CN102397266A - 纳米颗粒的制备方法及用该方法制备的纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纳米颗粒的制备方法，该方法包括将第一微乳液与第二微乳液混合；所述第一微乳液含有表面活性剂、有机溶剂和第一反应物的水溶液，所述第二微乳液含有表面活性剂、有机溶剂和第二反应物的水溶液；所述第一反应物和第二反应物接触后能够形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性剂和所述第二微乳液中的表面活性剂相同，为油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂的混合物，或者为十六烷基三甲基溴化铵等阳离子型表面活性剂。本发明的纳米颗粒安全性好且能明显提高基因的转染水平、促进蛋白质或药物进入细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米颗粒的制备方法以及利用该方法制备的纳米颗粒。
背景技术
生物体作为复杂的有机体，其天然防御系统在维持机体的动态稳定过程中具有极其重要的意义。网状内皮系统、单核巨噬细胞系统和免疫系统等都发挥着重要作用。然而在保护机体的同时，一些治疗疾病的药物分子则可能因为机体的这些保护机制而在到达靶器官前即被清除或降解，难以实现靶向器官或在靶标部位实现有效蓄积。因此，在疾病的治疗过程中，药物在机体内部的稳定性、循环时间或半衰期、以及其能否快速到达靶器官并形成有效蓄积对于快速有效地治愈疾病发挥着关键作用。
基于在替换功能紊乱基因和一些重大疾病治疗方面的潜在应用，基因治疗在近年来受到广泛关注。基因治疗即将外源基因导入细胞，从而修复细胞丧失的功能或功能紊乱，或为细胞引入其他新的功能。外源基因要进入细胞发挥作用需要克服以下几种屏障：细胞膜、内吞体或溶酶体、核膜。
自从疫苗问世以来，其对于降低人类的发病率和死亡率发挥着极其重要的作用。对于一些重大疾病尤其是传染病如肝炎、艾滋病等，开发安全、高效、长效的疫苗则显得更为重要。在疫苗的开发过程中，除了抗原方面的优化筛选外，疫苗载体的开发研究也是其中一个重要工作。疫苗载体一般分为病毒载体和非病毒载体。就目前而言，临床上批准使用的疫苗也基本上以灭活的或毒力弱化的病毒作为主要的疫苗载体。然而，灭活或弱化的病毒载体仍有恢复毒力的可能，同时具有一定的毒副作用，甚至可将其基因片段整合至机体。这也因此限制了病毒疫苗载体在临床的应用与开发。因此，近年来 非病毒载体尤其是纳米颗粒载体方面的开发研究受到了广泛的关注。而相对于其他非病毒载体来说，纳米颗粒载体也具有很大的优势。例如：纳米颗粒易于制备、修饰加工且可控性好，可保护药物、基因或功能性分子免受机体或一些酶类的降解作用等。某些纳米颗粒在充当“载体”角色的同时，还具有免疫佐剂的功能。目前，聚合物纳米颗粒、树形分子、金纳米颗粒、富勒烯和生物源性纳米结构等已有大量研究。与其他纳米颗粒相比，磷酸钙纳米颗粒的安全性高、生物相容性好。与铝佐剂相比，其具有相同或更强的免疫佐剂作用且所引起的免疫反应持续时间较长，同时磷酸钙纳米颗粒还是潜在的黏膜免疫佐剂，其可刺激机体产生系统免疫反应和黏膜免疫反应。然而，磷酸钙纳米颗粒作为基因或疫苗载体时，其基因转染的重复性较差。
化学合成法由于其成本低、操作简便等优点而成为纳米材料的主要合成方法，反相胶束法则由于其在合成过程中对纳米材料的可控性好且所合成的纳米材料稳定性好、粒径分布狭窄等优势而得到广泛应用。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)为非离子型表面活性剂，无毒、无抗原性、无致敏性、无刺激性，还可促进DNA的入胞和核运输过程、促进基因在肌肉中的表达水平和持续时间。研究显示，其主要通过活化NF-κβ信号途径来增强基因表达水平。
发明内容
本发明为了解决疫苗或药物载体的安全性问题，同时为了提高DNA在体外的细胞转染效率、促进蛋白质抗原或药物进入细胞或机体，从而实现DNA、蛋白质抗原或药物作用的有效发挥，提供一种磷酸钙或碳酸钙纳米颗粒的制备方法、以及利用该方法制备的纳米颗粒。
本发明提供一种纳米颗粒的制备方法，该方法包括将第一微乳液与第二微乳液混合，得到纳米颗粒a；所述第一微乳液含有表面活性剂、有机溶剂 和第一反应物的水溶液，所述第二微乳液含有表面活性剂、有机溶剂和第二反应物的水溶液；所述第一反应物和第二反应物接触后能够形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性剂和所述第二微乳液中的表面活性剂相同，为油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂的混合物，或者为十六烷基三甲基溴化铵。
本发明还提供根据上述制备方法制备的纳米颗粒。
本发明以反相胶束法合成纳米颗粒，将反应物限定在纳米级反应器-反相微乳液滴中，通过在微乳液滴相互碰撞的过程中实现反应物之间的作用，从而合成纳米颗粒。在合成过程中可以添加药物分子、蛋白质抗原或功能基因，从而将其包裹在纳米颗粒中，同时还可以实现药物、蛋白质抗原或功能基因长期、有效的释放，进而发挥其治疗或预防疾病的作用。
