CN104807795A - 一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法及应用于水样中Hg²⁺含量的检测，属于纳米材料制备技术领域。铜源溶液和蛋白质溶液混合均匀，用碱调节溶液pH至碱性，滴加氧化剂，加热孵化一段时间制得铜纳米簇，用于检测Hg²⁺的标准溶液或样品溶液的荧光强度，将其代入线性回归方程计算出样品中Hg²⁺的含量。由于氧化剂的强氧化性和配位能力，其既能改变蛋白质中二级结构，又能形成铜-蛋白质-氧化剂络合物，增强蛋白质的还原能力，显著加快铜纳米簇的形成。此合成方法简单快速，且得到的铜纳米簇亲生物性好、荧光量子产率高、光稳定性强。将铜纳米簇用于水样中Hg²⁺的检测，在分析时间、灵敏度、选择性和成本方面明显优于现有技术。

Description

一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法

技术领域

本发明涉及一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法及应用于水样中Hg²⁺含量的检测，属于纳米材料制备技术领域。

背景技术

金属纳米簇是由几十至几百个原子组成的新型纳米材料。不同于金属原子、金属纳米粒子和金属单质，金属纳米簇的尺寸接近电子的费米(Fermi)波长，可产生不连续的电子能级，表现出独特的光学、电学及化学性质(Díez I.；Ras R.H.A.Springer Ser.Fluoresc.2010，9：307-332)。相对于半导体量子点和有机荧光染料，金属纳米簇不仅产生尺寸依赖且可调的荧光，还有许多其他优良性能。例如，斯托克位移较大、荧光量子效率高和生物相容性好(Li Shang；Dong Shaojun；G.Ulrich Nienhaus.Nano Today,2011，6(4)：401-418)。目前，金属纳米簇已广泛应用于荧光检测、细胞成像、生物标记等领域(Li Jingjing；Wang Wenjing；Sun Defang；Chen Jiangning；Zhang Penghui；Zhang Jianrong；Min Qianhao；Zhu Junjie，Chem.Sci.2013，4：3514-3521)。然而，由于制备时间长、毒性高、稳定性差等，它们还不是最理想的发光纳米材料。因此，制备简便、低毒性、稳定性好的发光纳米材料已成为研究热点。

迄今为止，大量研究集中在金、银纳米簇的合成，然而众所周知，铜价格低廉，在地球上储存量大，具有良好的导电率，在我们的日常生活中起到广泛的作用。因此，铜纳米簇作为一种极具潜力的纳米材料，其合成与应用近年受到了广泛关注。然而，铜化学活性高，对空气和水极不稳定，水溶性铜纳米簇的制备较贵金属纳米簇更为困难。金属纳米簇制备主要的稳定剂是聚乙烯亚胺(Ling Yu；Zhang Na；Qu Fei；WenTing；Gao Zhongfeng；Li Nianbing；Luo Hongqun，Spectrochimica Acta Part A:Molecular andBiomolecular Spectroscopy，2014，118：315-320)，树状聚合物，青霉胺，DNA、牛血清白蛋白(BSA)(Hu Lianzhe；Yuan Yali；Zhang Ling；Zhao Jianming；Saadat Majeed；Xu Guobao，Analytica ChimicaActa，2013，762：83-86)、溶菌酶、胰蛋白酶和辣根过氧化物酶等。近来有学者提出使用小分子谷胱甘肽作为模板和还原剂合成铜纳米簇，谷胱甘肽含有一些亲水性官能团如羧基、氨基及还原性基团巯基，使得铜纳米簇能很好的分散在水溶液中，然而其在合成速率、荧光量子产率和对光稳定性方面仍然未达到理想效果。与小分子相比大分子蛋白质有其独特的优越性，其中牛血清白蛋白最为常用的金属纳米簇稳定剂，它含有583个氨基酸残基、由35个半胱氨酸组成的17个二硫键和一个游离巯基。游离巯基的存在使牛血清白蛋白具有一定还原性。因此，牛血清白蛋白在金属纳米簇制备中还具有还原剂的功能。由于铜的标准电极电势明显低于金和银，牛血清白蛋白还原Cu²⁺生成Cu⁰的反应速率低，导致铜纳米簇的制备需要较长时间。此外，所形成的铜纳米簇水溶液中仍含有较多Cu²⁺，从而限制了它在生物、医学等领域的应用。因此研究一种快速简单制备亲生物性铜纳米簇的方法势在必行。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的合成铜纳米簇的方法合成时间过长、成本较高、合成的铜纳米簇量子产率低、对光稳定性差，提供一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法及应用于水样中Hg²⁺含量的检测。方法显著加快了铜纳米簇的形成，且得到的铜纳米簇荧光量子产率高、光稳定性好，将其应用于水样中Hg²⁺的检测，操作方便、快速，明显改善了检测的稳定性、灵敏度和精密度。

