CN112763563A - 一种基于复合材料改性laps芯片检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法 - Google Patents

一种基于复合材料改性laps芯片检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于PROD/RGO‑CS‑Fc/Au NPs复合物修饰的LAPS生物传感器检测1,5‑AG的方法。在经过预处理的LAPS芯片表面，使用MPTES进行疏基硅烷化，将AuNPs以S‑Au键结合在硅烷化后的LAPS芯片表面，将复合材料RGO‑CS‑Fc固定，使用戊二醛作为交联剂，PROD交联，构成LAPS生物传感器，用来检测1,5‑AG。本专利所形成的PROD/RGO‑CS‑Fc/Au NPs/SiO2‑Si复合结构，具有微芯片系统独特结构，能集催化、氧化、电位反应于一体，构成一种具有微芯片系统的便携式、高灵敏检测1,5‑AG的新型结构，能快速高灵敏检测1,5‑AG。

Description

一种基于复合材料改性LAPS芯片检测1,5-脱水葡萄糖醇的 方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于改性LAPS芯片来检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法。
背景技术
1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-anhydroglueitol，1,5-AG）是一种天然存在的六碳单糖，其吡喃环结构具有代谢稳定性，是一种反应短期血糖水平的重要生物标志物。CN110988165A采用液相质谱色谱联用的方法，实现对唾液中1,5-AG的检测，但是该方法需要专用的仪器和实验场地，需要训练有素的人员，无法满足现场以及实时检测的需要。CN111575339A利用不同辅酶的酶学方法定量生物试样中1,5-AG，该方法需要对多种酶进行频繁操作，过程繁琐，实用性不佳。CN108918447A利用表面镀有金电极的AT切型的石英晶振片作为基底，苯硼酸类化合物作为特异性识别分子，用于1,5-AG的检测，该方法具有较低的检测限，但是其检测电极的制备难度较大。CN110146580A通过RGO/PT/Pt-PdNPs复合材料修饰丝网印刷电极，而后结合PROD酶用于对1,5-AG的检测，该方法降低了成本和操作难度，提高了灵敏度。CN106442649A则通过将纳米金锚定在疏基硅烷化的硅片表面然后将PROD酶固定在纳米金上，构成EIS电化学生物传感器，通过酶沉积银原理检测1,5-AG，该方法具有较低的检测限，特异性良好，但需要添加反应试剂进行检测。为此，需要建立便携式、降低操作难度和成本的1,5-AG的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/SiO2-Si复合物，并利用该复合物构建一种LAPS芯片系统，实现1,5-AG的便携式检测。
为了解决该技术问题，通过-S-Au键的紧密连接作用，成功使用RGO-CS-Fc/AuNPs复合纳米材料对LAPS芯片的表面进行改性。并通过戊二醛的交联作用将PROD酶固定到了改性LAPS芯片表面，形成PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/SiO2-Si复合物结构，该复合物既是反应物又是催化剂，集催化、氧化、电位反应于一体，构成LAPS生物传感器，用于1,5-AG的检测。通过数据采集卡和LabVIEW上位机程序对LAPS生物传感器的偏置电压和光电流数据进行采集；并对构建LAPS生物传感器的吡喃糖氧化酶的浓度，PBS溶液的pH值，AuNPs的用量，RGO-CS-Fc复合材料的用量，孵育时间，孵育温度等条件进行了优化，绘制了标准曲线，通过与标准工作曲线对比得到准确的1,5-AG浓度。与现有的方法相比，操作相对简单，特异性高，时间和费用的消耗更少，实现了便携式检测，能达到5.14 µg/mL的检测限。
