CN110146578A - 一种基于RGO-CS-Fc/Pt NPs纳米复合材料检测胆固醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RGO‑CS‑Fc/Pt NPs纳米复合材料检测胆固醇的方法，首先在活化处理基础丝网印刷电极，表面通过电沉积法形成一层金纳米粒子，将RGO‑CS‑Fc修饰至电极表面，再通过恒电位沉积法使铂离子在电极表面电还原形成Pt NPs，然后利用RGO‑CS‑Fc的良好生物相容性、高比表面积、高电子转移效率以及高酶负载特性，吸附大量的胆固醇酶构建出酶电极，联合胆固醇酶和Pt NPs的催化放大效果，胆固醇发生分解并产生H2O2，最后根据检测H2O2的氧化还原伏安电流值，绘制工作曲线，实现对胆固醇的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种复合材料构建酶电极检测胆固醇的方法。
背景技术
目前用于检测胆固醇（Cholesterol）的技术主要是基于酶法的分光光度法、比色法、荧光法、化学法等。公开号为CN108776163A的发明专利，公开一种由丝网印刷电极及吸附在所述丝网印刷电极表面的物质识别酶膜（由胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、聚乙烯醇、壳聚糖、碳纳米管混合制备而成）构建出胆固醇酶生物传感器，然后通过电化学检测胆固醇的方法。CN103954660A的发明专利，公开一种采用经典的三电极体系构建的胆固醇酶生物传感器，其中工作电极上固化特定的物质识别酶膜，所述物质识别酶膜主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成，得到所述酶生物传感器。这些方法有的是对环境的要求较高，且导电性不好，或者方法操作步骤多，价格昂贵，或者是费时且技术要求高等缺点，需要建立一种快速、灵敏、操作简单的胆固醇检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用石墨烯-壳聚糖-二茂铁复合材料（RGO-CS-Fc）结合铂纳米粒子（Pt NPs）构建酶电极，再使用电化学方法检测胆固醇的方法，以解决目前的生物传感器的易受环境影响和导电性不好、技术要求高等问题。
本发明的检测原理为：利用RGO-CS-Fc复合纳米材料的良好生物相容性、高比表面积、高电子转移效率以及高酶负载特性，吸附大量的胆固醇酶构建出酶电极，改善了酶电极的初始电化学性能以及稳定性；联合胆固醇酶和Pt NPs的高效催化协同增强对胆固醇的催化作用，构建酶生物传感器，采取电流-时间（i-t）法对胆固醇进行检测，根据传感器的电流响应与胆固醇浓度的关系绘制出工作曲线，实现对胆固醇的高效灵敏检测。本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：RGO-CS-Fc复合纳米材料的制备
（1）称取氧化石墨烯（GO）粉末置于超纯水中，制成氧化石墨烯溶液后，然后将水合肼与石墨烯溶液充分混溶然后在水浴中加热，充分反应，高速离心取沉淀溶于超纯水得到还原型氧化石墨烯（RGO）溶液。
（2）制备壳聚糖-二茂铁（CS-Fc）溶液：将乙酸滴入壳聚糖中溶解得到壳聚糖-乙酸溶液，向壳聚糖-乙酸溶液中加二茂铁甲酸得到壳聚糖-二茂铁溶液。
（3）RGO-CS-Fc复合纳米材料的制备：将RGO溶液与壳聚糖-二茂铁溶液混合，搅拌离心，去上清液，余下的黑色沉淀用二次蒸馏水洗涤后离心，得到RGO-CS-Fc纳米复合材料。
步骤2：RGO-CS-Fc/Pt NPs修饰的胆固醇酶电极的构建
（1）将丝网印刷电极（SPCE）置于硫酸溶液中进行电化学循环伏安扫描活化，用纯水冲洗干净。
（2）将活化后的电极浸入氯金酸（HAuCl4）溶液中进行恒电位沉积，用纯水冲洗晾干备用。
（3）取RGO-CS-Fc纳米复合材料于蒸馏水中，形成RGO-CS-Fc纳米复合材料分散液。将复合材料分散液修饰在（2）已处理好的丝网印刷电极表面，纯水冲洗晾干备用。
（4）将（3）修饰好的电极浸入氯铂酸（H2PtCl6）溶液中进行恒电位沉积，用纯水冲洗晾干备用。
（5）将胆固醇酶溶液（CHER&CHOD）滴到（4）的电极表面，将胆固醇酶吸附到电极表面，即得到RGO-CS-Fc/Pt NPs修饰的胆固醇酶电极。
