CN107037109A - 磁分离‑信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁分离‑信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法。采用氯霉素适配体修饰磁性纳米粒子用于结合样品中氯霉素,通过磁分离操作实现了快捷分离和富集;在金电极表面修饰一段与氯霉素适配体序列部分互补的捕获探针,用于结合未被氯霉素占据的适配体位点,实现磁性纳米粒子的标记;最后,采用电化学方法转化磁性纳米粒子标记物为具有电化学活性的普鲁士蓝,根据其电化学还原峰电流获得与氯霉素浓度成反比的输出信号。本发明实现磁分离富集和信号放大的一体化,节约时间和试剂成本,简化检测步骤和实验仪器使用过程,快速、低成本、可操作强,实现对氯霉素的灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及用于抗生素检测的生物传感器技术领域,特别是一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法。
背景技术
抗生素对细菌和微生物具有抑制和杀灭作用,被广泛应用于农业、畜牧业、生物科学和食品工程等领域。氯霉素是世界上首种完全由合成方法大量制造的广谱抗生素,成本低廉,抑菌效果好,是当前用量最大的抗生素之一。然而,氯霉素可在动物体内大量残留,屡屡导致严重的食品安全事件,给人类健康带来了极大威胁,备受社会和政府关注。因此,开发可靠、简便的氯霉素检测方法至关重要。
在生物传感器领域,为实现目标物的灵敏检测,通常需要分离和富集目标物以及放大检测信号。对于目标物分离和富集,修饰有生物分子的磁性纳米粒子已成为最有效的分离富集工具之一。对于信号放大,采用纳米粒子是当前最有效方法之一。然而,磁性纳米粒子行使分离和富集功能后一般不参与信号输出,导致需要引入额外的信号标记物,从而增加成本和干扰因素,使检测步骤繁琐。
发明内容
本发明针对目前现有技术的不足,提供一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法,实现磁分离富集和信号放大的一体化,籍此开发新型生物传感方法用于检测氯霉素,降低成本,简化步骤,提高灵敏度和可靠性。
本发明中,采用氯霉素适配体修饰磁性纳米粒子用于结合样品中氯霉素,通过磁分离操作实现了快捷分离和富集;在金电极表面修饰一段与氯霉素适配体序列部分互补的捕获探针,用于结合未被氯霉素占据的适配体位点,实现磁性纳米粒子的标记;最后,采用电化学方法转化磁性纳米粒子标记物为具有电化学活性的普鲁士蓝,根据其电化学还原峰电流获得与氯霉素浓度成反比的输出信号。
如图1所示,本发明的技术方案如下:
本发明包括三电极电化学系统,三电极电化学系统以饱和甘汞电极为参比电极,碳电极为对电极,三电极电化学系统以适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极为工作电极,三电极电化学系统工作后在工作电极上由磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝。并进一步由根据普鲁士蓝的电化学还原峰电流,获得氯霉素浓度。
所述适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极的具体制备过程和磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝过程如下:
1)制备适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极;
2)采用三电极电化学系统,在适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)上将磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝;
3)根据普鲁士蓝的电化学还原峰电流,获得氯霉素浓度。
所述步骤1)中的适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极采用以下方式制备:
1.1)通过共沉淀化学合成方法制备磁性纳米粒子水溶液(MNPs);
1.2)处理磁性纳米粒子水溶液制备适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt);
1.3)处理金电极获得捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au);
1.4)处理适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)和捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au)获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)。
所述步骤1.1)具体如下:
1.1.1)FeCl3和FeSO4溶于pH 3的盐酸稀释液中并持续充氮气20min以除去氧气,同时制备NaOH溶液并持续充氩气20min以除去氧气;
所述FeCl3和FeSO4的物质的量之比为2:1,NaOH溶液物质的量浓度为1.25M。
1.1.2)将上述步骤1.1.1)中已除去氧气的含有FeCl3和FeSO4的混合溶液与NaOH溶液迅速混合,持续搅拌,充氩气2h,得到四氧化三铁磁性纳米粒子溶液,再用去离子水和乙醇反复清洗后得到磁性纳米粒子水溶液(MNPs)。
