CN108115127A - 一种纳米铜仿生材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种纳米铜仿生材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纳米铜仿生材料及其制备与应用，该材料包括内部的铜纳米颗粒以及包覆在铜纳米颗粒外部的蛋清白蛋白，所述铜纳米颗粒的粒径为3～9nm，纳米颗粒和蛋清白蛋白的质量比为1:(10～20)，其制备包括以下步骤：(1)将五水硫酸铜加入至蛋清白蛋白溶液中，搅拌均匀，得到混合溶液；(2)在混合溶液中加入氢氧化钠溶液并调节pH，搅拌、透析、冷冻干燥后即得所述纳米铜仿生材料，该材料用于生物医学领域。与现有技术相比，本发明该蛋清白蛋白包裹的纳米铜颗粒具有良好的稳定性、水溶液分散性、生物相容性，并且通过细胞内吸收实验表该纳米铜颗粒具有非常低的生物毒性，且制备简单，成本低。

Description

一种纳米铜仿生材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，具体涉及一种纳米铜仿生材料及其制备方法与应用。
背景技术
纳米材料被誉为21世纪的新材料，近年来纳米金属粒子引起了国内外各方的关注，其中铜纳米材料也是极具代表性的一种金属纳米材料,并且业已作为商业产品如纳米级抗衰老、抗骨质疏松症的治疗药物进入主流市场。金属铜作为一种重要的金属材料，具有非常优异的导电导热性、延展性等性能，并且储量丰富，价格便宜，环境又好，因此在生命科学领域具有良好的应用前景，同时我们也认识到在生活的各个领域铜纳米材料与我们人类产生了愈来愈密切的联系。
目前，制备铜纳米颗粒的方法有很多，主要包含电解法，化学沉淀法，物理气相沉积法，水热法，溶胶-凝胶法等，以上所述的方法各具有不同的特点，但是这些方法不但生产成本高，工艺复杂，并且容易团聚，很难满足生命科学领域的应用要求。纳米材料在光学、电学、磁学、力学和化学等方面可表现出异于常规块体材料的特殊性质。由于结构和尺寸是影响纳米材料性能的关键因素，因而对纳米材料形貌和尺寸的可控合成是其应用的前提和基础。
在自然界中，许多天然生物质都含有复杂的结构，此模板可以合成多种多样的无机纳米材料或有机纳米材料，这些生物纳米材料的几何尺寸高度均一，且具有结构多样性的特点。某些生物大分子还可通过自组装形成超分子结构，这极大地拓展了天然生物质作为模板的多样性。此外，天然生物质含有多种活性官能团，具有较高的化学反应活性，能与多种金属离子发生配位反应，这奠定了天然生物质作为模板合成纳米材料的化学基础。因此，天然生物质是制备结构复杂且粒径呈单分散分布的纳米材料的理想模板。
生物模板法制备纳米材料时，所依据的原理是生物矿化机理，生物矿化又是无机化学和生物医学间的桥梁之一，基于此机理合成的纳米材料已经越来越多地在生物医学中进行了运用，如利用微生物或蛋白质合成的贵金属材料金、银等被用作分子影像学的造影剂和癌症治疗中的药物载体。在生物矿化过程中，生物基质主要有两种用途.一是作为模板诱导前驱体复制模板的微观结构，在去除模板后使最终产物保留模板的微观纳米结构；二是作为稳定剂对金属或氧化物纳米粒子进行稳定和分散，制备纳米复合材料。目前，作为模板合成纳米材料的天然生物质主要是纤维素、壳聚糖、蛋白质和微生物等。但是，大部分基于无机纳米粒子的研究都是关于金、银、铂、铋以及钆等纳米粒子或者其复合物，人们对于铜相关纳米粒子及其复合物的研究相对较少。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种稳定性、水溶性及生物相容性良好的纳米铜仿生材料及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种纳米铜仿生材料，其特征在于，该材料包括内部的铜纳米颗粒以及包覆在铜纳米颗粒外部的蛋清白蛋白，所述铜纳米颗粒的粒径为3～9nm，所述铜纳米颗粒和蛋清白蛋白的质量比为1：(20～30)。本材料采用铜纳米颗粒和蛋清白蛋白，其中铜与常规的金、银等贵金属类生物材料相比，成本较低，且蛋清白蛋白(OVA)在蛋类中大量存在，本身所具有的生物特性使得该材料具有良好的生物相容性，而且基于蛋清白蛋白模板分子自身表面所具备的丰富官能团(如氨基、羧基、羟基等)，其也可作为多功能界面，用于靶向分子的特定修饰，所以本发明将两者结合形成核壳结构在生物成像领域及癌细胞药物载体等方面具有巨大的潜在应用前景。
一种如上所述纳米铜仿生材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将五水硫酸铜加入至蛋清白蛋白溶液中，搅拌均匀，得到混合溶液；
