CN108841385B - 一种血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新材料技术领域,特别是指一种血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的制备方法及应用。其制备方法是在实现铂离子前体水溶液和胺类聚合物配合通过胺基进行充分络合,经加入还原剂高温密闭搅拌,制备出荧光铂纳米团簇粗产物,超速离心及透析后,最终得到水溶性荧光铂纳米团簇。制备的超小尺寸、荧光铂纳米团簇能应用于血液系统悬浮细胞的光学成像。本发明提供一种操作简单,环境友好,具有优异荧光性能的铂纳米团簇的制备方法。不仅可以标定贴壁细胞体系,本发明将铂纳米团簇作为荧光标记物首次扩展到血液系统悬浮细胞的光学成像中,对于实现血液系统疾病的早期识别、诊断具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于新材料技术领域,特别是指一种血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的制备方法及应用。
背景技术
近几十年来,血液系统疾病如再生障碍性贫血、骨髓增生性疾病等,发病率逐年增加,带来的危害日益加剧。例如白血病,除骨髓移植外,尚未出现特别有效的治疗方法。因此,研究造血系统肿瘤疾病的早期鉴别、诊断具有重大意义。贵金属纳米团簇,由于尺度接近电子的费米波长,量子限域效应导致原本连续的电子能态分裂为离散的电子能态,呈现出与块体材料和纳米颗粒(大于2 nm)截然不同的类分子尺寸依赖荧光性能。相较于半导体量子点和传统小分子有机荧光染料,贵金属纳米团簇具有超小尺寸、高稳定性、水溶性好、低毒性等优点,可替代光稳定性差的传统荧光标记物,作为荧光探针应用于血液系统细胞的标定,实现早期识别、诊断。
荧光铂纳米团簇,相比金、银纳米团簇,具有高荧光量子效率以及抑制癌细胞等优点,目前已成功的应用于贴壁细胞,如肝细胞癌和人乳腺癌细胞的荧光成像中。但对于悬浮细胞体系,如血液系统细胞的标定,鲜有研究报道。
发明内容
本发明提出一种血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的制备方法及应用,解决了现有技术中悬浮细胞标定难,检测难的技术问题,本发明详细公开了一种操作简单,环境友好,具有优异荧光性能的铂纳米团簇的制备方法,并扩展荧光纳米铂团簇作为标记物的生物成像应用范围,不仅可以标定贴壁细胞,而且可以实现血液系统悬浮细胞的光学成像,实现血液系统疾病的早期识别、诊断。
本发明的技术方案是这样实现的:
将离子前体水溶液和胺类聚合物配合通过胺基进行充分络合,加入还原剂后加热搅拌一段时间,制备出荧光铂纳米团簇粗产物,超速离心及透析后,最终得到水溶性荧光铂纳米团簇。
本发明所述的一种荧光铂纳米团簇的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)铂离子前体和胺类聚合物络合,制备铂离子和胺类聚合物的络合体。在浓度为0.1 - 50 mmol/L(优选为0.2 - 20 mmol/L,进一步优选为0.5 - 10 mmol/L)的H2PtCl6溶液中,加入浓度为0.1 - 10 mmol/L(优选为0.5 - 5 mmol/L,进一步优选为1 - 3 mmol/L)的胺类聚合物配体(可以是聚乙烯基亚胺PEI或羟基封端的聚酰胺-胺树枝状大分子PAMAM-OH),在-4 ℃ - 60 ℃(优选为20 ℃ - 40 ℃,进一步优选为25 ℃ - 37 ℃)充分混合30min - 24 h(优选为1 h - 12 h,进一步优选为1.5 h - 2 h)。
(2)加入还原剂(可以是柠檬酸钠、抗坏血酸等),一步法还原铂离子为聚合物稳定的铂纳米团簇。还原剂与铂离子的摩尔比为1:1 - 50:1,升温加热至50 - 100 ℃,密闭反应2 h - 7 d(优选为2 d - 6 d,进一步优选为4 d - 5 d),超速离心后透析1 d - 2 d,最终得到产物即为水溶性荧光铂纳米团簇。
合成的荧光铂纳米团簇,粒径尺寸小于2 nm且均匀,具有优异荧光发射性能。将水溶性荧光铂纳米团簇加入含有悬浮细胞(可以是血液系统外周血单个核细胞PBMC、人慢性髓系白血病细胞K562、人外周血B细胞BV173)的培养液中共同培养,铂纳米团簇通过细胞膜,并在共聚焦显微镜下呈现荧光,完成血液系统悬浮细胞的荧光成像。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明制备的铂纳米团簇尺寸较小(小于2 nm)、粒径均匀、具有优异的荧光性能;胺类聚合物配体含有大量伯、仲、叔三级胺基,对团簇具有较高的稳定性,同时赋予团簇良好的水溶性;制备方法简单、容易操作、重现性好、可以实现大规模生产。制备的铂纳米团簇与量子点和有机染料标记物相比,具有无毒性和较好的生物相容性;与金、银纳米团簇和荧光蛋白相比,具有更高的量子荧光产率、较好的稳定性以及特殊的生物效应。
(2)大部分的贵金属团簇荧光标记物的生物标定研究集中在贴壁细胞体系,而本发明制备的铂纳米团簇对悬浮细胞体系,如血液癌细胞,同样具有光学成像能力,扩展了其应用领域,可替代光稳定性差的传统荧光标记物,作为荧光纳米探针应用于血液系统细胞的标定,对于实现血液系统疾病(如白血病等)的早期识别、诊断具有重要意义。
附图说明
图1所示为本发明实施例中荧光铂纳米团簇的结构示意图;其中 1-为铂离子,2-为铂纳米团簇,3-为胺类聚合物配体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
