CN109724957B - 一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法及其应用，属于纳米生物传感技术领域。室温下，在DMF和去离子水的混合溶剂中加入谷胱甘肽、硫酸铜制备具有磷光特性的铜纳米簇(Cu NCs)。铝离子(Al3+)可以有效增强Cu NCs的荧光，而焦磷酸根和铝离子具有较高亲和力使得Cu NCs/Al3+体系的荧光降低。向Cu NCs/Al3+体系中加入碱性磷酸酶和焦磷酸根的共孵育溶液，由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根，有效降低了焦磷酸根对Cu NCs/Al3+体系中Al3+的竞争作用。通过荧光强度变化实现对碱性磷酸酶的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法及其应用，属于生物传感技术领域。
背景技术
金属纳米团簇由数个以至数十个金属原子组成，尺寸接近电子费米波长，是一种新型的荧光纳米材料。由于金属纳米团簇超小的尺寸，使其具有出色的尺寸效应，优秀的光物理特性和催化效果。从生物探针到催化剂，LED到光电池，金属团簇在多个领域有着广泛的研究和应用。其中金属铜纳米簇具有更高的反应活性，与分子蛋白及酶更高的关联性。近些年来，金属纳米团簇由于其独特的化学、物理性质而引起了广泛的关注，越来越多的应用于生物荧光检测领域。
铝是地球上含量最多的金属元素，在日常生活中，工业和农业都占有重要位置。但是过量的铝离子不仅会危害植物的生长，而且还会引发人类疾病。正因为人体健康和铝离子的息息相关，所以近年来对铝离子检测的方法的研究越来越关注。检测铝离子的方法有很多种，如原子吸收光谱法，伏特法和电感耦合等离子体质谱法等等，但是这些方法有很多缺点，比如复杂的前处理过程、不能实时监控和昂贵的仪器损失费。而具有高灵敏度、高选择性、简单快捷、能实时监控优势的荧光探针成为众多研究者关注的焦点。但是目前所报道检测铝离子的荧光探针主要为传统有机小分子，普遍存在光化学稳定性差、斯托克斯位移较小等不容忽视的缺点,使其在应用中灵敏度降低,并且无法对标记物进行长期的追踪及观察标记物的动力学过程。为了克服上述不足，开发一种新型的检测铝离子探针具有重要的意义。
焦磷酸盐(PPi)是三磷酸腺苷(ATP)在细胞条件下水解的产物，在代谢酶促反应和生理能量传递等多种生物学过程中起着至关重要的作用，它是一种生物学上重要的靶向目标，其检测已成为研究实时DNA测序的方法。此外，PPi与许多疾病有关，如焦磷酸钙脱水晶体和软骨珊瑚虫病。因此，PPi的基于荧光的化学传感一直是传感研究中的主要焦点之一。对于生物系统中的应用，在磷酸盐(Pi)、5'-单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)和ATP存在下，PPi传感通常需要高度选择性。迄今为止，PPi受体设计中最成功的策略是在体系中加入金属离子形成配合物，因为金属离子与PPi之间有很强的结合亲和力，基于此可以检测到PPi。I.Ravikumar等研究了在生理条件下的锌(II)离子和PPi选择性荧光OFF-ON-OFF功能的化学传感器。基于喹啉的化学传感器处于OFF状态，通过荧光增强(ON状态)选择性地检测Zn2+，随后在相对于其他竞争性阴离子如Pi、AMP和ATP等，PPi表现出在缓冲溶液中的选择性荧光猝灭(OFF状态)，实现了对PPi的选择性检测。因此，检测PPi对于生物学过程的研究具有重大意义。
碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于生物组织中的膜结合酶。血清中ALP的异常表达与骨病、肝功能障碍、乳腺癌、前列腺癌以及糖尿病等多种疾病密切相关，是一种重要的生物标志物。此外，由于其具有高度的催化活性，广泛的底物特异性，容易与抗体结合，温和的反应条件和良好的稳定性等优点，ALP被广泛用作酶联免疫吸附测定(ELISA)中的标记酶，以产生可检测信号。因此，实现对ALP活性的高灵敏度和高选择性检测，对于ALP相关疾病的诊断和基于ALP的ELISA平台的开发具有重要意义。目前，有多种方法用于检测ALP，例如：比色法、化学发光法、电化学发光法及表面增强共振拉曼散射等方法。在这些方法中，普遍存在检测限低，价格昂贵，操作复杂等不足。因此，基于酶蛋白相应底物的荧光分析法响应快速，操作方法简单，受到了广泛的关注和重视。
综上所述，结合金属铜纳米簇稳定的荧光特性和生物关联性，通过铜纳米簇与铝离子具有相互作用，使用焦磷酸根作为反应底物，实现一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法及其应用于检测焦磷酸根和碱性磷酸水解酶具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的在于，为了克服现有技术的不足，提出一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法及其应用。所述方法可以通过温和的合成条件、简单的合成步骤、便宜的合成原料快速制备出具有磷光特性的铜纳米簇。所述的铜簇探针能有效、快速地实现对铝离子，焦磷酸根离子及碱性磷酸水解酶的高选择性和高灵敏度检测。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案之一是：一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法，包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为4:1～8，将5-50μL谷胱甘肽0.025～0.2M加入到300-500μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀，取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为300～2000μM，放入10-30℃振荡箱，慢速搅拌震荡1-20分钟，形成磷光铜纳米簇，配置铝离子于离心管中，在铜纳米簇中加入不同浓度的铝离子，充分振荡，室温放置，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强，根据荧光强度的变化，以此定量检测铝离子。
优选的，包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1，将20μL谷胱甘肽0.2M加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀，取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇，配置铝离子于离心管中，在铜纳米簇中加入不同浓度的铝离子，充分振荡，室温放置，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强，根据荧光强度的变化，以此定量检测铝离子。
优选的，在铜纳米簇中加入不同浓度铝离子，铜纳米簇浓度为50-200μM，铝离子浓度为0-100μM，充分振荡，室温放置5-20min，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强，根据荧光强度的变化，以此定量检测铝离子。