(2)在混合溶液中加入氢氧化钠溶液并调节pH，搅拌、透析、冷冻干燥后即得所述纳米铜仿生材料。
本方法反应原理如下：蛋清白蛋白在碱性条件下具有还原性，可将无水硫酸铜中的铜离子还原铜单质，且将铜单质包裹在蛋清白蛋白的壳体内，本方法中选用的OVA这种生物模板具有来源广、成本低、生物相容性好的特点，优于传统的有机或者无机盐模板。
优选的，所述的五水硫酸铜与蛋清白蛋白的质量比为1：(20～40)。
优选的，步骤(1)所述的搅拌温度为50～60℃，搅拌时间为5～10min，搅拌速率为500～1000r/min。
优选的，所述的氢氧化钠溶液的添加量为调节pH为9.5～10.5。
优选的，步骤(2)中所述的搅拌时间为6～8h，搅拌温度为50～60℃。
优选的，步骤(2)中所述冷冻干燥的温度为-20～-30℃。
该仿生材料的合成是在水溶液中进行，过程没有使用有机溶剂，从一定程度上可以降低对环境的污染。
以上条件所选取的温度及pH不会破坏蛋白质的结构，从而能够为铜纳米颗粒的生长提供良好的生物模板。
一种如上所述纳米铜仿生材料的应用，该仿生材料用于作为生物成像的造影剂或癌细胞药物的载体。
蛋清白蛋白蛋白质作为一种生物相容性好的大分子，利用此模板合成的纳米结构材料具有良好的生物相容性和高的生物安全性，而且易于表面修饰，使的本发明的仿生材料在生物医学领域有着广泛的应用潜力。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
(1)该蛋清白蛋白包裹的纳米铜颗粒具有良好的稳定性、水溶液分散性、生物相容性，并且通过细胞内吸收实验表该纳米铜颗粒具有非常低的生物毒性；
(2)易于表面功能化修饰：本纳米材料外部由OVA分子包裹，使得该材料具有良好的生物相容性，而且基于OVA分子本身具备的丰富官能团(如氨基、羧基、羟基等)，其也可作为多功能界面，用于靶向分子的特定修饰，从而进行进一步的生物医学应用；
(3)以蛋白质为模板合成的仿生的纳米材料的反应在水溶液中进行，没有有机溶剂的参与，符合绿色合成的思想，能够在一定程度上减少对环境的污染；
(4)蛋清作为日常生活中经常接触到的食品，具有价格便宜的特点，而且，作为铜源的五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)在自然界中储量丰富，而且相比于其他金属价格更加便宜，所以本发明合成的纳米铜材料具有经济成本低的独特优势。
附图说明
图1为本发明仿生材料的透射电镜扫描结果；
图2为本发明仿生材料的粒径分布图；
图3为本发明仿生材料的的紫外吸收图；
图4为实施例1中A549细胞在不同浓度仿生材料溶液中孵育24小时和48小时后细胞的存活率；
图5为不同浓度的碘海醇与仿生材料的CT值。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例采用的原料如下：99％冻干的蛋清白蛋白(OVA，CAS号9006-59-1)、氢氧化钠(NaOH，CAS号1310-73-2)购买自Sigma-Aldrich公司。胎牛血清(FBS)，RPMI-1640细胞培养基购自上海秉新生物科技有限公司。CellCountingKit-8(CCK-8)试剂盒购自上海碧云生物技术有限公司。A549细胞由中科院上海细胞所提供。
仿生材料(Cu@OVA)的制备：
称取五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)固体44.7mg，量取3.581ml去离子水使其溶解，取其中0.5ml加入到圆底烧瓶中；称取冻干的蛋清白蛋白250mg，并量取9.5ml去离子水配制成OVA溶液，快速加入到圆底烧瓶中。使圆底烧瓶中的溶液体系恒温在57℃的水浴锅中，转速恒定为650转/分钟，体系持续磁力搅拌10分钟后迅速加入浓度为1M的氢氧化钠溶液，调节溶液pH＝10。继续搅拌8h后，将得到的产物过滤,将最后的产物置于冷冻干燥机中冷冻干燥。取适量制备得到的表面包裹蛋清蛋白的仿生纳米铜材料(Cu@OVA)溶解于PBS中配成溶液，利用ICP精确定位其中铜含量,并保存于4℃冰箱中待用。
图1～图3分别为上述制备的仿生材料的透镜扫描结果、粒径分布以及紫外吸收实验结果，从中我们可以看出本发明制备得到的纳米Cu@OVA仿生材料平均粒径为5nm左右，而且在高倍镜下通过明暗差可以看出其表面被OVA所包裹。紫外吸收光谱中，280nm左右的吸收峰为OVA的特征吸收，进一步证明了纳米铜颗粒被OVA所包裹。
