所述核酸适配体在其5’端标记有FAM荧光分子，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.1所示；

（2）荧光测定：分别在激发波长399 nm、485 nm和发射波长510-650 nm、550-700nm范围内测定NMM和FAM的荧光强度，分别记录520 nm、612 nm波长下的荧光值并计算比值。

实施例2

一种基于G-四联体比例荧光的Pb²⁺检测方法绘制标准曲线

采用实施例1中的检测步骤，其中待测Pb²⁺溶液为醋酸铅溶液（0 nM, 0.1 nM, 1nM, 10 nM, 50 nM, 200 nM, 300 nM, 500 nM , 600 nM, 700 nM, 800 nM），然后分别记录在发射波长为520 nm和612 nm处的荧光强度，并计算两处荧光强度的比值，进而拟合出荧光比值随着铅离子浓度变化而变化的标准曲线：y = 0.015x + 1.29，R² = 0.9929，并计算得出Pb²⁺检测限为1.04 nM，结果如图2所示。

实施例3

一种基于G-四联体比例荧光的Pb²⁺检测方法用于实际样品检测

（1）为了验证本发明的方法可以从实际食品样品中检测Pb²⁺，以鸡蛋和自来水为实际样品，验证本方法的可行性。首先对样品进行消化处理，在进行消化实验之前将蛋液充分混合，然后取0.5 mL蛋液，10 mL的 HNO₃和0.5 mL 的HCLO₄于消化管中。按照以下程序消化：120 ℃持续1 h，180 ℃持续3 h，200 ℃持续1 h。最后，用1M KOH将反应剩余溶液的pH值调节至约7.0，最终体积定容为10 mL。

（2）用（1）所得到的溶液分别配制浓度为50 nM、200 nM、500 nM的Pb²⁺样品溶液；

（3）采用实施例1中的检测步骤，其中待测Pb²⁺溶液为步骤（1）制得的Pb²⁺样品溶液，然后记录在发射波长为520 nm和612 nm处的荧光强度，并计算两处荧光强度的比值，代入实施例2得到的标准曲线：y = 0.015x + 1.29，R² = 0.9929，得到待测样品溶液中的Pb²⁺浓度，结果如图3，其回收率为85.8%~110.6%。

实施例4

一种基于G-四联体比例荧光的Pb²⁺检测方法对Pb²⁺的高选择性

（1）取用分子生物水配制100 nM、300 nM、700 nM的Pb²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cd²⁺标准溶液；

（2）采用实施例1中的检测步骤，其中待测Pb²⁺溶液为步骤（1）制得的各重金属离子溶液，然后记录在发射波长为520 nm和612 nm处的荧光强度，并计算两处荧光强度的比值，结果如图4所示。

实施例5

本实施例中，考察本发明提供的检测方法的信噪比，步骤如下:

（1）Pb²⁺检测溶液的制备：

向4 μL缓冲液体系（330 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 660 mM KCl，pH 7.9 ,25℃）中加入4μL 的20μM的 NMM溶液、4μL的5μM适配体溶液，再用分子生物水补齐至40 μL，混匀后在30 ℃下反应5 min，得到Pb²⁺检测液。所述核酸适配体在其5’端标记有FAM荧光分子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

（2）测定方法

向Pb²⁺检测液中加入4μL不同浓度的Pb²⁺溶液，混匀后置于30 ℃下孵育30 min，然后分别在激发波长399 nm、485 nm和发射波长510-650 nm、550-700 nm范围内测定NMM和FAM的荧光强度，并计算比值。

（3）将步骤（2）中的铅离子溶液替换为等量的分子生物水，重复步骤（1）、（2）的操作，记录在发射波长520 nm与612nm处的荧光强度的比值，即得信噪比，结果如表1所示。

对比例1

与实施例5相比，对比例1没有在适配体的5’端修饰FAM荧光基团，没有内参荧光来消除加样误差。因此实验存在较大的误差。

检测原理：适配体在钾离子存在条件下会形成松散的G四联体结构，此时溶液中的NMM可以轻易地嵌入到G四联体中，当外界给予一定波长的激发时，因为NMM禁锢在G四联体中，所以NMM吸收的能量无法以旋转的形式释放出去，只能以冷发光的形式（荧光）释放能量。当溶液中有Pb²⁺时，Pb²⁺会诱导适配体形成紧密的G四联体结构，此时G四联体无法容纳NMM这种大卟啉分子，NMM以一种自由的状态分散在溶液中，因此从外界吸收的能量能以旋转形式释放出去，而不是荧光形式，因此将NMM分子荧光强度的变化作为信号输出实现对Pb²⁺溶液的定量分析。

实验步骤如下：

（2）荧光测定：在激发波长399 nm和发射波长550-700 nm范围内测定NMM的荧光强度，并记录在发射波长612nm的荧光；

（3）将步骤（2）中的铅离子溶液替换为等量的分子生物水，重复步骤（1）、（2）的操作，记录在发射波长612nm处的荧光强度；

（4）几率步骤（3）与步骤（2）测得的荧光强度的比值，即得信噪比，结果如表1所示。

表1 实施例5与对比例1的信噪比

试验例	信噪比
		实施例5	10.46
对比例1	2.33

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种基于G-四联体比例荧光的铅离子检测方法

<141> 2021-04-05

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成单链DNA(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

gggtgggtgg gtgggt 16

Claims

1.一种Pb²⁺待检溶液，其特征在于由如下所述成分构成：

1X缓冲溶液；

2 μM NMM；

500 nM核酸适配体；以及

不同浓度Pb²⁺溶液；

将上述溶液涡旋混匀。

2.一种根据权利要求1所述的Pb²⁺待检溶液，其中：

所述缓冲溶液组成为330 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 660 mM KCl ( pH 7.9，25℃ )；

所述NMM为特异性识别G-四联体的卟啉分子；

所述核酸适配体为5’端修饰FAM荧光基团的Pb²⁺核酸适配体，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述Pb²⁺溶液为醋酸铅溶液；

所述待检溶液用分子生物水补齐至40μL。

3.一种根据权利要求1或2所述的Pb²⁺待检溶液在Pb²⁺定性、定量中的方法。

4.一种根据权利要求3所述的方法用于Pb²⁺检测的步骤，包括：

(a) 配置Pb²⁺待检溶液，于室温条件下反应；

(b) 测定待检溶液中NMM、FAM的荧光值并计算比值；

(c) 得到荧光比值随Pb²⁺浓度变化的标准曲线；

(d) 将标准曲线对应浓度的Pb²⁺添加到实际样品中，得到实际样品对应的FAM荧光与NMM荧光的比值，通过该比值和标准曲线反推待测样品中Pb²⁺的浓度并计算回收率。

5.根据权利要求4中所述的检测步骤，其中：

所述室温条件为25-35 ℃；

所述反应时间为25-35 min；

所述荧光的测定仪器为多功能酶标仪（BioTek，USA），FAM基团的激发波长为485 nm，发射波长范围为515 nm到700 nm，最大发射波长为520nm, 步幅大小为2 nm；NMM的激发波长为399 nm，发射波长范围为550 nm到700 nm，最大发射波长为612nm, 步幅大小为2 nm；

所述标准曲线为y =0.015x +1.29，R² =0.9929；

所述实际样品为容易污染Pb²⁺的食品原料。

6.一种根据权利要求4-6所述任一检测方法检测实际样品中的Pb²⁺。