本发明提出的技术方案之二是：基于焦磷酸根竞争Al3+-铜簇聚集体中Al3+检测焦磷酸根的方法，包括如下步骤：由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强。配置焦磷酸根于离心管中，在与铜纳米簇-铝离子体系中加入不同浓度焦磷酸根，由于焦磷酸根与铝离子的结合作用使纳米簇-铝离子体系的荧光淬灭。根据荧光强度的变化，以此定量检测焦磷酸根；
具体为：包括如下步骤：在铜纳米簇中加入不同浓度铝离子，铜纳米簇浓度为50-200μM，铝离子浓度为0-100μM，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强。配置焦磷酸根于1mL离心管中，在与铜纳米簇-铝离子体系中加入不同浓度焦磷酸根，焦磷酸根浓度为0-100μM，由于焦磷酸根与铝离子的结合作用使纳米簇-铝离子体系的荧光淬灭。根据荧光强度的变化，以此定量检测焦磷酸根。
本发明提出的技术方案之三是：基于磷光铜纳米簇探针检测碱性磷酸水解酶的方法，包括如下步骤：由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强。取不同浓度碱性磷酸酶孵育的焦磷酸根加入与铜纳米簇-铝离子体系中，充分振荡，室温放置。焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜纳米簇-铝离子体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此定量检测碱性磷酸酶。
具体为：包括如下步骤：在铜纳米簇中加入不同浓度铝离子，铜纳米簇浓度为50-200μM，铝离子浓度为0-100μM，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强。取不同浓度碱性磷酸酶加入焦磷酸根总体积为500μL，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-250mU/mL，焦磷酸根浓度为0-100μM，放入振荡箱37℃孵化0.5-2小时。取孵化后焦磷酸根5μL加入铜纳米簇-铝离子体系，充分振荡，室温放置5-30min。焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜纳米簇-铝离子体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此检测碱性磷酸酶能力。根据荧光强度的变化，以此定量检测碱性磷酸酶。
本发明提出的技术方案之四是：基于磷光铜纳米簇探针在复杂环境体系中检测碱性磷酸水解酶的方法，包括如下步骤：在人体血清复杂环境体系中，在铜纳米簇中加入铝离子，充分振荡，室温放置。由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强。取不同浓度碱性磷酸酶孵育的焦磷酸根加入与铜纳米簇-铝离子体系中，充分振荡，室温放置。焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜纳米簇-铝离子体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此定量检测复杂环境体系中的碱性磷酸酶。
具体为：包括如下步骤：在形成磷光铜纳米簇中加入0.5-5％的人体血清。在铜纳米簇中加入不同浓度铝离子，铜纳米簇浓度为50-200μM，铝离子浓度为0-100μM，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强。取不同浓度碱性磷酸酶加入焦磷酸根总体积为500μL，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-250mU/mL，焦磷酸根浓度为0-100μM，放入振荡箱37℃孵化0.5-2小时。取孵化后焦磷酸根5μL加入铜纳米簇-铝离子体系，充分振荡，室温放置5-30min。焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜纳米簇-铝离子体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此检测碱性磷酸酶能力。根据荧光强度的变化，以此定量检测复杂环境体系中的碱性磷酸酶。
本发明的有益效果：
本发明为一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法及其应用，通过铜纳米簇与铝离子具有相互作用，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强。通过焦磷酸根和铝离子较高的结合能力，使得Cu NCs/Al3+体系荧光减弱。在Cu NCs/Al3+体系中加入碱性磷酸酶和焦磷酸根的共孵育溶液，由于碱性磷酸酶能水解焦磷酸根，有效降低了焦磷酸根对Cu NCs/Al3+体系中Al3+的竞争作用。从而，实现绿色快速的定量检测碱性磷酸酶。该纳米探针还能够在人体血清中实现对碱性磷酸酶的检测。此磷光铜纳米簇探针具有合成简单，反应快，且对铝离子，PPi和碱性磷酸酶的检测具高灵敏度、很好的化学稳定性以及生物兼容性的特点。
附图说明
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为实施例1中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图2为实施例2中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图3为实施例3中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图4为实施例4中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图5为实施例5中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图6为实施例6中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图7为实施例7中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图8为实施例8中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图9为实施例9中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图10为实施例10中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图11为实施例11中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图12为实施例12中制得的铜纳米簇的磷光强度发射光谱图；
图13为实施例13中制得的铜纳米簇的紫外可见吸收光谱图；
图14为实施例13中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图15为实施例13中制得的铜纳米簇的荧光寿命图；
图16为实施例14中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图17为实施例15中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图18为实施例16中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图19为实施例17中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图20为实施例18中制得的铜纳米簇的荧光相对强度散点图；