步骤3：胆固醇工作曲线的绘制
（1） 将步骤2得到的RGO-CS-Fc/Pt NPs修饰的胆固醇酶电极置于孵育箱中，孵育一段时间，用纯水冲洗晾干。
（2）将（1）所得的电极放在PBS溶液中，用电流-时间法进行胆固醇的计时响应。测量时在特定电位下加入不同浓度的胆固醇标准溶液置于PBS溶液中，记录电流响应值。
（3）根据传感器的电流响应值与胆固醇浓度的关系，绘制工作曲线，计算灵敏度和最低检测限。
步骤4：实际样本中的胆固醇检测
（1） 将步骤2得到的RGO-CS-Fc/Pt NPs修饰的胆固醇酶电极极置于孵育箱中，孵育一段时间，用纯水冲洗晾干。
（2）将实际样本（血清或者尿液）置于PBS溶液中。将（1）所得的电极放在含有实际样本的PBS溶液中，用电流-时间法进行胆固醇的计时响应，记录电流响应值。
（3）根据步骤3所得的胆固醇工作曲线计算出实际样本中胆固醇的浓度。
进一步，所述步骤2中所述氯金酸溶液的质量分数为0.01%。
进一步，所述步骤2中所述氯金酸溶液的沉积电位为-0.5V。
进一步，所述步骤2中所述氯铂酸溶液的沉积电位为-0.2V。
进一步，所述步骤3和步骤4中所述胆固醇检测的电位为-0.5V。
进一步，所述步骤3和步骤4所述的PBS溶液的浓度为0.1 M，pH 为7.0，含有NaCl浓度为0.1 M。
优选，所述步骤1中所述氧化石墨烯的浓度为1mg/mL。
优选，所述步骤2中所述氯铂酸溶液的质量分数为0.01%。
其中，步骤1提供了一种相对比表面积大且易与生物物质结合的RGO-CS-Fc纳米复合材料；步骤2利用RGO-CS-Fc纳米复合材料修饰裸丝网印刷电极，使电极能够结合大量的Pt纳米粒子以及酶颗粒，构建出可用于胆固醇检测的酶电极；在步骤3和4中，联合胆固醇酶和Pt纳米材料的催化放大效果实现胆固醇的一步检测，且结合RGO-CS-Fc纳米复合材料的良好电子活性，构成特异性识别胆固醇的生物传感界面，并有利于电信号的传递；而步骤2中酶电极的构建是步骤3和4中胆固醇的电化学检测中的必不可少的关键步骤；步骤3的胆固醇的工作曲线为步骤4的实际样本中胆固醇浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用实现电化学方法检测胆固醇。
本发明建立的检测胆固醇的方法有益效果在于操作简单、检测时间短，易于微型化。
附图说明
图1是基于RGO-CS-Fc/Pt NPs构建酶电极检测胆固醇方法的原理；
图2是RGO-CS-Fc复合材料的扫描电子显微镜表征图，其中左图为RGO的扫描电镜图，右图是RGO-CS-Fc的扫描电镜图；
图3是不同电极的扫描电子显微镜表征图；
图4是不同电极的检测电流响应曲线图；其中a是裸SPCE电极检测胆固醇标准样品的i-t曲线；b是SPCE/Au NPs/Pt NPs/CHOD&CHER电极检测胆固醇标准样品的i-t曲线；c是SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc/Pt NPs/CHOD&CHER电极检测胆固醇标准样品的i-t曲线；d是SPCE/AuNPs/RGO-CS-Fc/Pt NPs/CHOD&CHER电极检测不含胆固醇的空白样品的i-t曲线；
图5胆固醇的工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。该实施例仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
图1为基于RGO-CS-Fc/Pt NPs构建酶电极检测胆固醇方法的原理示意图。用恒电位沉积法在SPCE表面沉积Au NPs，从而增加电极的有效面积。然后，通过π-π键与静电吸附的相互作用将RGO-CS-Fc纳米复合材料固定在SPCE/ Au NPs电极表面。再次采用电化学恒电位沉积法，在SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc电极表面沉积铂纳米粒子。最后，将CHOD&CHER酶液吸附固定在SPCE/Au NPS/RGO-CS-Fc/Pt NPs表面，由此制备了胆固醇电化学生物传感器。
