CN111413384B - 一种基于RGO-CS-Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于RGO‑CS‑Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法，采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO‑CS‑Hemin/Au NPs修饰在丝网印刷电极表面，将GPC3 aptamer负载在RGO‑CS‑Hemin/Au NPs材料表面，适配体因以单链结构的形式而呈不稳定的空间结构分布在生物传感界面上。在生物传感界面中加入GPC3后，GPC3能够与GPC3‑Apt特异性结合形成蛋白‑适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在工作电极表面，通过DPV法实现对GPC3的定量检测。该方法操作简单、省时、费用低且具有较低的检测限。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于电化学生物传感器检测GPC3的方法。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)是硫酸肝素蛋白聚糖的一种，粘附在细胞膜上，在肝细胞癌(HCC)中经常被发现升高。然而，GPC3在正常肝组织和良性肝损害中含量极低。因此，GPC3目前被用作诊断生物标志物用于HCC早期诊断和治疗。GPC3检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法、流式免疫分析法、电化学免疫传感器等。公告号CN 105717104 B的发明专利，涉及一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法。利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测GPC3表达情况。公布号为CN 106636108 A的发明专利，涉及一种靶向GPC3的核酸适配体及其应用。利用结合毛细管电泳的SELEX技术筛选与肝癌标志物GPC3特异性结合的核酸适配体，获得具有特异结合GPC3的适配体序列G625。所述的GPC3核酸适配体可用于设计、制备肝癌血清诊断试剂、肝癌组织切片染色试剂以及肝癌相关的活体成像造影剂。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求高，需要建立一种快速、灵敏、操作简便的GPC3检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原氧化石墨烯-壳聚糖-血红素/纳米金（RGO-CS-Hemin/Au NPs）复合材料结合适配体来检测GPC3的方法，提高灵敏度、增强特异性。
为了解决该技术问题，采用电沉积技术以及静电吸附作用制作了基于RGO-CS-Hemin/Au NPs的GPC3纳米适配体电化学生物传感器。利用石墨烯及Au NPs对GPC3适配体的高负载能力和良好的电子传递效应，以及GPC3适配体对GPC3的特异性识别作用，采用电化学工作站的微分脉冲伏安法 (DPV)记录还原氧化石墨烯-血红素-壳聚糖（RGO-CS-Hemin）中血红素（Hemin）的峰电流变化值。对孵育温度、孵育时间、磷酸盐缓冲液（PBS）的pH值、GPC3适配体浓度以及RGO-Hemin-CS纳米复合材料的用量进行了优化，绘制了工作曲线，通过工作曲线计算得到实际检测样本中GPC3浓度。与现有的方法相比，操作相对简单，特异性高，时间和费用的消耗更少，能达到7.9 ng/mL的检测限。
本发明的检测原理为：采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO-CS-Hemin/AuNPs修饰在丝网印刷电极表面。通过纳米技术以及分子间作用力将GPC3适配体负载在RGO-CS-Hemin/Au NPs材料表面，此时适配体因以单链结构的形式而呈不稳定的空间结构分布在生物传感界面上。而后将GPC3蛋白导入到上述生物传感界面，因GPC3蛋白能与GPC3适配体发生特异性结合形成蛋白-适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在电极表面。以PBS溶液（0.2 mol/L， pH 6.0）为支持电解液，通过电化学工作站，使用循环脉冲伏安法（DPV）法检测RGO-CS-Hemin中Hemin的电化学信号变化值（扫描速率为0.01V/s，扫描的电压区间是0.2 V-1.2 V），并描绘出该电流与GPC3浓度的工作曲线，从而实现对GPC3的检测。
本发明按照以下步骤进行：
步骤1：RGO-CS-Hemin材料的制备
(1)还原性氧化石墨烯（RGO）的制备：氧化石墨烯（GO）倒入蒸馏水中，使用超声细胞破碎仪超声，使其充分溶解均匀，制成GO水溶液。取上述GO水溶液置于烧杯中，加入抗坏血酸（AA）使其还原GO，得RGO。
(2)还原性氧化石墨烯-血红素(RGO-Hemin)的制备：将Hemin用氨水溶解，并用蒸馏水稀释，得到Hemin溶液。将还原性氧化石墨烯（RGO）与Hemin混合，加入水合肼后恒温水浴，得RGO-Hemin复合物。
