CN111693571A

CN111693571A - 一种基于光寻址电位传感器检测gpc3的方法

Info

Publication number: CN111693571A
Application number: CN202010578793.0A
Authority: CN
Inventors: 李桂银; 周治德; 赵乐; 陈敏
Original assignee: Guilin University of Electronic Technology
Current assignee: Guilin University of Electronic Technology
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111693571B

Abstract

一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法：将LAPS芯片、光源驱动电路、信号放大电路、和LabVIEW平台组成了LAPS实时测试系统。设计合成了AuNPs/PEI‑rGO复合材料；将AuNPs/PEI‑rGO和GPC3‑Apt修饰在LAPS芯片形成敏感单元。在敏感单元上滴加GPC3标准溶液，形成LAPS的测试基片；在外加偏置电压作用下，LAPS测试基片上GPC3与GPC3‑Apt的特异性结合导致敏感单元表面的电势的改变，I‑V曲线产生相应的偏移；该偏移量与GPC3浓度在0.1‑100μg/mL表现出良好的线性关系，实现了对GPC3的检测。

Description

一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法。

背景技术

Glypican-3（GPC3）即磷脂酰肌醇蛋白多糖3，检测方法主要方法有荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法（ELISA）、电化学分析方法等。免疫学方法测定血清GPC3其检测敏感性差而难以临床转化应用。公开号为CN 106645724A的发明专利，公开了一种循环肿瘤细胞表面标志分子GPC3的检测方法，通过对血液进行红细胞裂解，利用纳米技术使剩余有核细胞全部平铺富集在纳米基底上固定，用细胞核荧光染料DAPI标记出所有细胞，用GPC3一抗孵育所有细胞，再用标记有FITC荧光基团的二抗孵育，最后通过高通量技术扫描。公开号为CN101290318 B的发明专利公开了一种用于诊断肝癌的ELISA试剂盒。但方法操作繁琐、复杂，费用昂贵。光寻址电位传感器（Light Addressable Potentionmetric Sensor，LAPS）是一种基于场效应结构的空间分辨生化传感器，无标记的光电流大小可以检测 LAPS 芯片敏感单元的电位变化，在稳定性、灵敏度、响应速度等方面具有优秀的性能，是蛋白质芯片检测的新方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法。首先设计一种金纳米粒子/聚乙烯亚胺-还原氧化石墨烯（AuNPs/PEI-rGO）复合材料，将AuNPs/PEI-rGO复合材料和GPC3适配体（GPC3-Apt）修饰在 LAPS 芯片形成敏感单元，设计了一种能特异性检测血清中GPC3水平的光寻址电位传感器。该方法具有高稳定性、高灵敏度、检测时间短、所需的样品数量少等。

本发明的检测原理：将LAPS 测试基片、光源驱动电路、信号放大电路、和 LabVIEW平台组成了 LAPS 实时测试系统。设计合成了金纳米粒子/聚乙烯亚胺-还原氧化石墨烯（AuNPs/PEI-rGO）复合材料，将 AuNPs/PEI-rGO 和 GPC3-Apt 修饰在 LAPS 芯片形成敏感单元。在 LAPS 敏感单元上滴加 GPC3 标准溶液，形成 LAPS 的测试基片。将 LAP的测试基片放到 LAPS 测试系统，在外加偏置电压作用下，LAPS 测试基片上 GPC3与 GPC3-Apt 的特异性结合导致敏感单元表面的电势的改变，（I-V）曲线产生相应的偏移。该偏移量与GPC3 浓度在 0.1-100μg/mL 表现出良好的线性关系，实现对GPC3的检测。本发明按照以下步骤进行：

步骤1：AuNPs/PEI-rGO 复合材料的制备

（1）首先，取氯金酸溶液放入圆底烧瓶中，搅拌直至沸腾。然后将柠檬酸钠溶液缓缓加入沸腾了的氯金酸溶中，溶液继续维持沸腾状态，搅拌后，溶液的颜色从无色变蓝色再变为酒红色，最终冷却到室温；