所述用去离子水和乙醇反复清洗具体是:a)磁分离,去除上清液,加入去离子水;b)磁分离,去除上清液,加入乙醇;c)重复上述步骤a)和b)反复多次。
所述步骤1.2)具体如下:
1.2.1)将磁性纳米粒子水溶液在工作频率为40kHz,功率为160W的超声作用下分散10min,得到分散均匀的磁性纳米粒子分散液;
1.2.2)将用于羧基化磁性纳米粒子的柠檬酸与磁性纳米粒子分散液混合,柠檬酸的加入量为0.1-0.4mol每克磁性纳米粒子,置于摇床上反应12h过夜得到羧基化磁性纳米粒子分散液(MNPs-COOH);
1.2.3)将羧基化磁性纳米粒子分散液依次进行磁性分离和去除上清液,获得羧基化磁性纳米粒子,然后将羧基化磁性纳米粒子用磷酸缓冲液(PH 6.8)清洗3次,分散于MES缓冲液中,使得羧基化磁性纳米粒子的最终浓度约为10mg mL-1,4℃下保存,获得含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液;
1.2.4)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)加入到1mL的含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液中,常温下搅拌反应2h,得到活化磁性纳米粒子溶液;将活化磁性纳米粒子溶液用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,然后分散在1mL磷酸缓冲液中,获得含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液;
1.2.5)取含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液与氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)溶液于常温下反应,用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,得到适配体修饰磁性纳米粒子,然后分散在1mL磷酸缓冲液中,4℃下保存,获得适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)。
所述步骤1.2.4)中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)用量为10mmol每克磁性纳米粒子,N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)用量为15mmol每克磁性纳米粒子。
所述步骤1.2.5)的氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)溶液中,氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)序列如SEQ ID NO.1:5′-NH2-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCGGTG GTAG-3′。
所述步骤1.2.5)中氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)的物质的量浓度为0.6-1μM,优选浓度为0.8μM。
所述步骤1.2.5)中的反应时间为45-90min。
所述步骤1.3)具体如下:
1.3.1)取干净金电极,将其置于3,3’—二硫代双磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯(DTSSP)水溶液中浸泡,去离子水清洗3次,获得DTSSP修饰金电极(DTSSP/Au);
1.3.2)滴加链霉亲和素(SA)溶液于DTSSP修饰金电极表面,常温下反应,反应后用pH 7.0的PBS缓冲液清洗金电极表面,获得链霉亲和素修饰金电极(SA/DTSSP/Au);
1.3.3)滴加乙醇胺(ETA)溶液于链霉亲和素修饰金电极表面,常温下反应以封闭非特异性结合位点,反应后用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗金电极表面;
1.3.4)滴加捕获探针DNA(ssDNA)溶液于经乙醇胺处理过的金电极表面,常温下反应,反应后用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗,获得捕获探针DNA修饰金电极(ssDNA/ETA/SA/DTSSP/Au,以下简称ssDNA/Au)。
所述步骤1.3.1)中的干净金电极采取以下方式清洗获得:电极依次在砂纸、0.5μm和0.05μm直径的氧化铝粉末中打磨,再用去离子水、无水乙醇、去离子水超声交替清洗各5分钟,配置体积比为1:3的30%过氧化氢和浓硫酸混合液,滴加在电极表面,保持2分钟,再用去离子水清洗,再重复30%过氧化氢和浓硫酸混合液清洗步骤2次;将电极置于0.5MH2SO4溶液中依次通过恒电位(2V,5s;-0.3V,12s)和循环伏安法(-0.3~1.5V,6圈)处理;最后用大量去离子水清洗电极。
所述步骤1.3.1)中3,3’—二硫代双磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯(DTSSP)的浓度为10-30mM,浸泡时间为不少于0.5h。