(3)还原性氧化石墨烯-壳聚糖-血红素（RGO-CS-Hemin）复合材料的制备：将壳聚糖（CS）用乙酸溶解，得到CS溶液。取CS溶液加入到RGO-Hemin复合物中，以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）活化，离心分离得RGO-CS-Hemin悬浊液。
步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)将丝网印刷电极（SPE）置于H2SO4溶液中，进行循环伏安扫描，得到活化后的丝网印刷电极，用水冲洗干净。
(2)将活化后的丝网印刷电极置入氯金酸溶液中，进行恒电位沉积，沉积结束后用水将电极冲洗干净，得到Au NPs/SPE电极。
(3)将Au NPs/SPE电极用戊二醛浸泡，用PBS洗涤，吹干，而后滴加RGO-CS-Hemin悬浊液孵育一段时间，PBS洗涤，晾干，得到RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE电极。
(4)取氨基化的GPC3适配体（GPC3 aptamer）滴加到传感器界面，孵育一段时间，用PBS溶液洗涤未固定的GPC3适配体，滴加牛血清蛋白（BSA）溶液进行封闭，得到GPC3aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE传感界面，晾干备用。
步骤3：GPC3的标准曲线绘制
(1)将标准GPC3溶液滴加到步骤2得到的GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPCE传感界面，孵育一段时间，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用。
(2)将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流。
(3)分别对不同浓度的GPC3进行检测，绘制标准曲线，计算出该方法的最低检测限。
步骤4：实际血清样品中GPC3的检测
(1)在步骤2得到的GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE传感界面，滴加待测实际血清样品，孵育一段时间，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用。
(2)将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流。
(3)根据步骤3所述标准曲线，计算得到所述待测实际血清样品中GPC3的浓度。
进一步，所述步骤1中乙酸溶液为100mL 1%。
进一步，所述步骤1中EDC/NHS浓度为10 mmol/L。
进一步，所述步骤1中每1mg Hemin用1μL氨水溶解后用1mL蒸馏水稀释。
进一步，所述步骤1中水合肼为质量分数为80%，用量为8 μL。
进一步，所述步骤1中将GO和Hemin材料混合，以水合肼还原，60°C水浴4 h后离心，得到RGO-Hemin悬浊液。
进一步，所述步骤2中H2SO4溶液浓度为0.5 mol/L。
进一步，所述步骤2中扫描电压为-0.4 V- 1.2 V，扫描段数为20。
进一步，所述步骤2中将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描后，用纯水冲洗干净后，再将电极置于氯金酸溶液中分别进行循环伏安扫描，最后用纯水冲洗晾干备用。
进一步，所述步骤2中，使用的氯金酸浓度为0.01%，沉积电位为-0.5 V，沉积时间120s。
进一步，所述步骤2中，戊二醛浓度为2.5%。
进一步，所述BSA溶液浓度为0.5%，PBS的浓度为0.2 mol/L，pH值为6.0。
进一步，步骤2中GPC3适配体浓度为0.1 μmol/L。
进一步，GPC3适配体在电极的孵育温度为25°C，孵育时间为3小时。
优选，所述步骤3中GPC3的最佳孵育温度为25°C，最佳孵育时间为20min。
优选，所述步骤3和4中的线性扫描范围0.2 V-1.2 V，扫描速率为0.01 V/s。
其中，步骤1为步骤2提供一种高导电率的纳米复合材料。步骤2构成特异性识别GPC3的生物传感界面，并有利于电子的传递。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中GPC3的电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤3的GPC3的工作曲线为步骤4的实际样本中GPC3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，实现GPC3的检测。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、RGO-CS-Hemin/Au NPs纳米复合材料具有比表面积大，导电性强，可以有效地将GPC3适配体固定到电极的表面，以保证传感器的稳定性，提高检测能力。与传统的传感器相比，新型纳米材料传感器不仅体积更小，速度更快，而且精度更高，可靠性更高。