（2）以氧化石墨烯（GO）为原料，利用抗坏血酸为还原剂，制得还原氧化石墨烯（rGO）的稳定分散液，其次与 PEI混合并回流加热。得到的黑色分散液使用超纯水洗涤，离心，在室内空气中干燥；

（3）通过简单的方法合成AuNPs/PEI-rGO复合材料。将PEI-rGO 和@AuNPs 混合过夜。将得到的混合物离心。沉淀物最终分散在蒸馏水中。

步骤2：LAPS 芯片敏感单元的构建

（1）首先将硅片放置在溶液（H₂O₂和浓H₂SO₄）中浸泡，然后将硅片依次置于乙醇、丙酮和纯水中，于超声清洗机中超声清洗，最后静置后用纯水清洗干净；

（2）在芯片工作面滴加NaOH 溶液，清洗干净，其次使得 LAPS 芯片表面被氨基硅烷化试剂（APTES）硅烷化，使得LAPS 芯片表面含有大量的氨基（-NH₂），用纯水清洗三次，得到氨基硅烷化 LAPS芯片（APTES-LAPS芯片），以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）活化APTES-LAPS芯片；

（3）在活化的APTES-LAPS芯片表面继续滴加AuNPs/PEI-rGO 溶液，在恒温孵育箱中孵育，清洗干净，提高导电性的同时可以增加 GPC3-Apt 的负载量，得到AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS 芯片；

（4）在AuNPs/PEI-rGO/APTES的基础上滴加GPC3-Apt溶液，在恒温孵育箱中孵育后用缓冲液清洗晾干备用，得到GPC3-Apt/AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS 敏感单元。

步骤3：GPC3的工作曲线绘制

（1）在GPC3-Apt/AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS 敏感单元滴加GPC3标准液形成 LAPS 的测试基片，浸入到PBS 缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，（I-V）曲线产生相应的偏移，记录LAPS系统的偏移电压值；

（2）根据LAPS系统的偏移电压值与GPC3浓度的关系，绘制工作曲线。并计算出该方法的最低检测限。

步骤4：待测样品中GPC3的检测

（1）用待测样品制备的LAPS 芯片敏感单元浸入到PBS 缓冲液里面，（I-V）曲线产生相应的偏移，记录LAPS系统的偏移电压值；

（2）根据步骤3所得到的GPC3的工作曲线，计算待测样品中GPC3的浓度。

优选步骤1中rGO溶液浓度为0.5mg/mL。

优选步骤1中PEI浓度为3%。

优选步骤2中H₂O₂和浓H₂SO₄体积比3:7。

优选步骤2中NaOH溶液浓度为1.0 mol/L。

优选步骤2中EDC/NHS浓度为10 mmol/L。

优选步骤2中芯片的孵育温度为25°C。

优选步骤3中PBS 缓冲液的pH值为5.7。

优选所述步骤3中的偏置电压扫描范围-2 V ~2V。

其中，步骤1通过简单混合法合成了 AuNPs/PEI-rGO纳米复合材料。AuNPs/PEI-rGO 具有优异导电性和大比表面积，增加 GPC3-Apt 的负载量。为步骤2提供了一个良好的基础。步骤2中构建了 LAPS 芯片敏感单元，一种电解质/绝缘层/硅片所构建的敏感单元，利用GPC3适配体和GPC3蛋白的特异性结合以及AuNPs/PEI-rGO纳米复合材料优异导电性的性质，通过（I-V）曲线产生相应的偏移量来实现GPC3检测的目的。步骤2中LAPS 芯片敏感单元的构建为步骤3和步骤4中GPC3的检测中必不可少的关键步骤。步骤3的GPC3的工作曲线为步骤4的实际样本中GPC3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能实现GPC3的检测。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.目前一般采用免疫法测定血清GPC3水平，因其检测敏感性差而难以临床转化应用，而LAPS 有很多优点，例如强的光学地址指定功能、高稳定性、高的灵敏度、检测时间短、所需的样品数量少等，已经作为生物传感技术的新星在发展。