本发明以聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等阳离子型表面活性剂作为反相胶束或反相微乳体系中的表面活性剂，从而在实现对纳米颗粒可控合成的同时，保证纳米颗粒的安全性，并且在防止纳米颗粒团聚的同时，促进药物、蛋白质抗原或DNA等进入细胞且可使药物、蛋白质抗原或DNA在较长时间内高效表达，从而有效发挥其作用。
本发明通过以改性聚乙二醇(PEG)修饰纳米颗粒，从而避免其过早的被网状内皮系统吞噬，延长其在机体内的循环时间，将促进颗粒进入细胞的功能分子如转铁蛋白等或促进颗粒入核的功能分子如一些核定位信号等成功连接在纳米颗粒表面，实现药物分子的大量入胞从而发挥其作用或一些功能基因在细胞内的有效表达，进而实现药物或功能基因治疗或预防疾病的目的。
本发明通过在纳米颗粒表面修饰靶向抗原呈递细胞(APCs)的特异性抗体，尤其是树突状细胞的特异性抗体，从而更加有效地将抗原呈递至T细胞、 B细胞，使得该纳米颗粒能广泛应用于疫苗领域成为可能。
附图说明
图1是实施例1的纳米颗粒的电位检测结果。
图2是实施例4的纳米颗粒的电位检测结果。
图3是实施例1的纳米颗粒的扫描电镜图。
图4是实施例1的纳米颗粒的粒径分布图。
图5是实施例16的纳米颗粒对HEK293细胞的转染图片(放大倍数10×10)。
图6是表示实施例1所制备的纳米颗粒的对HEK293细胞活力的影响的柱状图。
具体实施方式
本发明提供一种纳米颗粒的制备方法，该方法包括将第一微乳液与第二微乳液混合，得到纳米颗粒a；所述第一微乳液含有表面活性剂、有机溶剂和第一反应物的水溶液，所述第二微乳液含有表面活性剂、有机溶剂和第二反应物的水溶液；所述第一反应物和第二反应物接触后能够形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性剂和所述第二微乳液中的表面活性剂相同。
为了实现对纳米颗粒的可控合成并防止其团聚，所述表面活性剂使用油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂(Pluronic)和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂(Pluronic)的混合物，也可以使用十六烷基三甲基溴化铵等阳离子型表面活性剂。当表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵时，为了保证微乳液良好的稳定性，第一微乳液和第二微乳液中还含有助表面活性剂。
在本发明的纳米颗粒的制备方法中，所述第一微乳液和第二微乳液的重 量比使得所述第一微乳液中的第一反应物与所述第二微乳液中的第二反应物的摩尔比可以为1-2∶1。
在本发明的第一微乳液中，相对于1重量份的表面活性剂，所述有机溶剂的含量可以为0.1-15重量份，优选为0.11-0.25重量份，所述第一反应物的水溶液的含量可以为0.008-2.3重量份，优选为0.008-1重量份，更优选为0.0125-0.0625重量份，所述第一反应物的水溶液的浓度可以为1mM-1M，优选为12.5mM-0.5M。
在本发明的第二微乳液中，相对于1重量份的表面活性剂，所述有机溶剂的含量可以为0.1-15重量份，优选为0.11-0.25重量份，所述第二反应物的水溶液的含量可以为0.008-2.3重量份，优选为0.008-1重量份，更优选为0.0125-0.0625重量份，所述第二反应物的水溶液的浓度为0.5mM-0.5M，优选为6.25mM-0.25M。
在所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂的混合物中，油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂的重量比可以为0.1-10∶1，优选为0.1-3.75∶1。所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵时，第一微乳液和第二微乳液中还含有助表面活性剂，且相对于1重量份的表面活性剂，所述助表面活性剂可以为0.72-5.6重量份，优选为0.72-2.8重量份。
本发明中的所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂中聚氧乙烯和聚氧丙烯的重量比为0.15-0.56∶1，优选为0.15∶1或0.56∶1，更优选为0.56∶1。所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂可以使用市售商品，例如德国BASF公司的Pluronic L61、Pluronic P103、Pluronic P123等。