所述步骤1.3.2)中滴加的链霉亲和素(SA)溶液的浓度为0.5-1mg/mL,反应时间为不少于30min。
所述步骤1.3.3)中滴加的乙醇胺(ETA)溶液物质的量浓度为5-15mM,反应时间为不少于15min。
所述步骤1.3.4)中捕获探针DNA(ssDNA)的物质的量浓度为1-4μM,反应时间为不少于30min。
所述步骤1.3.4)中捕获探针DNA(ssDNA)的序列如SEQ ID NO.2:5′-Biotin-CTACCACCGACTC-3′。
所述步骤1.4)具体如下:
1.4.1)将过量的适配体修饰磁性纳米粒子分散液与被测的氯霉素溶液混合,放于旋转仪上缓慢摇晃反应,反应后的混合液用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,再分散于磷酸缓冲液中,获得表面修饰上氯霉素的磁性纳米粒子(MNPs-Apt-CAP)和未修饰上氯霉素的磁性纳米粒子(MNPs-Apt-Non CAP)混合构成的混合溶液;
1.4.2)取步骤1.4.1)获得的混合液滴加到捕获探针DNA修饰金电极表面,常温下反应孵育,反应孵育后用PBS缓冲液清洗,获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)。
所述步骤1.4.1)中适配体修饰磁性纳米粒子和氯霉素结合的反应时间为不少于30min。
所述步骤1.4.2)中磁性纳米粒子混合液的磁性纳米粒子总浓度为0.2-1mg mL-1,优选浓度为0.4mg mL-1,混合液用量为5-10μL,反应孵育时间为不少于30min。
所述步骤2)具体是:将适配体修饰磁性纳米粒子标记的电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)置于铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中,采用三电极电化学系统,MNPs-Apt-ssDNA/Au电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,碳棒为对电极,进行多电位阶跃(1.70V,450s;0V,450s)在工作电极上生成获得普鲁士蓝。
所述步骤2)的铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中铁氰化钾和硫酸钾的浓度分别为0.2-0.6mM和0.1M。
所述步骤2)的多电位阶跃采用以下两个阶段依次进行:第一阶段,施加高电压1.70V,时长450s;第二阶段,施加低电压0V,时长450s。
优选地,将适配体修饰磁性纳米粒子标记的电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)置于0.1M的K2SO4和0.4mM的K3[Fe(CN)6]混合溶液中,通过多电位阶跃电沉积得到普鲁士蓝。
所述步骤3)中采用以下方式采集电化学还原峰电流:将生成普鲁士蓝后的电极置于0.1mol L-1的HCl溶液和0.1mol L-1的K2SO4溶液中,以0.1V s-1扫速,以施加恒定电位-0.3V~0.5V且2~10圈的方式循环伏安扫描,采集获得峰还原电流大小。
所述步骤3)具体是:由已知氯霉素浓度的样品重复步骤1)-2)获得普鲁士蓝的电化学还原峰电流,结合样品的已知氯霉素浓度和对应获得的电化学还原峰电流通过拟合建立氯霉素浓度与还原电流值之间的标准曲线模型,然后标准曲线模型对由待测氯霉素浓度的样品重复步骤1)-2)获得普鲁士蓝的电化学还原峰电流进行处理,获得待测氯霉素浓度的样品中的氯霉素浓度。
本发明通过实施例验证,本发明技术检测缓冲液中氯霉素的线性范围为0.5-1000ng mL-1,检测限为0.29ng mL-1;同时应用于牛奶样本的加标回收检测,回收率为82%-113%。
本发明的技术效果是:
本发明探索出了磁性纳米颗粒的新功能,能够实现磁分离富集和信号放大的一体化,一方面结合磁分离和富集使磁性纳米粒子的修饰过程更为简化和快捷;另一方面设计磁性纳米粒子本身作为信号标记物,无需引入额外的信号标记物,从而节约了成本、简化了操作步骤。
本发明相比常规样品分离富集和信号输出分隔的技术,可节约时间和试剂成本,简化检测步骤和所需仪器,从而提供了一种快速、低成本、可操作强的新检测技术。
本发明采用电化学转化磁性纳米粒子作为信号放大手段,可充分利用磁性纳米粒子中大量的铁成分、电化学操作的便利性,以及电化学检测的高度灵敏性,从而实现对氯霉素的灵敏检测。
本发明采用适配体作为识别元件,相比常规采用抗体的技术,具有类似的高亲合性和强特异性,但显著降低了成本和试剂保存要求,从而提供了一种低成本、可操作强的新检测技术。
附图说明
图1是本发明的原理图。
图2是自组装过程中电极的电化学阻抗响应曲线图。
图3是Fe3O4磁性纳米颗粒扫描电镜图。
图4是电化学传感器影响参数的优化图,A磁性纳米粒子浓度的优化;B适配体浓度的优化)。
图5是电化学生物传感器在不同浓度的氯霉素标准液中的氧化还原电流响应曲线图。
图6是电化学生物传感器对氯霉素检测的标准曲线图。
表一本发明方法应用于8个浓度实施例的检测参数与性能。
表二电化学生物传感器在牛奶样品检测中的加标回收率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明,但本发明不受实施例的限制。
本发明的实施例如下:
1)制备适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极
1.1)通过共沉淀化学合成方法制备磁性纳米粒子水溶液(MNPs):