2.AuNPs/PEI-rGO 具有优异导电性和大比表面积，在外加偏置电压作用下，LAPS测试基片上 GPC3与 GPC3-Apt 的特异性结合导致敏感单元表面的电势的改变，（I-V）曲线产生相应的偏移。该偏移量与 GPC3 浓度在 0.1-100μg/mL 表现出良好的线性关系，实现对GPC3的检测。

3.构建基于光寻址电位传感器（LAPS）检测 GPC3 的适配体纳米传感器，结合适配体的特异分子识别和 LAPS 快速响应，提高传感器的特异性，降低传感器的检测限，最低检测限能达到0.04 μg/mL。

附图说明

图1 一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的原理图；

图2 AuNPs/PEI-rGO复合纳米材料的透射电镜图；其中（A）为rGO，（B）为AuNPs，（C）为AuNPs/PEI-rGO；

图3 构建LAPS测试基片的各个阶段的扫描电镜（SEM）图；其中：(A)为裸 LAPS 芯片，(B) 为APTES- LAPS 芯片，(C) 为AuNPs / PEI-rGO / APTES- LAPS 芯片，(D)为 GPC3-Apt /AuNPs /PEI-rGO /APTES - LAPS 芯片，( E) 为GPC3 / GPC3-Apt / AuNPs / PEI-rGO / APTES- LAPS 芯片

图4 一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

图1是一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的原理图。通过简单混合法合成了AuNPs/PEI-rGO 纳米复合材料。采用 NaOH 溶液洗涤LAPS 芯片工作面，用氨基硅烷化试剂（APTES）修饰LAPS 芯片，以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）活化修饰的LAPS 芯片，在活化的LAPS 芯片表面依次滴加 AuNPs/PEI-rGO 溶液和 GPC3-Apt 溶液，形成了 LAPS芯片敏感单元；而后在 LAPS 芯片敏感单元上滴加 GPC3蛋白的标准溶液，形成 LAPS 的测试基片。最后将 LAPS 的测试基片放到 LAPS 的测试系统，在外加偏置电压作用下，GPC3蛋白与 GPC3-Apt 的特异性结合会导致敏感单元表面的电势改变，（I-V）曲线产生相应的偏移反应了 GPC3 浓度的变化，由此建立了基于 LAPS 系统检测 GPC3 的生物传感方法。同时 AuNPs/PEI-rGO 具有优异导电性和大比表面积，增加 GPC3-Ap的负载量从而提高了检测灵敏度。开发了一种可靠，简单的检测 GPC3蛋白的方法。

具体实施步骤如下：

1.AuNPs/PEI-rGO 复合材料的制备

（1）纳米金（AuNPs）的制备：首先，取 50mL 的 0.01%的氯金酸溶液将其放入圆底烧瓶中，搅拌直至沸腾。然后称量 2 mL 1%柠檬酸钠溶液。缓缓加入沸腾了的氯金酸溶液中，溶液继续维持沸腾状态，搅拌后，溶液的颜色从无色变蓝色再变为酒红色，最终冷却到室温。AuNPs溶液储存在4℃冰箱里面。

（2）PEI-rGO 的制备：以氧化石墨烯（GO）为原料，利用抗坏血酸为还原剂，制得rGO 的稳定分散液（0.5 mg / mL，50 mL），其次与 PEI（3%，5mL）混合并回流加热在 135℃下约 3 小时。得到的黑色分散液使用超纯水洗涤 2 次，离心，最终产品在室内空气中干燥。

（3）AuNPs/PEI-rGO 的制备：通过简单的方法合成了 AuNPs/PEI-rGO。将 1mL的PEI-rGO 溶液和 100μL AuNPs 混合过夜。将得到的混合物离心。沉淀物最终分散在300μL蒸馏水中。

图2（A）显示 rGO 的黑色薄片状结构。图像（B）显示了 AuNPs 呈现出黑色球形颗粒结构，图像（C）显示了黑色球形颗粒与片状薄膜良好的结合，表示 AuNPs/PEI-rGO 复合纳米材料成功整合。

2.LAPS 芯片敏感单元的构建

（1）首先将硅片放置在溶液（H₂O₂ 和浓H₂SO₄ 体积比 3:7）中浸泡 10min,然后将硅片依次置于乙醇、丙酮和纯水中，于超声清洗机中超声清洗 5 min，最后静置 30min 后用纯水清洗干净。

