CN114486782A

CN114486782A - 一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂及其检测方法

Info

Publication number: CN114486782A
Application number: CN202210128561.4A
Authority: CN
Inventors: 王光丽; 陈彦如; 赵玲玲; 董玉明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-02-11
Also published as: CN114486782B

Abstract

本发明公开了一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂及其检测方法，该方法利用纳米酶的催化反应与核酸的催化发夹组装反应相联合实现信号的触发与放大。本发明开拓了基于纳米酶的均相生物分析在CAP检测中的应用。与现有方法相比，本方法具有成本低、操作简便、特异性强、灵敏度高等优势，有望成为食品安全、化妆品监管领域中针对大量样品快速筛查CAP的方法之一。

Description

一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂及其检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测领域，尤其是涉及一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂及其检测方法。

背景技术

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种广谱抗生素，是世界上首种完全由合成方法大量制造的抗生素，对革兰氏阳性、阴性菌均有抑制作用，是畜禽疾病防治的重要常用药。并且，由于其对皮肤炎症具有一定疗效，也曾被违法添加到各类化妆品中，如祛痘类产品。但是，CAP具有严重的毒副作用，其在食品中的残留或经皮肤长期吸收后会引起再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症等恶性疾病，严重威胁人类健康。欧美等发达国家已禁止使用CAP，我国农业部第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》以及最新2015年版《化妆品卫生规范》将CAP列为禁用物质，不得检出。

CAP现有的测定方法主要有微生物法、色谱分析法、免疫分析法等。微生物法虽然经济、操作简便，但其灵敏度和特异性往往受到其它微生物抑制剂的干扰。色谱法虽然灵敏度高、结果较为准确，但使用仪器较为昂贵、前处理及操作步骤较为繁琐，不适于大量样本的筛查。免疫分析法快速、灵敏、特异性好，能满足大量样品的快速筛查；但是，抗体的制备过程耗时、繁琐、成本高。因此，发展简便、快速、低成本的CAP分析方法仍然很有必要。

纳米酶作为新型的具有天然酶活性的一类材料，具有同天然酶相类似的高效催化活性，却比天然酶具有更好的稳定性、价廉易得、活性容易调控等优点[K.L.Fan,C.Q.Cao,Y.X.Pan,D.Lu,D.L.Yang,J.Feng,L.N.Song,M.M.Liang,X.Y.Yan,Magnetoferritinnanoparticles for targeting and visualizing tumour tissues,Nat.Nanotechnol.7(2012)459-464；Y.Y.Huang,J.S.Ren,X.G.Qu,Nanozymes:classification,catalyticmechanisms,activity regulation,and applications,Chem.Rev.11(2019)4357-4412.]。因此，利用纳米酶的信号放大作用以进行分析检测的研究也得到了越来越多的关注。例如，利用纳米酶的信号放大作用结合光电化学分析[Zhu,X.,Gao,L.,Tang,L.,Peng,B.,Huang,H.W.,Wang,J.J.,Yu,J.F.,Ouyang,X.L.,Tan,J.S.Biosens.Bioelectron.,2019,146,111756]、化学发光分析[Li,S.H.,Ma,X.H.,Pang,C.H.,Wang,M.Y.,Yin,G.H.,Xu,Z.,Li,J.P.,Luo,J.H.2021,176,112944]以及比色法[王颖，李风亭，张冰如，徐金金。专利号：CN201710263737.6]检测CAP的研究已有报道。这其中，比色法是一种非常简便、受欢迎的分析方法，其通过肉眼观察来测定物质而无需使用特殊的仪器。但是，目前所报道的基于金属有机骨架化合物纳米酶以实现CAP检测的比色方法是信号减弱模式，很容易产生虚假信号。并且，该方法需要把生物分子标记到纳米材料表面，导致测定成本较高(将生物分子进行标记)、步骤较为复杂。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂及其检测方法。本发明是在Cu₃BiS₃纳米棒材料表面原位形成的亚铁氰化铋(BiHCF)纳米酶，并建立了基于该纳米酶的比色检测CAP的方法。该纳米酶活性较高且容易制备，所建立的CAP分析方法无需生物分子的标记和固定化，具有省时、成本低、灵敏度高、选择性好等优势。