本发明中的所述水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂中聚氧乙烯和聚氧丙烯的重量比为0.56-5.26∶1，优选为0.88∶1、1.32∶1或3.03∶1，更优选为1.32∶1。所述水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂可以使用市售商品，例如德国BASF公司的Pluronic L64、Pluronic F127和PluronicP85等。
在本发明中使用的所述助表面活性剂可以为碳原子数为2-6的醇中的一种或多种，优选为丙二醇、正丁醇、丁二醇、正戊醇、异戊醇和正己醇中的一种或多种，更优选为正戊醇或正己醇。
本发明中的所述第一反应物为氯化钙。所述第二反应物为选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二氨、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种。
本发明中的所述有机溶剂可以选用烷烃化合物或酯化合物，其中所述烷烃化合物为选自碳原子数为6-12的烷烃化合物中的一种或多种，例如，环己烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、十一烷和十二烷，优选为环己烷或正己烷；所述酯化合物为选自肉豆蔻酸肉豆蔻酯、棕榈酸异辛酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、乙二醇双硬脂酸酯、乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、十六酸十六酯和十八酸十八酯中的一种或多种，优选为肉豆蔻酸异丙酯。
由于在上述纳米颗粒的制备原料中含有如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等阳离子型表面活性剂，所以所述的纳米颗粒表面带正电荷，本发明中的所述纳米颗粒可以带有10-30毫伏的正电荷。因此，本发明的纳米颗粒，既可在制备纳米颗粒a的过程中包裹DNA、蛋白质抗原或药物，亦可在制备完纳米颗粒a后，使其与DNA、蛋白质抗原或药物相互吸附，得到载有DNA、蛋白质抗原或药物的纳米颗粒b。
在第一微乳液和第二微乳液中还分别含有DNA、蛋白质抗原或药物的 情况下，将含有DNA、蛋白质抗原或药物的第一微乳液与含有DNA、蛋白质抗原或药物的第二微乳液接触，得到纳米颗粒a，且在第一微乳液中，相对于1重量份的所述第一反应物，所述DNA、蛋白质抗原或药物的用量为0.0003-0.6重量份，优选为0.001-0.45重量份；在第二微乳液中，相对于1重量份的所述第二反应物，所述DNA、蛋白质抗原或药物的用量为0.0004-0.9重量份，优选为0.0015-0.8重量份。
在制备完纳米颗粒a后，使其与DNA、蛋白质抗原或药物相互吸附的情况下，在溶剂存在下，将所得到的纳米颗粒a与DNA、蛋白质抗原或药物进行接触，得到纳米颗粒b，且相对于1重量份的所述第一反应物，所述DNA、蛋白质抗原或药物的用量为0.0003-0.6重量份。所述溶剂为能够溶解DNA、蛋白质抗原或药物的溶剂。
由于在本发明中的DNA、蛋白质抗原或药物是被包裹在纳米颗粒中，或通过静电吸附作用与纳米颗粒表面结合，因此，在本发明中，对DNA、蛋白质抗原和药物没有特别的限定。
为了实现纳米颗粒免受网状内皮系统的过早吞噬，延长其在血液循环中的时间，本发明的制备方法还包括：在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将所述纳米颗粒a与碳二亚胺盐酸盐进行混合后离心，在PBS缓冲溶液中，将离心后的沉淀与改性聚乙二醇进行混合，得到纳米颗粒c，且相对于1重量份的所述纳米颗粒a，所述碳二亚胺盐酸盐的用量可以为0.1-0.5重量份，所述改性聚乙二醇的用量可以为0.1-0.5重量份；优选情况下，相对于1重量份的所述纳米颗粒a，所述碳二亚胺盐酸盐的用量为0.2-0.4重量份，所述改性聚乙二醇的用量为0.2-0.4重量份。
本发明的制备方法还包括：在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将所述纳米颗粒b与碳二亚胺盐酸盐进行混合后离心，在PBS缓冲溶液中，将离心后的沉淀与改性聚乙二醇进行混合，得到纳米颗粒d，且相对于1重量份的所述纳米 颗粒b，所述碳二亚胺盐酸盐的用量可以为0.1-0.5重量份，所述改性聚乙二醇的用量可以为0.1-0.5重量份；优选情况下，相对于1重量份的所述纳米颗粒b，所述碳二亚胺盐酸盐的用量为0.2-0.4重量份，所述改性聚乙二醇的用量为0.2-0.4重量份。
在本发明中，所述改性聚乙二醇的骨架为聚乙二醇骨架、两个端基分别为氨基和羧基或两个端基均为氨基，所述改性聚乙二醇的重均分子量可以为370-1150，所述改性聚乙二醇可以使用例如上海炎怡生物科技有限公司的NH2-PEG-COOH。