1.1.1)FeCl3和FeSO4溶于pH 3的盐酸稀释液中并持续充氮气20min以除去氧气,同时制备NaOH溶液并持续充氩气20min以除去氧气;FeCl3和FeSO4的物质的量之比为2:1,NaOH溶液物质的量浓度为1.25M。
1.1.2)将上述步骤1.1.1)中已除去氧气的含有FeCl3和FeSO4的混合溶液与NaOH溶液迅速混合,持续搅拌,充氩气2h,得到四氧化三铁磁性纳米粒子溶液,再用去离子水和乙醇反复清洗后得到磁性纳米粒子水溶液(MNPs)。
用去离子水和乙醇反复清洗具体是:a)磁分离,去除上清液,加入去离子水;b)磁分离,去除上清液,加入乙醇;c)重复上述步骤a)和b)反复多次。
1.2)处理磁性纳米粒子水溶液制备适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt):
1.2.1)将磁性纳米粒子水溶液在工作频率为40kHz,功率为160W的超声作用下分散10min,得到分散均匀的磁性纳米粒子分散液;
1.2.2)将柠檬酸与磁性纳米粒子分散液混合,柠檬酸的加入量为0.2mol每克磁性纳米粒子,置于摇床上反应12h过夜得到羧基化磁性纳米粒子分散液(MNPs-COOH);
1.2.3)将羧基化磁性纳米粒子分散液依次进行磁性分离和去除上清液,获得羧基化磁性纳米粒子,然后将羧基化磁性纳米粒子用磷酸缓冲液(PH 6.8)清洗3次,分散于MES缓冲液中,使得羧基化磁性纳米粒子的最终浓度约为10mg mL-1,4℃下保存,获得含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液;
1.2.4)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)配置10mM的EDC和15mM的NHSS混合溶液(EDC/NHSS),将其作为交联剂。
然后加入到1mL的含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液中,常温下搅拌反应2h,得到活化磁性纳米粒子溶液。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)用量为10mmol每克磁性纳米粒子,N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)用量为15mmol每克磁性纳米粒子。
将活化磁性纳米粒子溶液用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,然后分散在1mL磷酸缓冲液中,获得含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液;
1.2.5)配置浓度为1μΜ的氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)溶液,氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)序列如SEQ ID NO.1:5′-NH2-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAGTCG GTG GTAG-3′。
取含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液与氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)溶液于常温下反应,先超声作用10s,再常温下搅拌反应1h,用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,得到适配体修饰磁性纳米粒子,然后分散在1mL磷酸缓冲液中,4℃下保存,获得适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)得到磁性纳米粒子。
1.3)处理金电极获得捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au):
1.3.1)将DTSSP粉末溶解于去离子水中,配置2mM的DTSSP溶液。
清洗获得干净金电极:电极依次在砂纸、0.5μm和0.05μm直径的氧化铝粉末中打磨,再用去离子水、无水乙醇、去离子水超声交替清洗各5分钟,配置体积比为1:3的30%过氧化氢和浓硫酸混合液,滴加在电极表面,保持2分钟,再用去离子水清洗,再重复30%过氧化氢和浓硫酸混合液清洗步骤2次;将电极置于0.5M H2SO4溶液中依次通过恒电位(2V,5s;-0.3V,12s)和循环伏安法(-0.3~1.5V,6圈)处理;最后用大量去离子水清洗电极。
将干净金电极置于3,3’—二硫代双磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯(DTSSP)水溶液中浸泡4小时,在电极表面形成一层自组装膜,用去离子水清洗电极3次,去除多余DTSSP分子,获得DTSSP修饰金电极(DTSSP/Au)。
1.3.2)将链霉亲和素粉末溶解于PBS缓冲液中,配置1mg/mL的链霉亲和素溶液(SA),4℃保存。滴加链霉亲和素(SA)溶液于DTSSP修饰金电极表面,保持金面水平,常温下反应静置1小时,反应后用pH 7.0的PBS缓冲液清洗金电极表面,获得链霉亲和素修饰金电极(SA/DTSSP/Au)。