本发明按照以下步骤进行：
步骤一：RGO-CS-Fc/AuNPs复合材料的制备
1. AuNPs的制备
将氯金酸加热搅拌直至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，搅拌直至溶液从淡黄色变为酒红色；冷却至室温，得到AuNPs。
2. RGO的制备
称取氧化石墨烯（GO）置于超纯水中，用细胞破碎仪进行超声破碎，得到GO原液；在加热条件下使用抗坏血酸进行还原，便可得到RGO。
3. CS-Fc的制备
将CS溶于乙酸溶液，加入二茂铁甲酸，用NHS/EDC进行催化，持续搅拌至溶液颜色变为红棕色，便得到CS-Fc溶液。
4. RGO-CS-Fc的制备
将RGO和CS-Fc溶液混合，并用NHS/EDC进行催化，持续加热搅拌一定时间后，离心并重溶于超纯水，得到RGO-CS-Fc溶液。
步骤二：LAPS传感器敏感单元的修饰
1.将LAPS芯片分别置于乙醇和丙酮溶液中，使用超声清洗仪超声清洗。然后用纯水冲洗干净，干燥LAPS芯片。
2.在LAPS芯片表面滴加NaOH活化后，用纯水冲洗干净，干燥LAPS芯片表面。
3.对活化后的LAPS芯片表面进行硅烷化处理。
4.使用自然沉降法，将AuNPs沉降在硅烷化后的LAPS芯片上。
5.在沉降了AuNPs的LAPS芯片上，滴加RGO-CS-Fc悬液，至自然干燥。
步骤三：LAPS传感器检测系统的构建
1. 通过戊二醛将PROD交联到LAPS芯片表面，构成LAPS生物传感器。
2. 将LAPS生物传感器、数据采集卡、LabVIEW数据采集软件、激光二极管等组合，构成LAPS生物传感器检测系统。
步骤四：1,5-AG标准曲线的绘制
1. 在LAPS生物传感器上滴加不同浓度的1,5-AG标准溶液，孵育，用PBS溶液清洗；利用数据采集卡和LabVIEW数据采集软件，对LAPS检测系统输出的光电流和偏置电压数据进行采集、处理和分析。
2. 分别对不同浓度的1,5-AG标准溶液进行检测，绘制标准曲线，计算出该方法的最低检测限。
步骤五：实际样品中1,5-AG的检测
1. 将待测样本滴加到步骤3得到的LAPS生物传感器界面进行孵育，用PBS溶液清洗。
2. 在修饰后的LAPS芯片上滴加PBS溶液，采用数据采集卡和LabVIEW数据采集软件，对LAPS检测系统输出的光电流和偏置电压数据进行采集、处理和分析。
3. 根据步骤4所述标准曲线，计算得到所述待测实际样品中1,5-AG的浓度。
进一步，所述步骤1中氯金酸为0.01%。
进一步，所述步骤1中柠檬酸钠为0.1%。
进一步，所述步骤1中抗坏血酸为300 mg。
进一步，所述步骤1中NHS/EDC浓度为10 mmol/L。
进一步，所述步骤2中NaOH浓度为1 mol/L。
进一步，所述步骤3中戊二醛为2.5%。
进一步，所述步骤4中PBS的pH值为7.4。
优选步骤2中AuNPs的用量为25 µL。
优选步骤2中RGO-CS-Fc的用量为10 µL。
优选步骤3中PROD浓度为1 mg/mL。
优选步骤3中1,5-AG与PROD的最佳孵育温度为25℃，最佳孵育时间为30 min。
其中，步骤1为步骤2提供一种高导电率，高比表面积和良好的生物相容性的纳米复合材料。步骤2使用步骤1制备的材料对LAPS芯片进行修饰，提高芯片电导率和酶结合位点。步骤3是在步骤2的基础上构建了能特异性检测1,5-AG的生物传感界面。步骤3中生物传感界面的构建是步骤4和步骤5中1,5-AG的电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤4的1,5-AG的工作曲线为步骤5的实际样本中1,5-AG浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-5相互支撑，共同作用，才能利用以PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs为识别探针实现1,5-AG的检测。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本专利形成的PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/SiO2-Si复合结构具有创造性，由表征图2可以看出，该复合结构具有微芯片系统独特结构，在检测1,5-AG时，既是反应物又是催化剂，集催化、氧化、电位反应于一体，构成一种具有微芯片系统，构建便携式、高灵敏检测1,5-AG的新型检测方法，能实现快速便携式检测1,5-AG。