在本发明的制备方法中还包括，在MES缓冲液中，将纳米颗粒c与核定位信号、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体中的任意一种或多种一次或分多次接触，每次接触的时间为2-12h，且相对于1重量份的纳米颗粒c，所述NLS的用量可以为0-1重量份，优选0-0.5重量份，所述促进入胞功能分子的用量可以为0-1重量份，优选0-0.5重量份，所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的用量可以为0-1重量份，优选0-0.5重量份，NLS、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的总用量为0.1-3重量份。
在本发明的制备方法中还包括，在MES缓冲溶液中，将纳米颗粒d与核定位信号、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体中的任意一种或多种一次或分多次接触，每次接触的时间为2-12h，且相对于1重量份的纳米颗粒d，所述NLS的用量可以为0-1重量份，优选0-0.5重量份，所述促进入胞功能分子的用量可以为0-1重量份，优选0-0.5重量份，所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的用量可以为0-1重量份，优选0-0.5重量份，NLS、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的总用量为0.1-3重量份。
上述NLS为一簇碱性氨基酸序列，例如SV40T抗原、被间隔区分开的 两簇带正电的氨基酸残基序列、c-MYC原癌基因的核定位信号及其他类型核定位信号如核糖体蛋白等中的一种；上述促进入胞功能分子为含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的肽类物质、转铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、叶酸等中的一种；所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体为anti-DEC205等。
本发明的制备方法中还包括将上述纳米颗粒进行冷冻干燥的步骤，所述冷冻干燥采用本领域常规的冷冻干燥方法，并没有特别的限制。
本发明还提供根据上述制备方法制备的纳米颗粒。
下面结合实施例和附图具体说明本发明。
实施例1
纳米颗粒的制备
(1)第一微乳液的制备：取3.3g Pluronic L64(德国BASF公司)、0.3g Pluronic L61(德国BASF公司)和0.4g肉豆蔻酸异丙酯(美国ACROS公司)混合均匀后，滴加45μl氯化钙水溶液(12.5mM)，搅拌12h。
(2)第二微乳液的制备：取3.3g Pluronic L64(德国BASF公司)、0.3g Pluronic L61(德国BASF公司)和0.4g肉豆蔻酸异丙酯(美国ACROS公司)混合均匀后，滴加45μl磷酸氢二钠水溶液(12.5mM)，搅拌12h。
(3)在25℃下，将第二微乳液加入到第一微乳液中，继续搅拌12h；以8000rpm，离心30min后，以无水乙醇洗涤2次，最后以1ml双蒸水分散即可得到纳米颗粒溶胶。
利用激光粒度仪对所得到纳米颗粒进行检测，结果见图1，纳米颗粒表面呈中性，带有0.08毫伏电荷。
实施例2
纳米颗粒的制备
(1)第一微乳液的制备：取2.14g Pluronic P123(德国BASF公司)、1.29g Pluronic P85(德国BASF公司)和0.57g正己烷混合均匀后，滴加135μl氯化钙水溶液(0.1M)，搅拌12h。
(2)第二微乳液的制备：取2.14g Pluronic P123(德国BASF公司)、1.29g Pluronic P85(德国BASF公司)和0.57g正己烷混合均匀后，滴加135μl磷酸氢二氨水溶液(0.06M)，搅拌12h。
(3)在25℃下，将第二微乳液加入到第一微乳液中，继续搅拌12h；以8000rpm，离心30min后，以无水乙醇洗涤2次，最后以1ml双蒸水分散即得纳米颗粒溶胶。
利用激光粒度仪对所得到纳米颗粒进行检测，结果与实施例1相似，纳米颗粒表面呈中性，带有0.12毫伏的电荷。
实施例3
纳米颗粒的制备
(1)第一微乳液的制备：取0.67g Pluronic F127(德国BASF公司)、2.53g Pluronic L61(德国BASF公司)和0.8g肉豆蔻酸异丙酯(美国ACROS公司)混合均匀后，滴加200μl氯化钙水溶液(0.5M)，搅拌12h。
(2)第二微乳液的制备：取0.67g Pluronic F127(德国BASF公司)、2.53g Pluronic L61(德国BASF公司)和0.8g肉豆蔻酸异丙酯(美国ACROS公司)混合均匀后，滴加200μl磷酸二氢钾水溶液(0.25M)，搅拌12h。
(3)在25℃下，将第二微乳液加入到第一微乳液中，继续搅拌12h；以8000rpm，离心30min后，以无水乙醇洗涤2次，最后以1ml双蒸水分散即得纳米颗粒溶胶。
利用激光粒度仪对所得到纳米颗粒进行检测，结果与实施例1相似，纳米颗粒表面呈中性，带有0.10毫伏电荷。