2、 采用以GPC3适配体为识别探针检测GPC3的背景干扰小，能达到7.9 ng/mL的检测限。适配体和目标物之间的亲和力常常比抗原和抗体之间的亲和力强。此外，适配体比抗体更易被化学方法标记和修饰。
附图说明
图1 基于RGO-CS-Hemin/Au NPs结合适配体检测GPC3的原理图；
图2（A）RGO、（B）RGO-Hemin和（C）RGO-CS-Hemin的透射电镜图；
图3 电极表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图；
图4 基于RGO-CS-Hemin/Au NPs的GPC3纳米适配体传感器的工作曲线；其中图4A为不同GPC3浓度的DPV曲线，图4B为GPC3适配体传感器的工作曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于RGO-CS-Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法，检测原理见图1。将SPCE活化，通过恒电位沉积将Au NPs沉积在SPE电极的表面。通过静电吸附和戊二醛交联将RGO-Hemin-CS纳米复合材料固定在Au NPs /SPE的表面。而后，GPC3 aptamer通过戊二醛交联锚定在RGO-Hemin-CS/ Au NPs / SPE表面，此时适配体因以单链结构的形式而呈不稳定的空间结构分布在生物传感界面上。在生物传感界面中加入GPC3后，GPC3能够与GPC3aptamer特异性结合形成蛋白-适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在生物传感界面上。通过DPV法获得RGO-Hemin-CS中存在的Hemin（Fe（Ⅲ））/ Hemin（Fe（II）的电化学信号的变化值，从而实现GPC3的高灵敏度检测。
实施步骤如下：
1、RGO-CS-Hemin纳米复合材料的制备：称取5mg氧化石墨烯（GO），并将GO倒入于50mL的蒸馏水中，使用超声细胞破碎仪超声2h使其充分溶解均匀，制成 0.1 mg/mL的GO溶液。取10 mL上述GO溶液置于烧杯中，加入10 mg抗坏血酸（AA），置于恒温数显磁力加热搅拌器上持续搅拌12h，即得RGO；称取1mg的血红素(Hemin)，并加入10μL的氨水溶解，再加入1mL蒸馏水；将2 mg壳聚糖（CS）加入100 mL 1%的乙酸溶液中，搅拌均匀，得均一稳定的2.0 mg/mLCS溶液；取10 mL RGO悬液加入1mL Hemin溶液，再加入8μL 80%的水合肼，60℃恒温水浴4h，得到RGO-Hemin。以浓度为10 mmol/L 的EDC/NHS活化30 min后，加入CS溶液反应30 min，最后20000 r/min离心分离，得到RGO-CS-Hemin悬浊液。采用透射电镜（TEM）对RGO-CS-Hemin进行表征分析，见如图2所示。图2A为RGO的TEM图，RGO呈半透明片状结构。图2B为RGO-Hemin的TEM图，也呈片状结构，局部颜色加深。图2C为RGO-CS-Hemin的TEM图，有片状结构上有膜状小颗粒结构。
2、电极的预处理：丝网印刷电极（SPE）在使用前首先浸泡在0.5 mol/L H2SO4 溶液中进行循环伏安（CV）扫描，在-0.4V -1.2V的电压范围内扫描20段；扫描完成之后用水洗净，晾干，得到活化的SPE。
3、电极的修饰与生物传感界面的构建：将活化后的SPCE电极放入4mL 0.01%氯金酸溶液，在-0.5 V恒电位沉积120 s，沉积完成后用纯水洗涤3次，吹干得到Au NPs/SPE电极。将Au NPs/SPE用2.5%戊二醛浸泡15 min，用pH 6.0 PBS洗涤3次，吹干。而后滴加5μL的RGO-CS-Hemin悬浊液孵育30 min，PBS洗涤3次，晾干，得RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE。取2μL氨基化的GPC3适配体(5'-TAA CGC TGA CCT TAG CTG CAT GGC TTT ACA TGT TCC A-NH2-3')滴加于RGO-CS-Hemin /Au NPs/SPE传感界面上，孵育3 h，洗涤，滴加6μL 0.5%的BSA溶液进行封闭，晾干，得到GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE传感界面。采用扫描电镜（SEM）对电极表面不同修饰过程进行表征，见如图3所示。图3A为 SPE 电极的SEM图，其表面是一层均匀、无亮点的片状结构；图3B为Au NPs/SPE的SEM图，有大量亮点明显的分散在电极表面，这说明金纳米粒子（Au NPs）已经成功沉积在电极表面上；图3C 为RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE的SEM图，电极表面明显变暗，且多了一层黑色覆盖物；图3D为GPC3aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE的SEM图，电极表面明显有新附着物，分布不均匀，可知GPC3 aptamer已经成功固定在电极表面。