附图说明
图1LAPS传感器检测系统的构建及检测原理图；
图2LAPS表面不同修饰过程的扫描电子显微镜表征图，(A) 裸LAPS芯片；(B) 硅烷化处理的LAPS芯片；(C) Au NPs修饰的LAPS芯片；(D) RGO-CS-Fc /Au NPs修饰的LAPS芯片；(E) PROD/RGO-CS-Fc /Au NPs修饰的LAPS芯片；(F) 1,5-AG/PROD/RGO-CS-Fc /Au NPs修饰的LAPS芯片；
图3为PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/SiO2-Si复合结构生物传感器的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
图1是 LAPS传感器检测系统的构建及检测原理：在经过NaOH预处理的LAPS芯片表面，使用MPTES进行疏基硅烷化，以巯基终止于表面。将AuNPs以-S-Au键结合在硅烷化后的LAPS芯片表面，通过物理吸附将复合材料RGO-CS-Fc固定到LAPS芯片表面，再使用戊二醛作为交联剂，将PROD交联到LAPS芯片表面，形成PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/SiO2-Si复合物，构成LAPS生物传感器。当LAPS生物传感器用于1,5-AG检测时，1,5-AG能与复合物中PROD发生催化氧化反应，生成H2O2与1.5-脱水果糖；复合物中AuNPs具有良好的催化氧化性，使得H2O2与复合物中RGO-CS-Fc的Fe2+发生氧化还原反应变成Fe3+；反应方程为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由上述反应方程式可知，在LAPS生物传感器表面发生的氧化还原反应，会打破LAPS生物传感器表面原有的电位平衡，引起电位偏移。不同 1,5-AG 浓度会在LAPS生物传感器表面引起不同的电位偏移，导致光电流-偏置电压曲线发生偏移。采用数据采集卡和LabVIEW设计的数据采集软件，对LAPS检测系统输出的光电流和偏置电压数据进行采集、处理和分析。因此，LAPS芯片表面的复合物既是反应物又是催化剂，集催化、氧化、电位反应于一体，构建一种便携式、高灵敏检测1,5-AG的新型检测方法。
实施步骤如下：
步骤一：RGO-CS-Fc/Au NPs的制备
1、RGO-CS-Fc的制备：
（1）取30 mg GO溶于30 mL超纯水，使用细胞破碎仪超声破碎120 min，得GO悬浮液。在GO悬浮液中加入300 mg 抗坏血酸（AA），并在60℃水浴下搅拌4h，可得到RGO悬浮液。将RGO悬浮液在4000转/分离心5 min，并取沉淀再次溶于纯水。再次在4000转/分离心5min，取其沉淀可得较为纯净的RGO，可烘干备用。
（2）取100 mg CS溶于100 mL 1%的乙酸溶液，持续搅拌至无气泡。然后在CS溶液中加入150 mg二茂铁甲酸，并以EDC/NHS作为活化剂，在50℃环境中，持续搅拌24h，可得CS-Fc溶液。将CS-Fc溶液在6000转/分转速下离心15 min，得到CS-Fc溶液。
（3）取15 mg RGO重新溶于15 mL超纯水，制成RGO悬浮液。然后将其与10 mL CS-Fc溶液混合，EDC/NHS为催化活化剂，50℃下持续搅拌4h，以20000转/分高速离心，取下层重新溶于超纯水可得RGO-CS-Fc悬浮液。
2、AuNPs的制备
取50 mL的0.01%的氯金酸溶液置于干净的烧杯中，持续搅拌并不断加热至100℃。而后向氯金酸溶液中，缓缓加入2.5 mL的0.1%的柠檬酸钠溶液。在100度条件下持续搅拌，直至溶液由淡黄色变为酒红色。自然冷却至室温，便可得到AuNPs，放在4℃的冰箱中备用。