荧光铂纳米团簇的制备方法:在3.0 mL 水中加入H2PtCl6和聚乙烯基亚胺PEI,最终H2PtCl6和PEI浓度分别为0.1 mmol/L、2 mmol/L。25 ℃下充分混合30 min后,加入0.1mmol L-抗环血酸,将溶液加热至90 ℃,反应2 h 后自然冷却,得到淡黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析1 d后得到最终的荧光铂纳米团簇,团簇在紫外光照射下发射淡蓝色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.001mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562癌细胞成像中显示淡蓝色荧光。
实施例2
荧光铂纳米团簇的制备方法:在3.0 mL 水中加入H2PtCl6和聚乙烯基亚胺PEI,最终H2PtCl6和PEI浓度分别为0.6 mmol/L、2 mmol/L。-4 ℃下充分混合24 h后,加入0.1 mmolL-抗环血酸,将溶液加热至90 ℃,反应4 d 后自然冷却,得到黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析2 d后得到最终的荧光铂纳米团簇,团簇在紫外光照射下发射黄色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.001mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562细胞成像中显示黄色荧光。
实施例3
荧光铂纳米团簇的制备方法:在3.0 mL 水中加入H2PtCl6和聚乙烯基亚胺PEI,最终H2PtCl6和PEI浓度分别为0.6 mmol/L、2 mmol/L。60 ℃下充分混合1.5 h后,加入0.1mmol L-抗环血酸,将溶液加热至90 ℃,反应4 d后自然冷却,得到黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析2 d后得到最终的荧光铂纳米团簇,团簇在紫外光照射下发射黄色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有BV173细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.005 mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 % ,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在BV173细胞成像中显示黄色荧光。
实施例4
荧光铂纳米团簇的制备方法:在3.0 mL 水中加入H2PtCl6和聚乙烯基亚胺PEI,最终H2PtCl6和PEI浓度分别为0.6 mmol/L、2 mmol/L。25 ℃下充分混合1.5 h后,加入0.1mmol L-抗环血酸,将溶液加热至90 ℃,反应 7 d 后自然冷却,得到黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析2 d后得到最终的荧光铂纳米团簇,团簇在紫外光照射下发射黄色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.001mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562细胞成像中显示黄色荧光。
实施例5
荧光铂纳米团簇的制备方法:在3.0 mL 水中加入H2PtCl6和聚乙烯基亚胺PEI,最终H2PtCl6和PEI浓度分别为0.6 mmol/L、10 mmol/L。25 ℃下充分混合1.5 h后,加入0.1mmol L-抗环血酸,将溶液加热至90 ℃,反应4 d后自然冷却,得到深黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析2 d后得到最终的荧光铂纳米团簇,团簇在紫外光照射下发射淡黄色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.001mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562细胞成像中显示淡黄色荧光。
实施例6
荧光铂纳米团簇的制备方法:在3.0 mL 水中加入H2PtCl6和聚乙烯基亚胺PEI,最终H2PtCl6和PEI浓度分别为10 mmol/L、1 mmol/L。25 ℃下充分混合1.5 h后,加入1.5 mmolL-抗环血酸,将溶液加热至50 ℃,反应7 d 后自然冷却,得到淡黄色接近透明溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析2 d后得到最终的荧光铂纳米团簇,团簇在紫外光照射下发射淡蓝色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.005mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562细胞成像中显示淡蓝色荧光。
实施例7
荧光铂纳米团簇的制备方法:在3.0 mL 水中加入H2PtCl6和聚乙烯基亚胺PEI,最终H2PtCl6和PEI浓度分别为0.6 mmol/L、2 mmol/L。60 ℃下充分混合1.5 h后,加入0.09mmol L-抗环血酸,将溶液加热至90 ℃,反应4 d 后自然冷却,得到深黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析2 d后得到最终的荧光铂纳米团簇,团簇在紫外光照射下发射淡黄荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.001mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562细胞成像中显示淡黄色荧光。