4、GPC3标准曲线的绘制：在GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin /Au NPs/SPE传感界面滴加2 µLGPC3溶液，25 ℃温度下孵育20min，用pH 6.0 PBS和蒸馏水清洗，吹干，得到工作电极。图3E为GPC3吸附在生物传感界面的SEM图，对比图3D可看出GPC3与GPC3适配体特异性结合后，电极表面结构变得平整。然后将上述所得的工作电极放到PBS支持液（0.2 mol/L，PH 6.0）中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰电流。不同GPC3浓度的DPV曲线图见图4A。GPC3浓度在0.01-10 µg/mL范围内时，传感器电流响应值（Y）与GPC3浓度（X）之间的关系呈线性，标准曲线见图4B，其线性回归方程为Y=5.7865-0.35609X相关系数为0.9889。将空白对照的三倍标准差定义为检测下限，计算GPC3的最低检测限为7.9 ng/mL。
5、实际血清样本中GPC3的检测：分别将已知浓度的GPC3溶液（1 μg/ mL，5 μg/mL，10 μg/mL）与血清按照1:1的比例混合，取2 μL上述混合液滴加在GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin /Au NPs/SPE电极表面，25 ℃温度下孵育20min，用pH 6.0 PBS和蒸馏水清洗，吹干，得到工作电极。按照步骤4所述，将工作电极置于上述PBS支持溶液中进行DPV扫描，记录电流值。根据步骤4的标准曲线Y=5.7865-0.35609X，计算可得到对应的实际血清样本中GPC3溶液的浓度，检测结果见表1。
表1 实际血清样本中GPC3的检测结果（测试(n=3)）
。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (1)
1.一种基于RGO-CS-Hemin /Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法，按以下步骤进行：
步骤1：RGO-CS-Hemin材料的制备
还原性氧化石墨烯RGO的制备：氧化石墨烯GO倒入蒸馏水中，溶解，制成GO水溶液；取制备好的GO水溶液，加入抗坏血酸使其还原GO，得RGO；
还原性氧化石墨烯-血红素RGO-Hemin的制备：将Hemin用氨水溶解，用蒸馏水稀释，得到Hemin溶液；将RGO与Hemin混合，将8μL质量分数为80%的水合肼加入到RGO和Hemin混合液进行还原，水浴反应后，离心得RGO-Hemin复合物；
还原性氧化石墨烯-壳聚糖-血红素RGO-CS-Hemin复合材料的制备：将壳聚糖用1%的乙酸溶液溶解，得到CS溶液；取CS溶液加入到RGO-Hemin复合物中，以浓度为10mmol/L的EDC/NHS活化，离心分离得RGO-CS-Hemin悬浊；
步骤2：电极的修饰与生物传感界面的构建
将丝网印刷电极置于0.5mol/L H2SO4溶液中，进行循环伏安扫描20段，电压范围为-0.4V -1.2V，得到活化后的丝网印刷电极，用水冲洗干净；
将活化后的丝网印刷电极置入4 mL 0.01%的氯金酸，沉积电压为-0.5 V，沉积时间120s；沉积结束后用水将电极冲洗干净，得到Au NPs/SPE电极；
将Au NPs/SPE电极用戊二醛浸泡，用6μL 0.5%的BSA溶液，吹干，而后滴加RGO-CS-Hemin悬浊液育，6μL 0.5%的PBS洗涤，晾干，得到RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE电极；
取氨基化的GPC3适配体滴加到传感器界面，孵育，用PBS溶液洗涤未固定的GPC3适配体，滴加牛血清蛋白溶液进行封闭，得到GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE传感界面，晾干备用；
步骤3：GPC3的标准曲线绘制
将标准GPC3溶液滴加到步骤2得到的GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPCE传感界面，孵育，温度为25°C，孵育时间为20分钟，用PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用；
将工作电极放入pH值为6 .0的PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，扫描范围为0.2V-1.2V，扫描速率为0 .01V/s，记录其峰电流；
分别对不同浓度的GPC3进行检测，绘制标准曲线，计算出该方法的最低检测限；
步骤4：实际血清样品中GPC3的检测
在步骤2得到的GPC3 aptamer /RGO-CS-Hemin/Au NPs/SPE传感界面，滴加待测实际血清样品；孵育，温度为25°C，孵育时间为20分钟，用pH值为6 .0的PBS溶液清洗，得到工作电极，晾干备用；
将工作电极放入PBS溶液中，采用电化学工作站的DPV扫描，扫描范围为0.2V-1.2V，扫描速率为0.01V/s；记录其峰电流；根据步骤3所述标准曲线，计算得到所述待测实际血清样品中GPC3的浓度。
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