步骤二：LAPS生物传感器敏感单元的修饰
1、使用前将LAPS芯片分别置于乙醇和丙酮溶液中，使用超声清洗仪超声清洗15分钟。然后使用纯水冲洗干净，干燥。如图2A所示，为裸LAPS芯片的扫面电子显微镜表征图，其表面光滑平整。
2、滴加20 uL NaOH(1mol/L)，到清洗干净的LAPS芯片表面，静置活化30min，而后使用纯水清洗干净并干燥。
3、对LAPS芯片表面进行硅烷化，即在活化后的LAPS芯片上滴加20 uL MPTES，在4℃的冰箱中放置12h以上。图2B为硅烷化处理后的LAPS芯片的扫面电子显微镜表征图，其为硅烷化试剂在LAPS芯片表面水解反应产物的表面形貌。
4、使用自然沉降法，在硅烷化后的LAPS芯片上滴加25 uL直径为5-20 nm的AuNPs溶液于硅烷化的LAPS芯片上，静置8h后用纯水清洗，得到AuNPs修饰的LAPS芯片；其扫面电子显微镜表征结果如图2C所示，此时可以明显的看到发光的颗粒物。
5、在沉降了AuNPs的LAPS芯片上，滴加10 uL的RGO-CS-Fc悬液，至自然干燥，可得到特异性识别分子负载界面RGO-CS-Fc/Au NPs/LAPS，其扫面电子显微镜表征图见图2D，可以看到很明显的RGO-CS-Fc片状物，以及发光的Au NPs粒子。
步骤三：LAPS生物传感器检测系统的构建
1、在修饰了RGO-CS-Fc的LAPS芯片上滴加2.5%戊二醛溶液，静置15min，之后使用纯水清洗干净。
2、而后滴加20 uL 1 mg/mL的 PROD，在25℃条件下孵育1h后，清洗干净。此时基于LAPS芯片的生物传感界面构建完成，如图2E所示为生物传感界面的扫面电子显微镜表征图，可以看到独特的PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/SiO2-Si复合物结构，表明PROD酶已经牢固的结合在了LAPS芯片表面。
3、将制备好的LAPS生物传感器、LabVIEW上位机、数据采集卡、恒功率激光管组成LAPS检测系统，对1,5-AG进行检测。
步骤四：1,5-AG标准曲线的绘制
在LAPS生物传感器界面滴加20 µL的1,5-AG溶液，25℃ 温度下孵育30 min，用pH7.4的PBS溶液和蒸馏水清洗，吹干，得到LAPS生物传感器；LAPS生物传感器的扫面电子显微镜表征图，如图2F所示，其显示了1,5-AG与PROD酶反应后产物的LAPS芯片表面形貌图。然后，在LAPS生物传感器上放置装有PBS溶液（pH为7.4）的电解池，通过数据采集卡和LabVIEW上位机程序对LAPS生物传感器的偏置电压和光电流数据进行采集。如图3所示，1,5-AG的浓度在10 μg/mL到350 μg/mL内，传感器的电压偏移量与1,5-AG的浓度呈线性关系。线性方程为ΔV=0.44273C+50.68317，其中ΔV是不同1,5-AG浓度的归一化光电流0.5处的光电流-偏置电压曲线的电压偏移量，C是1,5-AG的浓度；R² =0.97414。通过公式CLOD=3Sb/b计算得到传感器的检测限为5.14 μg/mL，其中Sb为重复检测空白样本的标准偏差，b为标准曲线的斜率。
步骤五：实际血清样本中葡萄糖的检测
选取4份血糖浓度分别为3.78 mmol/L (样本1)，5.33 mmol/L (样本2)，11.32mmol/L (样本3)和14.23 mmol/L (样本4)的血清样品，以1：1的比例分别与1,5-AG的标准溶液0 μg/mL，20 μg/mL，100 μg/mL和300 μg/mL充分混合，制成混合血清样本。在PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/LAPS传感器界面滴加20 µL的混合血清样本溶液，25℃温度下孵育30min，用pH 7.4的PBS溶液和蒸馏水清洗，吹干，得到LAPS生物传感器。根据步骤4所述，通过数据采集卡和LabVIEW上位机程序对LAPS生物传感器的偏置电压和光电流数据进行采集。根据步骤4的标准曲线ΔV=0.44273C+50.68317计算可得到对应的实际血清样本中1,5-AG的浓度。检测结果见表1。