本人经过广泛的研究和反复的试验发现，以蛋白质为稳定剂和还原剂和以氧化物为催化剂，快速制备出水溶性好、对光稳定、荧光量子产率高、生物毒性低的铜纳米簇。然后利用所制备的铜纳米簇实现了水样中Hg²⁺的快速检测，本发明人进一步对铜纳米簇的制备条件以及Hg²⁺检测进行优化选择，终于实现了制得稳定、低毒、有高量子产率的铜纳米簇以及提高其应用于水样中Hg²⁺检测的灵敏度和重现性的目的。

按照本发明提供的技术方案，一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法及其应用于水样中Hg²⁺含量的检测，其步骤为：

1)将铜源溶液和蛋白质溶液按一定比例混合，用碱调节溶液pH至碱性，室温下搅拌，得紫色的铜-蛋白质络合物；2)滴加适量的氧化剂于步骤1)所制备的铜-蛋白质络合物，加热孵化一段时间，得到铜纳米簇；3)移取一定量按步骤2)所制备的铜纳米簇于离心管中，加入一定量Hg²⁺标准溶液或样品溶液，孵化一段时间，在荧光分光光度计上测定其荧光强度，然后将荧光强度代入线性回归方程计算出样品中Hg²⁺的含量。

如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铜源是所有无机铜化合物或有机铜化合物中的一种或几种的混合物。

如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质是牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、血红蛋白等含有游离巯基的水溶性蛋白质中的一种或几种混合物。

如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱是以OH^-为阴离子、以Na⁺或K⁺为阳离子所组成的化合物中的一种或几种的混合物。

如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铜离子浓度为0.001～100.0mmol/L，蛋白质浓度为0.01～80.0mg/mL，铜溶液与蛋白质溶液体积比为10:1～1:10，碱的浓度为0.1～10mol/L，调节混合液的最终pH为10～12。

如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为H₂O₂、CH₃COOOH、Na₂O₂等含有过氧键的化合物、超氧化合物、N₂H₄、抗坏血酸中的一种或几种混合物。

如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂浓度为0.000001～10.0mol/L，氧化剂加入体积为0.001～20.0mL，氧化剂滴加速度为1～100D/min，加热温度为25～75℃，孵化时间为0.5～4h。

如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述铜纳米簇与含Hg²⁺水样混合体积比为1:6～6:1，荧光强度测定使用的激发波长在300～365nm，发射波长在400～460nm。

本发明的一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法及其应用于水样中Hg²⁺含量的检测较佳实施例包括以下步骤：

1)将20mmol/L硫酸铜溶液和20mg/mL牛血清白蛋白溶液按体积比1:5混合，用1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至10～12，室温下搅拌1～5min，得到紫色的铜-牛血清白蛋白碱性络合物；

2)在步骤1)所制备的铜-牛血清白蛋白碱性络合物中以10～20D/min速度滴加0.1mol/L的H₂O₂15～20mL，55℃恒温孵化0.5～4h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液；

3)移取600μL步骤2)所制备的铜纳米簇溶液于离心管中，加入100μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液，摇匀，室温下孵化10～30min，然后在荧光分光光度计上分别以320nm和420nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度，然后将荧光强度代入线性回归方程计算出样品中Hg²⁺的含量。

在该较佳实施例中，以硫酸铜为铜源，以牛血清白蛋白为稳定剂和还原剂，用氢氧化钠调节两者的混合物制得铜-牛血清白蛋白络合物，以过氧化氢为氧化剂，简单快速制得铜纳米簇。向所制得的铜纳米簇中加入Hg²⁺的标准溶液或样品溶液，进行荧光光谱或荧光强度扫描。研究表明，所制得的铜纳米簇对光稳定、荧光量子产率高、具有低生物毒性，对Hg²⁺有非常灵敏的荧光猝灭效应，其检测限达4.7×10^-12mol/L。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明的各优选方案可互相组合使用。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)采用大分子蛋白质作为稳定剂和还原剂，一方面，蛋白质有很多亲水性基团如羧基、氨基等，其中蛋白质中的巯基能与Cu⁺结合形成稳定的Cu-S键，铜纳米簇表面包裹一层致密的蛋白质亲水性壳，显著提升了纳米簇的稳定性和在水中的溶解度。另一方面，蛋白质中的游离巯基有一定还原性，可将铜-蛋白质中的Cu²⁺还原为Cu⁰或Cu⁺，从而形成铜纳米簇。与现有的制备方法相比，本方法更稳定。