实施例8
荧光铂纳米团簇的制备方法:在10 mL 水中加入H2PtCl6、羟基封端的聚酰胺-胺树枝状大分子PAMAM-OH,最终H2PtCl6和PAMAM-OH浓度分别为10 mmol/L、3 mmol/L。在- 4 ℃下搅拌,充分混合24 h后,加入0.5 mmol 柠檬酸钠,将溶液加热至100 ℃,反应3 d 后自然冷却,得到淡黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析后得到最终的荧光铂纳米团簇,紫外光照射下发射绿色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.001mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562细胞成像中显示绿色荧光。
实施例9
荧光铂纳米团簇的制备方法:在10 mL 水中加入H2PtCl6、羟基封端的聚酰胺-胺树枝状大分子PAMAM-OH,最终H2PtCl6和PAMAM-OH浓度分别为50 mmol/L、10 mmol/L。在4 ℃下搅拌,充分混合24 h后,加入12..5 mmol 柠檬酸钠,将溶液加热至100 ℃,反应3 d 后自然冷却,得到淡黄色溶液。将上述粗产物超速离心、并用透析袋进行透析后得到最终的荧光铂纳米团簇,紫外光照射下发射淡绿色荧光。
血液系统悬浮细胞的荧光成像:取上步骤中最后得到的荧光铂纳米团簇,加入到含有K562细胞的无菌RPMI-1640培养液(含10 %血清)中,最终荧光铂纳米团簇浓度为0.001mmol/L。在37 ℃无菌环境纯净空气(5 % CO2)的条件下,共培养4 h后,用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。PBS清洗细胞后,滴加甘油 (50 %,v/v)后,进行共聚焦显微镜细胞成像检测,荧光铂纳米团簇对应在K562细胞成像中显示淡绿色荧光。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的应用,其特征在于,步骤为:将浓度为0.001 - 0.005 mmol/L荧光铂纳米团簇加入细胞密度为2× 105/mL - 5×105/mL的血液系统悬浮细胞培养液中,于37 ℃无菌环境中含有5 % CO2的纯净空气的条件下,共培养4 h后得混合培养液,用4 %wt的多聚甲醛固定混合培养液中的悬浮细胞,然后用PBS清洗悬浮细胞后,滴加体积比为50%的甘油水溶液,最后进行共聚焦显微镜下检测荧光,完成血液系统悬浮细胞的光学成像;
其中,荧光铂纳米团簇的制备方法包括以下步骤:
(1)向浓度为0.1 - 50 mmol/L的H2PtCl6溶液中,加入浓度为0.1 -10 mmol/L的胺类聚合物配体,在-4 - 60 ℃充分混合30 min - 24 h,制备得铂离子和胺类聚合物配体的络合体系溶液;
(2)向步骤(1)得到的络合体系溶液中加入还原剂,通过一步法还原铂离子生成聚合物稳定的铂纳米团簇,加热至50 - 100 ℃,密闭搅拌反应2 h - 7 d,超速离心后透析1 d -2 d,最终得到产物为荧光铂纳米团簇。
2.如权利要求1所述的血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的应用,其特征在于:所述步骤(1)中胺类聚合物配体为聚乙烯基亚胺PEI或羟基封端的聚酰胺-胺树枝状大分子。
3.如权利要求1所述的血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的应用,其特征在于:所述步骤(1)中铂离子和胺类聚合物配体的摩尔比为(0.1- 10):1。
4.如权利要求1所述的血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的应用,其特征在于:所述步骤(2)中还原剂为柠檬酸钠或抗坏血酸。
5.如权利要求1所述的血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的应用,其特征在于:所述步骤(2)中还原剂与络合体系溶液中的铂离子的摩尔比为(1-50):1。
6.如权利要求1所述的血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的应用,其特征在于:所述步骤(2)中一步法还原的反应时间为2 h - 7 d。
7.如权利要求1所述的血液系统悬浮细胞光学成像的荧光铂纳米团簇的应用,其特征在于:所述血液系统悬浮细胞为血液系统外周血单个核细胞PBMC、人慢性髓系白血病细胞K562或人外周血B细胞BV173。
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Xin Huang等.Formation of fluorescent platinum nanoclusters using hyper-branched polyethylenimine and their conjugation to antibodies for bio-imaging.《RSC Advances》.2016,第6卷第9709-9716页. * |
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