表1实际血清样本中1,5-AG的检测结果
Figure 73147DEST_PATH_IMAGE002
。

Claims (9)

1.一种基于复合材料改性LAPS芯片检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：RGO-CS-Fc/Au NPs复合材料的制备
（1）AuNPs的制备
将氯金酸加热搅拌直至沸腾，加入柠檬酸钠溶液，搅拌直至溶液从淡黄色变为酒红色；冷却，得到Au NPs；
（2）RGO的制备
称取氧化石墨烯置于超纯水中，用细胞破碎仪进行超声破碎，得到GO原液；在加热条件下使用抗坏血酸进行还原，得到RGO；
（3）CS-Fc的制备
将CS溶于乙酸溶液，加入二茂铁甲酸，用NHS/EDC进行催化，持续搅拌至溶液颜色变为红棕色，得到CS-Fc溶液；
（4）RGO-CS-Fc的制备
将RGO和CS-Fc溶液混合，用NHS/EDC进行催化，持续加热搅拌，离心并重溶于超纯水，得到RGO-CS-Fc溶液；
步骤二：LAPS传感器敏感单元的修饰
（1）将LAPS芯片依次置于乙醇和丙酮溶液中，使用超声清洗仪超声清洗；然后用纯水冲洗干净，干燥电极表面；
（2）在LAPS芯片表面滴加NaOH活化，用纯水冲洗，干燥LAPS芯片表面；
（3）对活化后的LAPS芯片表面进行硅烷化处理；
（4）使用自然沉降法，将纳米金沉降在硅烷化后的LAPS芯片上；
（5）在沉降了AuNPs的LAPS芯片上，滴加RGO-CS-Fc悬液，干燥；
步骤三：LAPS传感器检测系统的构建
（1）通过戊二醛PROD交联到LAPS芯片表面，得到具有PROD/RGO-CS-Fc/Au NPs/SiO2-Si复合物结构的LAPS生物传感器；
（2）将LAPS生物传感器、数据采集卡、LabVIEW数据采集软件、激光二极管等组合，构成LAPS生物传感器检测系统；
步骤四：1,5-AG标准曲线的绘制
（1）在LAPS芯片表面上滴加不同浓度的1,5-AG标准溶液，孵育，用PBS溶液清洗；利用数据采集卡和LabVIEW数据采集软件，对LAPS检测系统输出的光电流和偏置电压数据进行采集、处理和分析；
（2）分别对不同浓度的1,5-AG标准溶液进行检测，绘制标准曲线，计算出该方法的最低检测限；
步骤五：实际样品中1,5-AG的检测
（1）将待测样本加到步骤3得到的LAPS生物传感器界面进行孵育，用PBS溶液清洗；
（2）在修饰后的LAPS芯片上滴加PBS溶液，采用数据采集卡和LabVIEW数据采集软件，对LAPS检测系统输出的光电流和偏置电压数据进行采集、处理和分析；
（3）根据步骤4所述标准曲线，计算得到所述待测实际样品中1,5-AG的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤1中所述氯金酸浓度为0.01%，所述柠檬酸钠为0.1%，所述抗坏血酸为300 mg，所述NHS/EDC浓度为10 mmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，步骤2中所述NaOH浓度为1 mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤3中所述戊二醛为2.5%。
5.根据权利要求1所述的方法，步骤4中所述PBS的pH值为7.4。
6.根据权利要求1所述的方法，步骤2中所述AuNPs的用量为25 µL。
7.根据权利要求1所述的方法，步骤2中所述RGO-CS-Fc的用量为10 µL。
8.根据权利要求1所述的方法，步骤3中所述PROD浓度为1 mg/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，步骤3中所述的1,5-AG与PROD的孵育温度为25℃，孵育时间为30 min。
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