(2)采用氧化剂作为催化剂，由于Cu²⁺/Cu⁰的还原电势比较高，蛋白质还原Cu²⁺的能力较弱，铜纳米簇的形成需要较长时间才能完成，为了加快铜纳米簇的生成，在体系中引入少量氧化剂。氧化剂在能改变蛋白质分子的二级结构，且作为配体可与蛋白质-铜结合形成饱和的蛋白质-铜-氧化剂配合物，加快铜纳米簇形成，增强铜纳米簇的稳定性和水溶性。

(3)与传统方法相比，铜离子转化为铜簇的转化率达到99％以上，荧光量子产率高，所合成的铜纳米簇无需长时间的透析后再使用，具有很好的亲生物性，为铜纳米簇在生物标记、医学和环境检测等方面的广泛应用奠定了扎实基础。

(4)本发明所得到的铜纳米簇对光稳定、荧光量子产率高，作为荧光纳米传感器用于检测Hg²⁺。由于Hg²⁺与巯基之间具有强的作用能力，对铜纳米簇产生荧光猝灭效应，通过测定铜纳米簇和Hg²⁺混合物的荧光强度，代入线性回归方程计算Hg²⁺的含量，因此Hg²⁺的检测在分析时间、成本、重现性方面明显优于原子吸收法，可广泛应用于水样中Hg²⁺的快速检测。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”、“常压”是指日常操作间的温度和气压，一般为25℃，一个大气压。

下述实施例中，所用的Cary Esclipse荧光分光光度计(美国瓦里安)，狭缝宽度为10nm。

实施例1

将20mmol/L硫酸铜溶液和20mg/mL牛血清白蛋白溶液按体积比1:5混合，用1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至12，在室温下搅拌5min，得到紫色的铜-牛血清白蛋白络合物；以20D/min速度滴加0.1mol/L的H₂O₂15mL，55℃恒温孵化1h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取600μL所制备的铜纳米簇溶液于离心管中，向其中加入100μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液，摇匀，室温下孵化10min，然后在荧光分光光度计上分别以320nm和420nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为4.7×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为0.9％。

实施例2

将20mmol/L硝酸铜溶液和15mg/mL牛血清白蛋白溶液按体积比1:5混合，用1.0mol/L氢氧化钾溶液调节溶液的pH至12，在室温下搅拌3min，得到紫色的铜-牛血清白蛋白络合物；以10D/min速度滴加1.0mol/L的H₂O₂1.5mL，55℃恒温孵化1h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取600μL所制备的铜纳米簇溶液于离心管中，向其中加入100μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液，摇匀，室温下孵化20min，然后在荧光分光光度计上分别以320nm和420nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为5.2×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为1.2％。

实施例3

将20mmol/L氯化铜溶液和50mg/mL牛血清白蛋白溶液按体积比2:3混合，用1.0mol/L氢氧化钾溶液调节溶液的pH至12，在室温下搅拌3min，得到紫色的铜-牛血清白蛋白络合物；以20D/min速度滴加0.1mol/L的H₂O₂20mL，70℃恒温孵化0.5h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取800μL所制备的铜纳米簇溶液，向其中加入200μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液于离心管中，摇匀，室温下孵化30min，然后在荧光分光光度计上分别以340nm和428nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为6.7×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为2.1％。

实施例4

将10mmol/L乙酸铜溶液和20mg/mL溶菌酶溶液按体积比2:5混合，用1.0mol/L氢氧化钾溶液调节溶液的pH至10，在室温下搅拌5min，得到紫色的铜-溶菌酶络合物；以20D/min速度滴加0.1mol/L的H₂O₂20mL，55℃恒温孵化2h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取500μL所制备的铜纳米簇溶液，向其中加入100μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液于离心管中，摇匀，室温下孵化20min，然后在荧光分光光度计上分别以360nm和435nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为5.6×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为1.5％。