本发明的技术方案如下：

一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂，包含有序列为SEQ ID NO.1＝5′-ACTTCAGTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G-3′的CAP适配体；序列为SEQ IDNO.2＝5′-CTACCA CCG ACT CGC CGA CCG TGG GCA CCT GCT AAC GGT CGG CGAG-3′的发夹DNA HP1；序列为SEQ ID NO.3＝5′-PO₄-GAC CGT TAG CAG GTG CCC ACG GTC GGC GAG TCGCGT GGG CAC CTG-3′的发夹DNA HP2。

一种使用所述纳米酶检测试剂检测氯霉素的方法，包括以下步骤：

(1)Cu₃BiS₃纳米材料的制备：按照常规方法制备Cu₃BiS₃纳米粉末材料；

(2)生物反应：将不同浓度的氯霉素溶液和不同浓度的SEQ ID NO.1的CAP适配体对应混合加入到Tris-HAc缓冲液中孵育；随后将序列为SEQ ID NO.2的发夹DNAHP1和序列为SEQ ID NO.3的发夹DNAHP2依次加入上述缓冲液中进行催化发夹组装反应；最后加入λ核酸外切酶和λ核酸外切酶反应缓冲液消化组装反应的产物；

(3)吸光度的测定：将步骤(1)获得的Cu₃BiS₃纳米粉末材料制备成悬浮液，加入到步骤(2)最后所得的溶液中，加入K₄[Fe(CN)₆]溶液、HAc-NaAc缓冲液、TMB和H₂O₂，反应后测定吸光度；

(4)线性模型构建：通过步骤(3)所得的不同已知氯霉素浓度的吸光度A，和氯霉素浓度为0的样品所得的吸光度值A₀，计算得到不同浓度相应的吸光度差值A-A₀；然后利用不同已知氯霉素浓度的对数值和相应吸光度的差值构建线性模型；

(5)利用上述线性模型检测未知氯霉素浓度的溶液。

进一步的，步骤(1)中，Cu₃BiS₃纳米材料的制备步骤为：

将质量比为4:5-5:1之间的可溶性铋盐和可溶性铜盐分别溶解在乙二醇中并混合均匀；所述可溶性铋盐为硝酸铋或硫酸铋；所述可溶性铜盐为硝酸铜或硫酸铜。

然后将溶于无水乙醇中的与上述盐的总质量比为1:10-1:1的硫脲加入到上述混合液中，搅拌20-50分钟；

随后，将得到的混合溶液转移至高压反应釜中，在120-180℃条件下反应5-12小时；冷却至室温后，将所得样品用乙醇和去离子水洗涤数次，最终样品在50-70℃条件下干燥过夜得Cu₃BiS₃纳米材料的粉末样品。

进一步的，步骤(2)中，所述CAP适配体与发夹DNAHP1和发夹DNA HP2的摩尔比为1:20:20。

进一步的，步骤(2)中，所述孵育的条件为35-40℃，0.5-2h；所述消化组装反应的条件为35-40℃，0.5-2h。

进一步的，步骤(3)中，Cu₃BiS₃纳米粉末材料制备成悬浮液时浓度为0.5-1.5mg/mL。

进一步的，Cu₃BiS₃:K₄[Fe(CN)₆]:TMB:H₂O₂的质量之比为：1:0.2-0.3:7-9:1-1.5。进一步的，步骤(3)中，所述吸光度在640-660nm处测定。

一种可视化检测氯霉素的试剂盒，包括所述的纳米酶检测试剂。

进一步的，所述的试剂盒还含有Cu₃BiS₃纳米粉末材料、氯霉素标准品溶液、λ核酸外切酶、K₄[Fe(CN)₆]溶液、HAc-NaAc缓冲液、TMB和H₂O₂。

本发明有益的技术效果在于：

本发明提供了一种可视化检测氯霉素的纳米酶以及使用该纳米酶的一种快速、高灵敏检测氯霉素CAP的比色法，该方法利用纳米酶的催化反应与核酸的催化发夹组装反应相联合实现信号的触发与放大，测试所使用的生物反应在均相溶液中进行且生物分子无需标记和固定，测试成本低、灵敏度高(检测限低至0.033pM)、选择性好，且线性范围宽(0.1pM～100nM)、易实现大量样品的快速测定，在食品安全、化妆品监管等应用中具有一定的潜力。

附图说明

图1为纳米酶为基础的检测CAP的反应原理示意图；

图2为实施例1中制备得到的Cu₃BiS₃纳米材料的X射线衍射图；

图3是实施例1制备的Cu₃BiS₃纳米材料的扫描电镜图；

图4是实施例1的得到的吸光度响应(ΔA＝A-A₀)与对不同浓度的CAP的对数的线性关系图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场渠道购获得的常规试剂产品。