图21为实施例18中制得的铜纳米簇的荧光相对强度线性关系图；
图22为实施例19中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图23为实施例20中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图24为实施例21中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图25为实施例22中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图26为实施例23中制得的铜纳米簇的荧光相对强度散点图；
图27为实施例23中制得的铜纳米簇的荧光相对强度线性关系图；
图28为实施例24中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图29为实施例25中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图30为实施例26中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图31为实施例27中制得的铜纳米簇的荧光发射光谱图；
图32为实施例28中制得的铜纳米簇的荧光相对强度散点图；
图33为实施例28中制得的铜纳米簇的荧光相对强度线性关系图；
图34为实施例39中制得的铜纳米簇的荧光相对强度柱状图；
图35为实施例30中计算制得的表格图；
图36为铜纳米簇检测碱性磷酸酶及其抑制剂的示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.025M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为1mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图1。
实施例2：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.05M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为2mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图2。
实施例3：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.1M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为4mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图3。
实施例4：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图4。
实施例5：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为1：2。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图5。
实施例6：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为1：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图6。
实施例7：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图7。
实施例8：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为4：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图8。
实施例9：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为300μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图9。
实施例10：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图10。
实施例11：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为800μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图11。
实施例12：取DMF和去离子水配置5mL混合溶液于20mL玻璃瓶中，DMF/H2O体积比例为2：1。配置0.2M谷胱甘肽溶液，取200μL谷胱甘肽溶液加至上述混合溶液中，轻轻摇晃至均匀，混合溶液中GSH浓度为8mM。再配置1M硫酸铜溶液，取5μL硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为1000μM。将玻璃瓶放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的铜纳米簇通过荧光分光光度计测量绘制荧光曲线，如图12。
实施例13：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。制备的磷光铜纳米簇通过紫外可见分光光度计和荧光分光光度计测量绘制吸收光谱曲线和荧光光谱曲线，并通过寿命检测绘出铜纳米簇的磷光寿命和拟合曲线。如图13，图14和图15。
实施例14：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入铝离子(5μM)振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图16。
实施例15：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入铝离子(10μM)振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图17。
实施例16：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入铝离子(20μM)振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图18。
实施例17：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入铝离子(30μM)振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图19。
实施例18：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇。在上述铜纳米簇中加入铝离子(0-30μM)振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度散点图和荧光相对强度线性关系图，如图20和图21。
实施例19：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入焦磷酸根(5μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图22。