利用RGO-CS-Fc复合纳米材料的良好生物相容性、高比表面积、高电子转移效率以及高酶负载特性，吸附大量的胆固醇酶构建出酶电极，改善了酶电极的初始电化学性能以及稳定性；联合胆固醇酶和Pt NPs的高效催化协同增强对胆固醇的催化作用，构建酶生物传感器，采取电流-时间法对胆固醇进行检测，根据传感器的电流响应与胆固醇浓度的关系绘制出工作曲线，实现对胆固醇的高效灵敏检测。本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
实施步骤如下：
1：RGO-CS-Fc复合纳米材料的制备
（1）将10 mg GO分散于10 mL超纯水中，使用细胞超声破碎仪超声形成1mg/mL石墨烯的悬浮液，在离心机中以3000 r/min的速度离心，去除沉淀中颗粒较大的石墨烯粒子，然后取上清液得到10 mL浓度为1 mg/mL的GO溶液；
（2）将100 mL质量分数为80%的水合肼与GO溶液充分混溶，然后在水浴中加热，充分反应4小时，在高速离心机中以10000 r/min的速度离心，取沉淀溶于超纯水，得到10 mL浓度为1 mg/ml的RGO溶液；
（3）将1%的乙酸滴入0.2 mg的壳聚糖中溶解成10 mL的溶液，向壳聚糖-乙酸溶液中加入2 mg二茂铁甲酸、1 mL浓度为10 mM的EDC和4 mL浓度为10 mM的NHS溶液，搅拌4 h后，取10 mL浓度为1 mg/mL的RGO溶液与之混合，搅拌12 h，使之充分结合，最后在高速离心机中通过的高速离心（速度：20000 r/min，时间：30 min）除去上清液，重新分散于超纯水中得到10 mL浓度为1 mg/mL的RGO-CS-Fc纳米复合材料溶液，于4°C冰箱冷藏以备使用。
图2是将5 µL浓度为0.1 mg/mL的RGO和RGO-CS-Fc溶液滴加于清洁干燥的硅片中心，干燥，使用Quanta 200（德国Elementar公司）扫描电子显微镜，在20 KV电压下对样品的50 K放大倍数的SEM图。左图中RGO纳米材料呈现出较为平整的片状结构，像图中亮点处堆积的RGO纳米材料也体现了良好的片状结构。右图中的RGO-CS-Fc复合纳米材料呈现包裹状，这是由于壳聚糖的优良成膜性，RGO纳米材料与CS-Fc结合之后被壳聚糖所包裹，而在同一平面上的亮点则是因为二茂铁的存在。这些说明形成了一种新的RGO-CS-Fc复合纳米材料。
2：RGO-CS-Fc/Pt NPs修饰的胆固醇酶电极的构建
（1）丝网印刷电极的活化：将丝网印刷电极（SPCE）浸入5 mL浓度为0.5 M的H2SO4溶液中，通过电化学以100 mV/s的扫描速度在为0.2 V至1 V的电压范围循环扫描活化，可以使电极稳定性更好，电极表面带上电荷，能使之后的修饰效果更好；
（2）金纳米颗粒修饰：将活化后的SPCE电极浸入持续搅拌的5 mL质量分数为0.01%的HAuCl4溶液中，通过电化学在-0.5 V电位下进行恒电位电沉积120s，在活化的SPCE表面沉积Au NPs，得到SPCE/ Au NPs 电极。
（3）敏感单元的修饰：将2 µL浓度为0.4 mg/mL的RGO-CS-Fc溶液滴在SPCE/Au NPs的电极表面，在25℃恒温条件下孵育30分钟，使用超纯水洗去未牢固结合的RGO-CS-Fc纳米复合材料，晾干；而后将SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc电极浸入持续搅拌的5 mL分子质量为0.01%的H2PtCl6溶液中，通过电化学在-0.5 V电位下进行恒电位电沉积90 s，在活电极表面沉积Pt NPs，使用超纯水洗去残留的H2PtCl6溶液，晾干，连续重复以上步骤三次；将2.0 mL浓度为0.5 mg/mL的CHOD&CHER酶溶液滴到电极表面，在15°C恒温的潮湿环境中孵育1小时，将CHOD&CHER吸附到电极表面，使用超纯水洗去残留的CHOD&CHER溶液，晾干。联合RGO、PtNPs和CHOD&CHER的催化放大效果构成二级催化结构，实现胆固醇的一步检测。