本发明的检测原理如下：如附图1所示，本发明利用所合成的Cu₃BiS₃纳米棒与溶液中的亚铁氰根离子反应，在其表面原位形成亚铁氰化铋(BiHCF)，具备高效的模拟过氧化物酶活性以催化特征底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的氧化并产生蓝色氧化产物。测定体系中，当不存在目标物CAP时，CAP适配体将以游离形式存在，引发催化发夹组装反应并在体系中产生双链DNA继而被λ核酸外切酶(λexo)剪切释放出脱氧(核糖)核苷单磷酸(dNMP)。所释放的dNMP优先结合到Cu₃BiS₃纳米棒表面后，阻碍了亚铁氰根离子在Cu₃BiS₃表面的结合以及BiHCF纳米酶的产生，从而体系不能氧化TMB，产生较低的光吸收信号，测试溶液的颜色较浅。当存在目标物CAP时，CAP与其适配体结合，导致该适配体不能引发催化发夹组装反应并在λexo作用下产生dNMP。因此，溶液中的亚铁氰根离子能够结合到Cu₃BiS₃纳米棒表面形成BiHCF纳米酶，催化TMB的氧化产生蓝色氧化产物，获得较高的光吸收信号，测试溶液的蓝色加深。上述反应中产生的吸光度变化差值与目标物CAP浓度相关，进而达到了检测目的。

实施例1

一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂检测氯霉素的方法，包括以下步骤：

(1)Cu₃BiS₃纳米材料的制备：称取0.10g硝酸铋和0.05g硝酸铜分别溶于10mL乙二醇中混合均匀，然后0.05g硫脲溶于10mL无水乙醇并加入到上述混合液中，并剧烈搅拌25分钟；随后，将得到的混合溶液转移至高压反应釜中，在180℃条件下反应12小时；冷却至室温后，将所得样品用乙醇和去离子水洗涤数次，最终样品在60℃条件下干燥过夜得到Cu₃BiS₃纳米材料的粉末样品；其X射线衍射图如附图2所示，其扫描电镜图如附图3所示；

由图2可知，所合成的样品为纯的Cu₃BiS₃，与标准卡(JCPDS no.71-2115)的衍射峰一致。由图3可知，所合成的Cu₃BiS₃纳米材料为纳米棒结构，棒的直径在20-100nm，长度约为1.0μm。

(2)生物反应：5.0μL不同浓度的氯霉素(CAP)溶液和5.0μL浓度为1.0μM SEQ IDNO.1的CAP适配体混合加入到13μL Tris-HAc缓冲液(5.0mM，含10mM Mg(Ac)₂，pH 7.5)中，在37℃孵育反应1小时；然后，将10μL浓度为10μM序列为SEQ ID NO.2的发夹DNA HP1和10μL浓度为10μM序列为SEQ ID NO.3的发夹DNA HP2依次加入到上述溶液中，在37℃下孵育1小时以完成催化发夹组装(CHA)反应；之后，加入2.0μL 5.0U/Lλexo和5.0μL0.1×λexo反应缓冲液(0.67mM甘氨酸-KOH,0.25mM MgCl₂,5μg/mL BSA,pH 9.4,25℃)，在37℃下反应1小时，消化CHA反应的产物；

(3)吸光度的测定：将1.5μL 1.0mg/mL Cu₃BiS₃悬浮液加入到步骤(2)所得的混合溶液中，反应5分钟。之后，依次加入10μL 0.1mM K₄[Fe(CN)₆]溶液,10μL HAc-NaAc缓冲液(0.2M,pH 4.0),10μL 5.0mM TMB和10μL 5.0mM H₂O₂。并在40℃下反应20分钟后在652nm处测定吸光度；

结果如图4所示，该方法对CAP具有灵敏的响应，线性方程为ΔA＝0.1064×log[C_CAP]+0.5502，线性相关系数R²为0.994，线性范围为0.1pM到100nM，检测限为0.033pM。

实施例2

(1)Cu₃BiS₃纳米材料的制备：称取0.09g硫酸铋和0.06g硫酸铜分别溶于10mL乙二醇中，然后0.06g硫脲溶于10mL无水乙醇并加入到上述混合液中，并剧烈搅拌25分钟；随后，将得到的混合溶液转移至高压反应釜中，在180℃条件下反应12小时。冷却至室温后，将所得样品用乙醇和去离子水洗涤数次，最终样品在60℃条件下干燥过夜得到Cu₃BiS₃纳米材料的粉末样品；