实施例4
纳米颗粒的制备
(1)第一微乳液的制备：取0.18g CTAB(美国Amersco公司)、0.13g正戊醇、3.3g正己烷和45μl氯化钙水溶液(12.5mM)混合均匀，以350rpm的速度搅拌，至澄清透明。
(2)第二微乳液的制备：取0.18g CTAB(美国Amersco公司)、0.13g正戊醇、3.3g正己烷和45μl磷酸氢二氨水溶液(12.5mM)混合均匀，以350rpm的速度搅拌，至澄清透明。
(3)在25℃下，将第二微乳液加入到第一微乳液中，继续搅拌4h；之后8000rpm，离心30min，依此方法以无水乙醇洗涤2次，最后以1ml双蒸水分散即得纳米颗粒溶胶。
利用激光粒度仪对所得到纳米颗粒进行检测，结果见图2，纳米颗粒表面带有15毫伏的正电荷。
实施例5
纳米颗粒的制备
(1)第一微乳液的制备：取0.18g CTAB(美国Amersco公司)、0.22g正戊醇、4.25g肉豆蔻酸异丙酯和120μl氯化钙水溶液(0.1M)混合均匀，以350rpm的速度搅拌，至澄清透明；
(2)第二微乳液的制备：取0.18g CTAB(美国Amersco公司)、0.22g正戊醇、4.25g肉豆蔻酸异丙酯和120μl磷酸二氢钠水溶液(0.06M)混合均匀，以350rpm的速度搅拌，至澄清透明；
(3)在25℃下，将第二微乳液加入到第一微乳液中，继续搅拌4h；之后8000rpm，离心30min，依此方法以无水乙醇洗涤2次，最后以1ml双蒸水分散即得纳米颗粒溶胶。
利用激光粒度仪对所得到纳米颗粒进行检测，结果与实施例4相似，纳米颗粒带有18毫伏的正电荷。
实施例6
纳米颗粒的制备
(1)第一微乳液的制备：取0.18g CTAB(美国Amersco公司)、0.51g正己醇、3.3g正己烷和180μl氯化钙水溶液(1M)混合均匀，以350rpm的速度搅拌，至澄清透明；
(2)第二微乳液的制备：取0.18g CTAB(美国Amersco公司)、0.51g正己醇、3.3g正己烷和180μl磷酸氢二钠水溶液(0.5M)混合均匀，以350rpm的速度搅拌，至澄清透明；
(3)在25℃下，将第二微乳液加入到第一微乳液中，继续搅拌4h；之后8000rpm，离心30min，依此方法以无水乙醇洗涤2次，最后以1ml双蒸水分散即得纳米颗粒溶胶。
利用激光粒度仪对所得到纳米颗粒进行检测，结果与实施例4相似，纳米颗粒带有15毫伏的正电荷。
实施例7
纳米颗粒的制备
按照实施例1的方法制备纳米颗粒，不同的是，在第一微乳液和第二微乳液的制备过程中，45μl氯化钙水溶液由30μl氯化钙水溶液(12.5mM)和15μl卵清蛋白(OVA，Sigma公司)溶液(1μg/μl)的混合液代替，45μl磷酸氢二钠水溶液由30μl磷酸氢二钠水溶液(12.5mM)和15μl卵清蛋白(OVA，Sigma公司)溶液(1μg/μl)的混合液代替，得到包裹了卵清蛋白的纳米颗粒溶胶。
实施例8
纳米颗粒的制备
按照实施例4的方法制备1mL纳米颗粒溶胶后，将得到的纳米颗粒溶胶与1mL卵清蛋白(OVA，Sigma公司)溶液(1μg/μl)混合，于25℃下静置30min，即得表面吸附卵清蛋白的纳米颗粒溶胶。
实施例9
纳米颗粒的制备
按照实施例1的方法制备纳米颗粒，不同的是，在第一微乳液和第二微乳液的制备过程中，45μl氯化钙水溶液由30μl氯化钙水溶液(12.5mM)和15μl pEGFP(增强型绿色荧光蛋白编码基因，Biovector-08，Clontech公司)溶液(0.3μg/μl)的混合液代替，45μl磷酸氢二钠水溶液由30μl磷酸氢二钠水溶液(12.5mM)和15μl pEGFP(增强型绿色荧光蛋白编码基因，Biovector-08，Clontech公司)溶液(0.3μg/μl)的混合液代替，得到包裹了pEGFP质粒DNA的纳米颗粒溶胶。
实施例10
纳米颗粒的制备
按照实施例4的方法制备1mL纳米颗粒溶胶后，将得到的纳米颗粒溶胶与1mL pEGFP(增强型绿色荧光蛋白编码基因，Biovector-08，Clontech公司)溶液(0.3μg/μl)混合，于25℃下静置30min，即得表面吸附pEGFP质粒DNA的纳米颗粒溶胶。
实施例11
纳米颗粒的制备
取1ml实施例9制备的纳米颗粒溶胶，用MES缓冲溶液离心洗涤(8000rpm，30min/次)2次，每次用10ml MES缓冲溶液(pH 6.0)；然后用2mlMES缓冲溶液重悬纳米颗粒，加入30μg EDC(美国Sigma公司)，震荡1h后，用PBS缓冲溶液离心洗涤(8000rpm，30min/次)2次，每次用10ml PBS缓冲溶液(pH7.4)；然后用10ml PBS缓冲溶液重悬，加入30μgNH2-PEG-COOH(上海炎怡生物科技有限公司，重均分子量为1148)，震荡过夜。之后以8000rpm，离心30min，并用10ml PBS缓冲液重悬纳米颗粒，洗涤2次，重悬于100μl PBS缓冲液中，得到纳米颗粒溶胶。
实施例12
纳米颗粒的制备