对构建的胆固醇酶电极进行扫描电镜表征，得到如图3的SEM图，其中，图A为裸丝网印刷电极的SEM图，丝网印刷电极表面因为其固有的碳颗粒而呈现出排列均匀的颗粒；图B为SPCE/Au NPs的电极SEM图，由于金纳米颗粒的存在，可以看见在碳颗粒的表层均匀分布着许多亮白色的球形微粒，表明金纳米颗粒被良好的沉积到SPCE电极表面；图C为SPCE/AuNPs/RGO-CS-Fc的电极SEM图，RGO-CS-Fc是纳米级的纳米复合材料，使金表面变得间隙更小，并且给SPCE/Au NPs电极表面附上一层片状的黑色薄膜；图D为SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc/Pt NPs的电极SEM图，许多尺寸较小以及颜色较暗的球形颗粒分布到电极表面，证实铂纳米颗粒被成功沉积到SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc电极表面；图E是SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc/Pt NPs/CHOD&CHER的电极SEM图，金属颗粒表面结合了CHOD&CHER酶，出现稍大的白色颗粒，证实CHOD&CHER酶颗粒被成功吸附到SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc/Pt NPs电极表面。
使用不同的胆固醇酶电极进行了可行性分析，并得到了如图4中的电流响应曲线。曲线c、b的阶梯电流响应要远远高于曲线a的，而胆固醇不存在时（曲线d）则有不明显的反应。此外，从曲线a、b和c可以看出，与其他电极相比，SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc/Pt NPs/CHOD&CHER对胆固醇检测的安培响应最高（∆i=530 nA），表明RGO-CS-Fc可以增加酶的负荷，并且联合CHOD&CHER和Pt NPs比Pt NPs单独使用能够起到更强的催化作用。通过可行性分析，说明SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc/Pt NPs/CHOD&CHER可以有效的检测胆固醇的浓度。
3：胆固醇工作曲线的绘制：将构建好的传感器电极置于2 mL浓度为0.1 M的PBS（pH7.0，溶液内NaCl 浓度为0.1 M），再通过电化学工作站使用i-t测量方法在室温下外加-0.5 V的电位测量基线，当曲线稳定后，将10 µL标准胆固醇溶液加入PBS溶液中，记录产生的电化学信号。一种基于RGO-CS-Fc/Pt NPs纳米复合材料的胆固醇生物传感器就构建成功了。在胆固醇浓度为0.1-10mg/mL的范围内，传感器电流响应与胆固醇浓度呈良好的正相关线性关系，见图5所示。通过线性拟合得出标准曲线为I（nA）=13.76396 c（mg/mL）+72.29672（I为电流阶跃响应，c为胆固醇浓度），线性相关系数R2=0.99897。通过校准直线部分的斜率计算灵敏度，得出传感器的灵敏度为1.654 µA /mM*cm2。
4：实际样本中的胆固醇检测：将构建好的传感器电极置于2 mL浓度为0.1 M的PBS（pH7.0，溶液内NaCl 浓度为0.1 M），再通过电化学工作站使用i-t测量方法在室温下外加-0.5 V的电位测量基线，当曲线稳定后，将10 µL血清样本加入PBS溶液中，记录产生的电化学信号，通过工作曲线计算胆固醇的浓度。结果见表1。
表1 实际血清样本的检测
（注：血清样本中胆固醇的标准浓度由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院使用氧化酶法测定）。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种还原氧化石墨烯/柿单宁/铂-钯复合纳米材料，制备方法如下：
（1）RGO的制备：取石墨烯，将其置于蒸馏水中，超声分散，得石墨烯悬浮液；在悬浮液中加入抗坏血酸，搅拌，离心，去上清液干燥，得到RGO；
（2）RGO/PT/Pt-Pd的制备：称量柿单宁加入到RGO溶液中，超声，制成RGO/PT悬浮液；加入 HPtCl4 和Pd(NO3)2，加入AA，搅拌，离心，去除上清液，沉淀用超纯水洗涤后离心，即得RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料。
2.一种用权利要求1所述复合纳米材料修饰丝网印刷电极联合PROD检测l,5-AG的方法，包含以下步骤：
步骤1：丝网印刷电极的活化
将丝网印刷电极置于H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，得到活化后的丝网印刷电极，用纯水冲洗干净；