(2)生物反应：5.0μL不同浓度的氯霉素(CAP)溶液和5.0μL浓度为1.0μM的SEQ IDNO.1CAP适配体混合加入到13μL Tris-HAc缓冲液(5.0mM，含10mM Mg(Ac)₂，pH 7.5)中，在37℃孵育反应1小时；然后，将10μL浓度为10μM的序列为SEQ ID NO.2的发夹DNA HP1和10μL浓度为10μM序列为SEQ ID NO.3的发夹DNA HP2依次加入到上述溶液中，在37℃下孵育1小时以完成催化发夹组装(CHA)反应。之后，加入2.0μL 5.0U/L λexo和5.0μL 0.1×λexo反应缓冲液(0.67mM甘氨酸-KOH,0.25mM MgCl₂,5μg/mL BSA,pH 9.4,25℃)，在37℃下反应1小时，消化CHA反应的产物；

(3)吸光度的测定：将1.5μL 1.0mg/mL Cu₃BiS₃悬浮液加入到步骤(2)所得的混合溶液中，反应5分钟。之后，依次加入10μL 0.1mM K₄[Fe(CN)₆]溶液,10μL HAc-NaAc缓冲液(0.2M,pH 4.0),10μL 5.0mM TMB和10μL 5.0mM H₂O₂。并在40℃下反应20分钟后在652nm处测定吸光度。

综合以上实施例可以看出，当存在目标物CAP时，不会产生催化发夹组装反应以产生dNMP，从而保证了溶液中的亚铁氰根离子可以结合到Cu₃BiS₃纳米棒表面，形成纳米酶并触发底物的显色反应；反之，会发生催化发夹组装反应并在λexo作用下产生dNMP，由于dNMP会优先结合到Cu₃BiS₃纳米棒表面，从而阻碍了亚铁氰根离子与Cu₃BiS₃纳米棒的结合以及纳米酶的产生，抑制了显色反应的发生。该方法利用纳米酶的催化反应与核酸的催化发夹组装反应相联合实现信号的触发与放大，测试所使用的生物反应在均相溶液中进行且生物分子无需标记和固定，测试成本低、灵敏度高(检测限低至0.033pM)、选择性好，且线性范围宽(0.1pM～100nM)、易实现大量样品的快速测定，在食品安全、化妆品监管等应用中具有一定的潜力。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂及其检测方法

<130> 2022

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag 40

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

ctaccaccga ctcgccgacc gtgggcacct gctaacggtc ggcgag 46

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

gaccgttagc aggtgcccac ggtcggcgag tcgcgtgggc acctg 45

Claims

1.一种可视化检测氯霉素的纳米酶检测试剂，其特征在于，包含有序列为SEQ ID NO.1的CAP适配体；序列为SEQ ID NO.2的发夹DNA HP1；序列为SEQ ID NO.3的发夹DNA HP2。

2.一种使用权利要求1所述纳米酶检测试剂检测氯霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)生物反应：将不同浓度的氯霉素溶液和不同浓度的SEQ ID NO.1的CAP适配体对应混合加入到Tris-HAc缓冲液中孵育；随后将序列为SEQ ID NO.2的发夹DNA HP1和序列为SEQ ID NO.3的发夹DNAHP2依次加入上述缓冲液中进行催化发夹组装反应；最后加入λ核酸外切酶和λ核酸外切酶反应缓冲液消化组装反应的产物；

(5)利用上述线性模型检测未知氯霉素浓度的溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，Cu₃BiS₃纳米材料的制备步骤为：

将质量比为4:5-5:1之间的可溶性铋盐和可溶性铜盐分别溶解在乙二醇中并混合均匀；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述可溶性铋盐为硝酸铋或硫酸铋；所述可溶性铜盐为硝酸铜或硫酸铜。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CAP适配体与发夹DNA HP1和发夹DNA HP2的摩尔比为1:20:20。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述孵育的条件为35-40℃，0.5-2h；所述消化组装反应的条件为35-40℃，0.5-2h。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，Cu₃BiS₃纳米粉末材料制备成悬浮液时浓度为0.5-1.5mg/mL。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述吸光度在640-660nm处测定。

9.一种可视化检测氯霉素的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的纳米酶检测试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还含有Cu₃BiS₃纳米粉末材料、氯霉素标准品溶液、λ核酸外切酶、K₄[Fe(CN)₆]溶液、HAc-NaAc缓冲液、TMB和H₂O₂。