取100μl实施例11制备的纳米颗粒PBS缓冲液，加入15μg核定位信号(NLS，PAAKRVKLD，西安联美生物科技有限公司合成)混合均匀，静置30min。之后加入4℃的30μl EDC的MES缓冲液(EDC的含量为0.5mg/ml)，并加入70μl MES缓冲液使反应体系的最终体积为200μl，4℃下反应2h。然后加入1ml PBS缓冲液，以8000rpm离心30min后，重悬于100μl PBS缓冲液中，得到纳米颗粒溶胶。
实施例13
纳米颗粒的制备
取100μl实施例12制备的纳米颗粒PBS缓冲液，加入15μg转铁蛋白(apo-Transferrin，Sigma公司)混合均匀，静置30min。之后加入4℃的30μlEDC的MES缓冲液(EDC的含量为0.5mg/ml)，并加入70μl MES缓冲液使反应体系的最终体积为200μl，4℃条件下反应2h。然后加入1ml PBS缓冲液，以8000rpm离心30min，并重悬于100μl PBS缓冲液中，得到纳米 颗粒溶胶。
实施例14
纳米颗粒的扫描电子显微镜(SEM)检测
利用SEM(日立公司，S-4800)对实施例1-13中获得的纳米颗粒进行观察。图1是实施例1的纳米颗粒的扫描电镜图。实施例2-13的纳米颗粒的SEM检测结果与实施例1的检测结果相似。实施例1-13的纳米颗粒的平均粒径见表1。
表1
| 实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| 平均粒径(nm) | 60 | 120 | 140 | 80 | 110 | 140 | 60 | 70 | 60 | 60 | 60 | 60 | 70 |
实施例15
纳米颗粒的动态光散射(DLS)检测
利用DLS(Malvern公司，Zetasizer Nano S90型号)对实施例1-13中获得的纳米颗粒进行检测。图2是实施例1的纳米颗粒的粒径分布图。由图2可知实施例1的纳米颗粒的粒径分布较窄，分散性好，无团聚现象。实施例2-13的纳米颗粒的DLS检测结果与实施例1的检测结果相似。
实施例16
纳米颗粒对HEK293细胞的转染试验
含纳米颗粒的血清培养基的配制：分别取30μL实施例9-13中制备的纳米颗粒溶胶，以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基稀释至300μL。
纳米颗粒转染HEK293细胞：以0.25％胰酶消化对数生长期的HEK293细胞，终止消化后，以1000rpm离心5min。用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制成单细胞悬液，并以5×104/ml浓度接种于24孔板中，每孔 500μl，之后置于培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。之后吸出原培养基，每孔加入400μl含血清的新鲜培养基。分设1个空白对照组、1个裸EGFP质粒对照组、5个纳米颗粒试验组和脂质体(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司)转染阳性对照组，每组设三个平行孔，空白对照组加入含血清DMEM培养基100μl/孔，裸EGFP质粒对照组加入含有pEGFP质粒(增强型绿色荧光蛋白编码基因，Biovector-08，Clontech公司)的含血清DMEM培养基(pEGFP质粒的浓度为8μg/mL)100μl/孔，5个纳米颗粒试验组加入上述配制的含纳米颗粒的血清培养基的配制100μl/孔，摇匀，置于培养箱(37℃、5％CO2)中培养12h，更换新鲜含血清的培养基，继续培养，于48h后利用荧光显微镜观察转染结果。
试验结果如图5所示，图5A为空白对照组、图5B为裸pEGFP质粒对照组、图5C为按照实施例9制备的包裹pEGFP质粒的纳米颗粒试验组、图5D为参照实施例11制备的纳米颗粒试验组、图5E为参照实施例10制备的表面吸附pEGFP质粒的纳米颗粒试验组、图5F为参照实施例12制备的纳米颗粒试验组、图5G为参照实施例13制备的纳米颗粒试验组、图5H为脂质体转染阳性对照组。由图5可知，裸EGFP质粒对照组很难转染HEK293细胞，而表面吸附或包裹pEGFP质粒的纳米颗粒以及进行系列修饰后的包裹pEGFP质粒的纳米颗粒试验组的细胞转染效果均明显提高，且纳米颗粒修饰后，细胞转染能力更强，与阳性对照组转染效率相当。
实施例17
纳米颗粒对细胞活力的影响
含纳米颗粒的含血清培养基的配制：用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基将实施例1-13中制备的纳米颗粒溶胶稀释至3μg/ml。