1.3.3)用水作为稀释液,配置10mM的乙醇胺溶液(ETA)。配置浓度为1mM的乙醇胺溶液(ETA),滴加乙醇胺(ETA)溶液于链霉亲和素修饰金电极表面,保持金面水平,常温下反应静置1小时以封闭非特异性结合位点,反应后用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗金电极表面;
1.3.4)将ssDNA粉末溶解于去离子水中,配置4μΜ的ssDNA溶液。捕获探针DNA(ssDNA)的序列如SEQ ID NO.2:5′-Biotin-CTACCACCGACTC-3′。
以上试剂均于4℃保存。滴加捕获探针DNA(ssDNA)溶液于经乙醇胺处理过的金电极表面,保持金面水平,常温下反应静置1小时,反应后用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗。
随着生物分子的层层组装,电极的阻抗值也越来越大,对电极进行阻抗谱的扫描,结果验证了ssDNA成功修饰到电极表面,如图2所示,获得了捕获探针DNA修饰金电极(ssDNA/ETA/SA/DTSSP/Au,以下简称ssDNA/Au)。
1.4)处理适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)和捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au)获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au):
适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)中的磁性纳米粒子浓度是0.4mg mL-1,适配体浓度是0.8μM。
1.4.1)PB1作为溶剂,配置0.5-1000ng mL-1氯霉素标准溶液,本实施例配置有8个已知不同氯霉素浓度梯度,每个浓度梯度的氯霉素溶液分别与0.4mg mL-1的MNPs-Apt反应30min。如下表1。
将500μL的适配体修饰磁性纳米粒子分散液与500μL被测的氯霉素溶液混合,放于旋转仪上缓慢摇晃反应,反应时间为1h,反应后的混合液用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,再分散于磷酸缓冲液中,获得表面修饰上氯霉素的磁性纳米粒子(MNPs-Apt-CAP)和未修饰上氯霉素的磁性纳米粒子(MNPs-Apt-Non CAP)混合构成的混合溶液;
1.4.2)取步骤1.4.1)获得10μL的混合液滴加到捕获探针DNA修饰金电极表面,保持金面水平,常温下反应孵育静置30min,反应孵育后用PBS缓冲液清洗,获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)。
2)采用三电极电化学系统,在适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)上将磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝;
将适配体修饰磁性纳米粒子标记的电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)置于铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中,铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中铁氰化钾和硫酸钾的浓度分别为0.4mM和0.1M。
采用三电极电化学系统,MNPs-Apt-ssDNA/Au电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,碳棒为对电极,进行多电位阶跃(1.70V,450s;0V,450s)在工作电极上生成获得普鲁士蓝。
3)根据普鲁士蓝的电化学还原峰电流,获得氯霉素浓度。
将生成普鲁士蓝后的电极置于0.1mol L-1的HCl溶液和0.1mol L-1的K2SO4溶液中,以0.1V s-1扫速,以施加恒定电位-0.3V~0.5V且2~10圈的方式循环伏安扫描,得到工作曲线(如图5),普鲁士蓝还原峰电流信号与氯霉素浓度成反比,曲线代表不同氯霉素(CAP)浓度对应的循环伏安曲线,随着浓度的增加,氧化还原电流峰值降低。
对8个已知不同氯霉素浓度的进行子实施例检测结果如表1所示:
表1
并且以氯霉素浓度的对数为横坐标,还原电流峰值为纵坐标建立关系曲线,可以得到该生物传感器的线性检测范围为0.5-1000ng mL-1,线性回归方程为:i=119.1-30.0logcCAP(r2=0.9780),检测限(S/N=3)为0.29ng mL-1(如图6)。由此建立氯霉素浓度与还原电流值之间的标准曲线模型。
4)具体实例测定牛奶样品加标回收率
从当地超市购买脱脂牛奶,向牛奶样品中添加氯霉素浓度分别为:4.5ngmL-1,52ngmL-1,252ng mL-1,进行实际样品检测,在测试之前,对牛奶进行预处理:取4mL脱脂乳,加入100μL的17.2%的亚铁氰化钾溶液,震荡10s后,再加入100μL的53.5%的硫酸锌溶液,震荡10s,8000rpm离心10min,取上清,使用本发明的电化学生物传感器进行循环伏安测试,根据已经获得的还原电流值与氯霉素浓度的关系曲线得到实际的检测值。
实际样品检测的回收率在82%-113%之间(回收率在100%的情况为最准确,本领域技术人员认为75-120之间为良好),结果如下表2。标准添加法检测回收率(n=3)。
表2