纳米材料的分散性和稳定性是考察其生物应用的一项重要指标。为了考察纳米铜材料的分散性和稳定性，取制备的纳米铜材料溶液4ml于透明玻璃瓶中作为对照组，并另外各取三份2ml纳米铜材料于三个玻璃瓶中，依次加入2ml PBS(pH＝7.4)、RPMI-1640、FBS作为实验组，在室温下静置12h、7天观察是否发生聚沉现象。经测定，本发明制备的纳米铜材料在不同的分散剂中均能稳定存在，而且静置7天以后也未发生团聚沉淀等现象，说明本发明制备的纳米铜材料具有良好的分散性和稳定性。
标准CCK-8分析法常被用来研究仿生纳米材料的生物相容性。在本实施例中采用标准CCK-8法来研究纳米铜材料的生物安全性，首先在两个96孔细胞培养板的每个孔中接种8000个A549细胞，在37℃，5％CO2条件下孵育过夜，此时细胞处于生长良好的对数期。然后弃掉旧的培养基，每孔重新加入含不同浓度铜的的完全培养基(浓度梯度为0、5、10、15、20、30ppm)100μL，常规培养24h和48h。终止培养后，将上清弃掉，每孔加入100μL培养基与CCK-8比例为10：1的CCK-8溶液，置于37℃恒温箱中孵育4h，然后用酶联免疫检测仪测450nm处各孔的吸光值(OD值)，数据处理后得到细胞存活率与孵育浓度间的关系图。图4为A549细胞分别与不同浓度Cu@OVA孵育24小时和48小时后细胞的存活率，未处理的细胞作为对比，结果表明仿生纳米铜材料对A549细胞存活率影响不大，即使在最大浓度30ppm时细胞存活率仍然保持在80％左右。另外，我们发现当细胞与材料共孵育48h后细胞的存活率与孵育24h相比反而升高，这可能是因为OVA为细胞生长提供了一个良好的界面。CCK-8结果表明本发明所涉及的仿生纳米铜材料对A549细胞毒性小，生物相容性好，在生物医学方面具有良好应用价值。
通过对目前临床常用的造影剂-碘海醇以及本应用所合成的仿生材料之间的CT造影效果，其结果如图5所示，对比发现，本应用所合成的仿生材料具有优异的CT成像效果，所以本发明的仿生材料可用于生物成像的造影剂。
实施例2
采用与实施例1类似的制备方法，不同之处在于：
(1)五水硫酸铜与蛋清白蛋白的质量比为1：20，且两者混合后的搅拌温度为50℃，搅拌时间为10min，搅拌速率为500r/min；
(2)氢氧化钠溶液的添加量为调节pH为9.5；添加完氢氧化钠之后，搅拌时间为6h，搅拌温度为60℃；
(3)冷冻干燥的温度为-20℃。
经检测，本实施例制得的铜纳米仿生材料分散性和稳定性良好，且生物相容性良好。
实施例3
采用与实施例1类似的制备方法，不同之处在于：
(1)五水硫酸铜与蛋清白蛋白的质量比为1：40，且两者混合后的搅拌温度为60℃，搅拌时间为5min，搅拌速率为1000r/min；
(2)氢氧化钠溶液的添加量为调节pH为10.5；添加完氢氧化钠之后，搅拌时间为8h，搅拌温度为50℃；
(3)冷冻干燥的温度为-30℃。
经检测，本实施例制得的铜纳米仿生材料分散性和稳定性良好，且生物相容性良好。

Claims (8)

1.一种纳米铜仿生材料，其特征在于，该材料包括内部的铜纳米颗粒以及包覆在铜纳米颗粒外部的蛋清白蛋白，所述铜纳米颗粒的粒径为3～9nm，所述铜纳米颗粒和蛋清白蛋白的质量比为1：(10～20)。
2.一种如权利要求1所述纳米铜仿生材料的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
(1)将五水硫酸铜加入至蛋清白蛋白溶液中，搅拌均匀，得到混合溶液；
(2)在混合溶液中加入氢氧化钠溶液并调节pH，搅拌、透析、冷冻干燥后即得所述纳米铜仿生材料。
3.根据权利要求2所述的一种纳米铜仿生材料制备方法，其特征在于，所述的五水硫酸铜与蛋清白蛋白的质量比为1：(20～40)。
4.根据权利要求2所述的一种纳米铜仿生材料制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的搅拌温度为50～60℃，搅拌时间为5～10min，搅拌速率为500～1000r/min。
5.根据权利要求2所述的一种纳米铜仿生材料制备方法，其特征在于，所述的氢氧化钠溶液的添加量为调节pH为9.5～10.5。
6.根据权利要求2所述的一种纳米铜仿生材料制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的搅拌时间为6～8h，搅拌温度为50～60℃。
7.根据权利要求2所述的一种纳米铜仿生材料制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述冷冻干燥的温度为-20～-30℃。
8.一种如权利要求1所述纳米铜仿生材料的应用，其特征在于，该仿生材料用于作为生物成像造影剂或癌细胞药物的载体。
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