步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建
（1）将活化后的丝网印刷电极进行金的恒电位沉积，洗干净；
（2）移取RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料的悬浮液，加在预处理好的电极表面，然后将电极放到孵育箱中孵育，即得到RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料修饰的工作电极；
（3）在RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料修饰的电极表面滴加PROD溶液，置于空气中孵育，即为构建的1,5-AG的电化学生物传感界面；
步骤3：1,5-AG的工作曲线绘制
（1）在步骤2构建的1,5-AG电化学生物传感界面滴加1,5-AG标准溶液，放到孵育箱中孵育一段时间，得到1,5-AG电化学生物传感器；
（2）将上述的工作电极浸入到PBS溶液里面，用电化学工作站，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行扫描，记录传感器的响应电流值；
（3）根据传感器的电流响应值与1,5-AG浓度的关系，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限；
步骤4：待测样品中1,5-AG的检测
（1）在步骤2构建的1,5-AG电化学生物传感界面滴加一定量的待测实际样品，放到孵育箱中孵育一段时间，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用；
（2）将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流；
（3）根据步骤3所述标准曲线，得到所述待测实际样品中1,5-AG的浓度。
3.按照权利要求2所述的l,5-AG方法，其特征在于：步骤1中所述H2SO4溶液浓度为0.5mol/L；所述扫描电压为-0.2 V ~ 1.0 V，扫描圈数为10。
4.按照权利要求2所述的l,5-AG方法，其特征在于：步骤2中所述用于纳米金的沉积溶液为浓度为0.01%的HAuCl4，沉积电位为-0.5 V，沉积时间120 s。
5.按照权利要求2所述的l,5-AG方法，其特征在于：步骤2中所述RGO/PT/Pt-Pd复合纳米材料浓度为1.0 mg/mL。
6.按照权利要求2所述的l,5-AG方法，其特征在于：步骤2中所述PROD浓度为0.5mg/mL。
7.按照权利要求2所述的l,5-AG方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述工作电极的孵育温度为37°C，孵育时间为30分钟。
8.按照权利要求2所述的l,5-AG方法，其特征在于：所述步骤3和步骤4中所述DPV扫描所用的溶液为pH值为7.4的PBS溶液。
9.按照权利要求2所述的l,5-AG方法，其特征在于：步骤3和步骤4中所述的DPV的扫描范围为-0.1 V ~ 0.6 V，扫描速率为100 mV/s。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
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Application publication date: 20190820 Assignee: Guilin Xinjiatianxia Food Co.,Ltd. Assignor: GUILIN University OF ELECTRONIC TECHNOLOGY Contract record no.: X2023980046008 Denomination of invention: A Method for Detecting Cholesterol Based on RGO-CS-Fc/Pt NPs Nanocomposites Granted publication date: 20210917 License type: Common License Record date: 20231108 |