纳米颗粒对HEK293细胞活力的影响：首先以0.25％胰酶消化对数生长 期的HEK293细胞，终止消化后，以1000rpm离心5min。用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基制成单细胞悬液，并以5×104/ml浓度接种于96孔板中，每孔100μl，之后置于培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。分设空白对照组、阴性对照组、纳米颗粒试验组，每组3个平行孔。分别取10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基和上述配制的含纳米颗粒的含血清培养基，加至孔中，每孔100μl，置于培养箱(37℃、5％CO2)中培养12、24、48h，之后弃去培养基，以PBS缓冲液洗涤2次，最后加入含10％CCK-8的含血清培养基，每孔100μl，继续培养2h，之后利用酶标仪(检测波长为450nm)进行检测，确定纳米颗粒对HEK293细胞活力的影响情况。
图4是表示实施例1所制备的纳米颗粒的对HEK293细胞活力的影响的柱状图，与阴性对照组相比，纳米颗粒对HEK293的细胞活力没有影响，所制备的纳米颗粒安全性好。实施例2-13中所制备的纳米颗粒对HEK293细胞活力亦无明显影响，其结果与实施例1结果类似，显示出良好的安全性好。
实施例18
纳米颗粒对DNA包裹率的测定
首先，将实施例9制备的纳米颗粒以40000rpm离心30min，弃去上清后，将所得到的纳米颗粒分散于1ml pH为3.0的Na2HPO4/柠檬酸缓冲液(Na2HPO4和柠檬酸的浓度分别为0.04M和0.08M)中，30min后加入2ml冰乙醇(100％)，4℃下静置2h；之后16000g，4℃下离心30min，随后重悬于70％冰乙醇中，16000g，离心30min，最后将沉淀溶解于1ml去离子水中。取200μl样品于260nm检测其OD值，计算pEGFP质粒DNA的浓度，并确定1ml样品中pEGFP质粒DNA的量，进而根据公式：包裹率(％)＝(DNA的实际数量/DNA的原始数量)×100％，确定纳米颗粒对DNA的包裹率。试验结果显示，纳米颗粒对pEGFP质粒DNA的包裹率为99％。
Claims (15)
1.一种纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括将第一微乳液与第二微乳液混合，得到纳米颗粒a；所述第一微乳液含有表面活性剂、有机溶剂和第一反应物的水溶液，所述第二微乳液含有表面活性剂、有机溶剂和第二反应物的水溶液；所述第一反应物和第二反应物接触后能够形成沉淀；所述第一微乳液中的表面活性剂和所述第二微乳液中的表面活性剂相同，为油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂的混合物，或者为十六烷基三甲基溴化铵。
2.根据权利要求1所述的制备方法，所述第一微乳液中的第一反应物与所述第二微乳液中的第二反应物的摩尔比为1-2∶1。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在第一微乳液中，相对于1重量份的表面活性剂，所述有机溶剂的含量为0.1-15重量份，所述第一反应物的水溶液的含量为0.008-2.3重量份，所述第一反应物的水溶液的浓度为1mM-1M；
在第二微乳液中，相对于1重量份的表面活性剂，所述有机溶剂的含量为0.1-15重量份，所述第二反应物的水溶液的含量为0.008-2.3重量份，所述第二反应物的水溶液的浓度为0.5mM-0.5M。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，在第一微乳液中，相对于1重量份的表面活性剂，所述有机溶剂的含量为0.11-0.25重量份，所述第一反应物的水溶液的含量为0.008-1重量份，所述第一反应物的水溶液的浓度为12.5mM-0.5M；
在第二微乳液中，相对于1重量份的表面活性剂，所述有机溶剂的含量为0.11-0.25重量份，所述第二反应物的水溶液的含量为0.008-1重量份，所述第二反应物的水溶液的浓度为6.25mM-0.25M。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂的混合物中，油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂和水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂的重量比为0.1-10∶1；
所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵时，第一微乳液和第二微乳液中还含有助表面活性剂，且相对于1重量份的表面活性剂，所述助表面活性剂为0.72-5.6重量份。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述油溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂中聚氧乙烯和聚氧丙烯的重量比为0.15-0.56∶1；所述水溶性聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂中氧化乙烯和氧化丙烯的重量比为0.56-5.26∶1；