实施例20：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入焦磷酸根(10μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图23。
实施例21：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入焦磷酸根(20μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图24。
实施例22：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入焦磷酸根(30μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图25。
实施例23：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入不同浓度焦磷酸根(0-200μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度散点图和荧光相对强度线性关系图，如图26和图27。
实施例24：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入5μL用碱性磷酸酶(50mU/mL)孵育的焦磷酸根(50μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图28。
实施例25：室室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入5μL用碱性磷酸酶(100mU/mL)孵育的焦磷酸根(50μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图29。
实施例26：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入5μL用碱性磷酸酶(150mU/mL)孵育的焦磷酸根(50μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图30。
实施例27：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入5μL用碱性磷酸酶(250mU/mL)孵育的焦磷酸根(50μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度图，如图31。
实施例28：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入5μL用不同浓度碱性磷酸酶(0-250mU/mL)孵育的焦磷酸根(50μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度散点图和荧光相对强度线性关系图，如图32和图33。
实施例29：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，分别加入5μL用单胺氧化酶A、单胺氧化酶B、牛血清白蛋白、谷胱甘肽、胰蛋白酶、溶菌酶的浓度为40ng/mL，和碱性磷酸酶(200mU/mL)孵育的焦磷酸根(50μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度柱状图，如图34。
实施例30：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，再加入铝离子(20μM)形成铜纳米簇-铝离子体系。在上述体系中，加入1％的人体血清，在加入5μL用不同浓度碱性磷酸酶(5、10、15、20mU/mL)孵育的焦磷酸根(50μM)，振荡反应。通过荧光分光光度计测量绘制荧光强度定量检测碱性磷酸酶并制成表格，如图35。
通过以上实施例和实验数据，可以得出：合成磷光铜纳米簇具有稳定的荧光特性和生物关联性，并通过铜纳米簇与铝离子具有相互作用，实现一种绿色快速的荧光分析铝离子，PPi和碱性磷酸酶的方法。此外，该纳米探针还成功够在人类血清中实现对碱性磷酸酶的检测。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法应用于检测碱性磷酸水解酶的方法，其特征在于：
包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1，将20μL谷胱甘肽0.2 M加入到480 μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀，取硫酸铜溶液加入玻璃瓶，使混合溶液中铜离子浓度为500μM，放入20 ℃振荡箱，慢速搅拌震荡1分钟，形成磷光铜纳米簇，在铜纳米簇中加入铝离子，铜纳米簇浓度为500 μM，铝离子浓度为20μM，充分振荡，室温放置5-20 min，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强，取不同浓度碱性磷酸酶加入焦磷酸根总体积为500 μL，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-250 mU/mL，焦磷酸根浓度为50 μM，放入振荡箱37 ℃孵化0.5-2小时；取孵化后焦磷酸根5 μL加入铜纳米簇-铝离子体系，充分振荡，室温放置5-30 min；焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜纳米簇-铝离子体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此检测碱性磷酸酶能力，根据荧光强度的变化，以此定量检测碱性磷酸酶。
2.根据权利要求1所述的基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法应用于检测碱性磷酸水解酶的方法，其特征在于：在复杂环境体系中，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强，取不同浓度碱性磷酸酶孵育的焦磷酸根加入与铜纳米簇-铝离子体系中，充分振荡，室温放置，磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜纳米簇-铝离子体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此定量检测复杂环境体系中的碱性磷酸酶，所述复杂环境为人体血清。
3.根据权利要求2所述的基于铝离子诱导磷光铜纳米簇聚集增强荧光检测铝离子的方法应用于检测碱性磷酸水解酶的方法，其特征在于：在形成磷光铜纳米簇中加入0.5-5%的人体血清，在铜纳米簇中加入铝离子，铜纳米簇浓度为50-200 μM，铝离子浓度为20μM，充分振荡，室温放置5-20 min，由于诱导聚集效应使铜纳米簇荧光增强，取不同浓度碱性磷酸酶加入焦磷酸根总体积为500 μL，混合溶液中磷酸水解酶浓度为0-250 mU/mL，焦磷酸根浓度为50μM，放入振荡箱37 ℃孵化0.5-2小时，取孵化后焦磷酸根5 μL加入铜纳米簇-铝离子体系，充分振荡，室温放置5-30 min，焦磷酸根受到不同浓度碱性磷酸酶的水解作用，抑制了焦磷酸根对铜纳米簇-铝离子体系的淬灭作用，根据荧光强度的变化，以此检测碱性磷酸酶能力，根据荧光强度的变化，以此定量检测复杂环境体系中的碱性磷酸酶。
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