实施例5

将10mmol/L高氯酸铜溶液和20mg/mL胰蛋白酶溶液按体积比2:5混合，用1.0mol/L氢氧化钾溶液调节溶液的pH至10，在室温下搅拌5min，得到紫色的铜-胰蛋白酶络合物；以20D/min速度滴加0.1mol/L的Na₂O₂20mL，55℃恒温孵化3h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取600μL所制备的铜纳米簇溶液，向其中加入100μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液于离心管中，摇匀，室温下孵化10min，然后在荧光分光光度计上分别以320nm和420nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为4.9×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为1.2％。

实施例6

将20mmol/L磷酸铜溶液和20mg/mL血红蛋白溶液按体积比1:5混合，用1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至11，在室温下搅拌5min，得到紫色的铜-血红蛋白络合物；以20D/min速度滴加0.1mol/L的CH₃COOOH 15mL，55℃恒温孵化1h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取600μL所制备的铜纳米簇溶液，向其中加入100μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液于离心管中，摇匀，室温下孵化10min，然后在荧光分光光度计上分别以320nm和420nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为5.9×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为1.9％。

实施例7

将20mmol/L硫酸铜溶液和15mg/mL鸡蛋白蛋白溶液按体积比1:5混合，用1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至12，在室温下搅拌5min，得到紫色的铜-鸡蛋白蛋白络合物；以20D/min速度滴加0.1mol/L的N₂H₄15mL，55℃恒温孵化1h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取800μL所制备的铜纳米簇溶液，向其中加入200μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液于离心管中，摇匀，室温下孵化10min，然后在荧光分光光度计上分别以320nm和420nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为4.9×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为1.1％。

实施例8

将50mmol/L氯化铜溶液和50mg/mL牛血清白蛋白溶液按体积比1:4混合，用1.0mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH至12，在室温下搅拌5min，得到紫色的铜-牛血清白蛋白络合物；以10D/min速度滴加0.1mol/L的抗坏血酸15mL，55℃恒温孵化1.5h，得到浅黄色的铜纳米簇溶液，储藏于4℃冰箱中；移取800μL所制备的铜纳米簇溶液，向其中加入200μL的Hg²⁺的标准溶液或样品溶液于离心管中，摇匀，室温下孵化10min，然后在荧光分光光度计上分别以320nm和420nm为激发波长和发射波长测试其荧光强度。根据荧光发射峰强度代于线性回归方程计算Hg²⁺含量，所得到Hg²⁺的检测限为5.5×10^-12mol/L。20次重复测定相对标准偏差为1.8％。

Claims (8)

1.本发明提供了一种亲生物性铜纳米簇的快速制备方法及应用于水样中Hg²⁺含量的检测，其步骤为：

1)将铜源溶液和蛋白质溶液按一定比例混合，用碱调节溶液pH至碱性，室温下搅拌，得紫色的铜-蛋白质络合物；2)滴加适量的氧化剂于步骤1)所制备的铜-蛋白质络合物，加热孵化一段时间，得到铜纳米簇；3)移取一定量按步骤2)所制备的铜纳米簇于离心管中，加入一定量Hg²⁺标准溶液或样品溶液，孵化一段时间，在荧光分光光度计上测定其荧光强度，然后将荧光强度代入线性回归方程计算出样品中Hg²⁺的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铜源是所有无机铜化合物或有机铜化合物中的一种或几种的混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质是牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、血红蛋白等含有游离巯基的水溶性蛋白质中的一种或几种混合物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碱是以OH^-为阴离子、以Na⁺或K⁺为阳离子所组成的化合物中的一种或几种的混合物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铜离子浓度为0.001～100.0mmol/L，蛋白质浓度为0.01～80.0mg/mL，铜溶液与蛋白质溶液体积比为10:1～1:10，碱的浓度为0.1～10mol/L，调节混合液的最终pH为10～12。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂为H₂O₂、CH₃COOOH、Na₂O₂等含有过氧键的化合物、超氧化合物、N₂H₄或抗坏血酸中的一种或几种混合物。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氧化剂浓度为0.000001～10.0mol/L，氧化剂加入体积为0.001～20.0mL，氧化剂滴加速度为1～100D/min，加热温度为25～75℃，孵化时间为0.5～4h。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述铜纳米簇与含Hg²⁺水样混合体积比为1:6～6:1，荧光强度测定使用的激发波长在300～365nm，发射波长在400～460nm。