所述助表面活性剂为碳原子数为2-6的醇。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述第一反应物为氯化钙；所述第二反应物为选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二氨、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述有机溶剂为烷烃化合物或酯化合物，所述烷烃化合物为碳原子数为6-12的烷烃化合物；所述酯化合物为选自肉豆蔻酸肉豆蔻酯、棕榈酸异辛酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、乙二醇双硬脂酸酯、乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、十六酸十六酯和十八酸十八酯中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在第一微乳液和第二微乳液中，还分别含有DNA、蛋白质抗原或药物，且在第一微乳液中，相对于1重量份的所述第一反应物，所述DNA、蛋白质抗原或药物的用量为0.0003-0.6重量份；在第二微乳液中，相对于1重量份的所述第二反应物，所述DNA、蛋白质抗原或药物的用量为0.0004-0.9重量份。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述方法还包括，在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将所述纳米颗粒a与碳二亚胺盐酸盐进行混合后离心，在PBS缓冲溶液中，将离心后的沉淀与改性聚乙二醇进行混合，得到纳米颗粒c，且相对于1重量份的所述纳米颗粒a，所述碳二亚胺盐酸盐的用量为0.1-0.5重量份，所述改性聚乙二醇的用量为0.1-0.5重量份；所述改性聚乙二醇的骨架为聚乙二醇骨架、两个端基分别为氨基和羧基或两个端基均为氨基，所述改性聚乙二醇的重均分子量为370-1150。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述方法还包括，在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将所述纳米颗粒c与核定位信号、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体中的任意一种或多种一次或分多次接触，每次接触的时间为2-12h，且相对于1重量份的纳米颗粒c，所述核定位信号的用量为0-1重量份，所述促进入胞功能分子的用量为0-1重量份，所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的用量为0-1重量份，核定位信号、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的总用量为0.1-3重量份。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其中，该方法还包括，在溶剂存在下，将所得到的纳米颗粒a与DNA、蛋白质抗原或药物进行接触，得到纳米颗粒b，且相对于1重量份的所述第一反应物，所述DNA、蛋白质抗原或药物的用量为0.0003-0.6重量份。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述方法还包括，在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将所述纳米颗粒b与碳二亚胺盐酸盐进行混合后离心，在PBS缓冲溶液中，将离心后的沉淀与改性聚乙二醇进行混合，得到纳米颗粒d，且相对于1重量份的所述纳米颗粒b，所述碳二亚胺盐酸盐的用量为0.1-0.5重量份，所述改性聚乙二醇的用量为0.1-0.5重量份；所述改性聚乙二醇的骨架为聚乙二醇骨架、两个端基分别为氨基和羧基或两个端基均为氨基，所述改性聚乙二醇的重均分子量为370-1150。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述方法还包括，在吗啉乙磺酸缓冲溶液中，将纳米颗粒d与核定位信号、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体中的任意一种或多种一次或分多次接触，每次接触的时间为2-12h，且相对于1重量份的纳米颗粒d，所述核定位信号的用量为0-1重量份，所述促进入胞功能分子的用量为0-1重量份，所述靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的用量为0-1重量份，核定位信号、促进入胞功能分子和靶向抗原呈递细胞的特异性抗体的总用量为0.1-3重量份。
15.一种纳米颗粒，其特征在于，该纳米颗粒是根据权利要求1-14中的任意一项所述的制备方法制备的。
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