由此说明本发明的磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器能够较好的用于牛奶实际样品的抗生素残留检测。
由上述两个实施例可见,本发明方法有利于整个制备过程中试验条件的控制,更好地实现人为因素的干扰作用,充分体现了磁分离的快速简便、电化学信号的灵敏快速等优势,能够用于实际样品中氯霉素残留的快速检测工作。
本实施例上述提到的“适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)中的磁性纳米粒子浓度是1mg mL-1,适配体浓度是1μM。”是采用以下方式进行优化获得其所采用最佳浓度:
先制备不同浓度的磁性纳米粒子溶液,磁性纳米粒子溶液浓度分别是0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg mL-1,用这五种不同浓度的和浓度为定值1μM的适配体进行实验操作获得如图4中A图所示的结果。图4中a表示修饰上适配体的磁珠与浓度为0的氯霉素溶液进行反应,b表示修饰上适配体的磁珠与浓度为10000ng mL-1的氯霉素溶液进行反应。图4的A中可见0.4mg mL-1是磁性纳米粒子溶液的最佳浓度,该浓度下对氯霉素的检测范围最大。
然后制备不同浓度的适配体溶液,适配体浓度的分布是0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μM,用这五种不同浓度的和浓度为定值0.4mg mL-1的磁性纳米粒子溶液进行实验操作获得如图4中B图所示的结果。图4的B中可见0.8μM是适配体溶液的最佳浓度,该浓度下检测到的还原电流值已达到稳定最大值。
本发明上述涉及的基因和氨基酸序列具体如下:
SEQ ID NO.1:氨基修饰的氯霉素适配体基因序列
来源:人工合成
5′-NH2-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-3′
SEQ ID NO.1:捕获探针DNA基因序列
来源:人工合成
5′-Biotin-CTACCACCGACTC-3′。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器及方法
<130> 123456
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag 40
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctaccaccga ctc 13
Claims (10)
1.一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器,包括三电极电化学系统,三电极电化学系统以饱和甘汞电极为参比电极,碳电极为对电极,其特征在于:三电极电化学系统以适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极为工作电极,三电极电化学系统工作后在工作电极上由磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝。
2.一种磁分离-信号放大一体化的氯霉素检测生物传感器的方法体系,其特征在于:所述适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极的具体制备过程和磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝过程如下:
1)制备适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极;
2)采用三电极电化学系统,在适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)上将磁性纳米粒子转化生成普鲁士蓝;
3)根据普鲁士蓝的电化学还原峰电流,获得氯霉素浓度。
3.根据权利要求1所述的氯霉素检测生物传感器或者根据权利要求2所述的方法体系,其特征在于:所述适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极采用以下方式制备:
1.1)通过共沉淀化学合成方法制备磁性纳米粒子水溶液(MNPs);
1.2)处理磁性纳米粒子水溶液制备适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt);
1.3)处理金电极获得捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au);
1.4)处理适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)和捕获探针DNA修饰的金电极(ssDNA/Au)获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的金电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)。
4.根据权利要求3所述的氯霉素检测生物传感器或者方法体系,其特征在于:所述步骤1.1)具体如下:
1.1.1)FeCl3和FeSO4溶于pH 3的盐酸稀释液中并持续充氮气20min以除去氧气,同时制备NaOH溶液并持续充氩气20min以除去氧气;
1.1.2)将上述步骤1.1.1)中已除去氧气的含有FeCl3和FeSO4的混合溶液与NaOH溶液迅速混合,持续搅拌,充氩气2h,得到四氧化三铁磁性纳米粒子溶液,再用去离子水和乙醇反复清洗后得到磁性纳米粒子水溶液(MNPs)。
5.根据权利要求3所述的氯霉素检测生物传感器或者方法体系,其特征在于:所述步骤1.2)具体如下:
1.2.1)将磁性纳米粒子水溶液在工作频率为40kHz,功率为160W的超声作用下分散10min,得到分散均匀的磁性纳米粒子分散液;
1.2.2)将柠檬酸与磁性纳米粒子分散液混合,柠檬酸的加入量为0.1-0.4mol每克磁性纳米粒子,置于摇床上反应12h过夜得到羧基化磁性纳米粒子分散液(MNPs-COOH);
1.2.3)将羧基化磁性纳米粒子分散液依次进行磁性分离和去除上清液,获得羧基化磁性纳米粒子,然后将羧基化磁性纳米粒子用磷酸缓冲液(PH 6.8)清洗3次,分散于MES缓冲液中,使得羧基化磁性纳米粒子的最终浓度约为10mgmL-1,4℃下保存,获得含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液;
1.2.4)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐混合溶液(NHSS)加入到1mL的含有羧基化磁性纳米粒子的MES分散液中,常温下搅拌反应2h,得到活化磁性纳米粒子溶液;将活化磁性纳米粒子溶液用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,然后分散在1mL磷酸缓冲液中,获得含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液;
1.2.5)取含有活化磁性纳米粒子的磷酸缓冲分散液与氨基修饰的氯霉素适配体(Apt)溶液于常温下反应,用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁性分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,得到适配体修饰磁性纳米粒子,然后分散在1mL磷酸缓冲液中,4℃下保存,获得适配体修饰磁性纳米粒子分散液(MNPs-Apt)。
6.根据权利要求3所述的氯霉素检测生物传感器或者方法体系,其特征在于:所述步骤1.3)具体如下:
1.3.1)取干净金电极,将其置于3,3’—二硫代双磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯(DTSSP)水溶液中浸泡,去离子水清洗3次,获得DTSSP修饰金电极(DTSSP/Au);
1.3.2)滴加链霉亲和素(SA)溶液于DTSSP修饰金电极表面,常温下反应,反应后用pH7.0的PBS缓冲液清洗金电极表面,获得链霉亲和素修饰金电极(SA/DTSSP/Au);
1.3.3)滴加乙醇胺(ETA)溶液于链霉亲和素修饰金电极表面,常温下反应以封闭非特异性结合位点,反应后用pH 7.0的PBS缓冲液清洗金电极表面;
1.3.4)滴加捕获探针DNA(ssDNA)溶液于经乙醇胺处理过的金电极表面,常温下反应,反应后用pH 7.0的PBS缓冲液清洗,获得捕获探针DNA修饰金电极(ssDNA/ETA/SA/DTSSP/Au,以下简称ssDNA/Au)。
7.根据权利要求3所述的氯霉素检测生物传感器或者方法体系,其特征在于:所述步骤1.4)具体如下:
1.4.1)将过量的适配体修饰磁性纳米粒子分散液与被测的氯霉素溶液混合,放于旋转仪上缓慢摇晃反应,反应后的混合液用PH 6.8的磷酸缓冲液进行依次磁分离和去除上清液的步骤重复清洗3次,再分散于磷酸缓冲液中,获得表面修饰上氯霉素的磁性纳米粒子(MNPs-Apt-CAP)和未修饰上氯霉素的磁性纳米粒子(MNPs-Apt-Non CAP)混合构成的混合溶液;
1.4.2)取步骤1.4.1)获得的混合液滴加到捕获探针DNA修饰金电极表面,常温下反应孵育,反应孵育后用PBS缓冲液清洗,获得适配体修饰磁性纳米粒子标记的电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)。
8.根据权利要求2所述的方法体系,其特征在于:所述步骤2)具体是:
将适配体修饰磁性纳米粒子标记的电极(MNPs-Apt-ssDNA/Au)置于铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中,采用三电极电化学系统,MNPs-Apt-ssDNA/Au电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,碳棒为对电极,进行多电位阶跃在工作电极上生成获得普鲁士蓝。
9.根据权利要求8所述的方法体系,其特征在于:所述步骤3)中采用以下方式采集电化学还原峰电流:将生成普鲁士蓝后的电极置于0.1mol L-1的HCl溶液和0.1mol L-1的K2SO4溶液中,以0.1V s-1扫速,以施加恒定电位-0.3V~0.5V且2~10圈的方式循环伏安扫描,采集获得峰还原电流大小。
10.根据权利要求2所述的方法体系,其特征在于:所述步骤3)具体是:由已知氯霉素浓度的样品重复步骤1)-2)获得普鲁士蓝的电化学还原峰电流,结合样品的已知氯霉素浓度和对应获得的电化学还原峰电流通过拟合建立氯霉素浓度与还原电流值之间的标准曲线模型,然后标准曲线模型对由待测氯霉素浓度的样品重复步骤1)-2)获得普鲁士蓝的电化学还原峰电流进行处理,获得待测氯霉素浓度的样品中的氯霉素浓度。
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