（2）在芯片工作面滴加 5 μL NaOH 溶液（1.0 mol/L），30 min 后清洗干净，其次使得 LAPS 芯片表面被 APTES 硅烷化，表面以-NH₂ 基团终止，得到氨基硅烷化 LAPS芯片(APTES-LAPS 芯片)，在 4℃冰箱里过夜（12 h 以上），用纯水清洗三次。

（3）将APTES-LAPS 芯片滴加5μL EDC/NHS溶液（10 mmol/L），活化30 min后，继续滴加 5 μL AuNPs/PEI-rGO 溶液，在恒温孵育箱中（25℃）中孵育 6h 之后清洗干净，得到AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS 芯片。

（4）在上述芯片上滴加 5 μL GPC3-Apt（序列号

5'-TAACGCTGACCTTAGCTGCATGGCTTTACATGTTCCA-3'）溶液，在25℃孵育箱中孵育3h后用缓冲液清洗晾干备用，得到GPC3-Apt/AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS 芯片敏感单元。

图3为 LAPS芯片各个阶段的扫描电镜（SEM）图。其中，图 A为没有任何修饰物的裸芯片SEM图，可以看出面比较光滑。图 B是APTES-LAPS芯片的SEM图，在面明显覆盖了一层颗粒状的物质，这表示 -NH₂基团成功吸附在芯片表面。图 C为 AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS芯片的 SEM图，在颗粒状物质的间隙间隙可以明显看到一些层rGO，这表明 AuNPs/PEI-rGO已经固定在APTES芯片上。图 D为 GPC3-Apt/AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS芯片的 SEM图，相比较于图 C，芯片表面的修饰物质变得厚了很多，这是由于GPC3-Apt为一种无序的单链DNA。

3.GPC3工作曲线的绘制

（1）在步骤2构建的LAPS 芯片敏感单元界面滴加5μL GPC3标准溶液，形成LAPS 测试基片，恒温孵育箱（25℃）孵育中孵育 1h，利用 PBS 缓冲液做电解质溶液，记录 LAPS 系统中I-V 曲线的变化实现对 GPC3 的检测。图3 E为 GPC3/GPC3-Apt/AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS芯片的 SEM图。对比图 3D,有一层新的片状物质在芯片表面覆盖着，这是由于 GPC3-Apt与 GPC3发生特异性结合覆盖于芯片表面，形成了LAPS 测试基片。

（2）将上述的LAPS 测试基片浸入到pH值为5.7的PBS缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，LAPS 测试基片上 GPC3与 GPC3-Apt 的特异性结合导致敏感单元表面的电势的改变，（I-V）曲线产生相应的偏移。该偏移量与 GPC3 浓度在 0.1-100μg/mL 表现出良好的线性关系（图4），Y(mV)= 1.33638X(μg/mL)+ 69.54818（Y 为电压偏移量，X 为 GPC3 的浓度），相关系数为 0.98998。最低检测限为 0.04μg/mL，灵敏度为 1.33638mV/μg/mL。

4.实际样本中GPC3的检测

为了验证 LAPS 检测 GPC3 蛋白在实际样本检测中的应用，通过加标法在最佳条件下检测人血清样品中的GPC3。三种不同浓度(40 µg/mL，60µg/mL，100 µg/mL)的GPC3标准液，分别加入血清样品中进行测定。该血清中的 AFP 浓度为 6.38 ng/mL，结果记录在表1中，LAPS 传感器的回收率在 99.03%-119.32%之间，相对标准偏差在 1.05%-6.85%之间。这些结果表明，所开发的GPC3适配体传感器在医学诊断中有望具有良好的应用前景。

表1 实际血清样本中GPC3的检测结果

。

Claims

1.一种AuNPs/PEI-rGO复合材料的制备，其特征在于：包括如下步骤，

（1）取氯金酸溶液，加热至沸腾，将柠檬酸钠溶液缓缓加入，维持沸腾状态，搅拌，溶液的颜色从无色变蓝色再变为酒红色，冷却到室温；

（2）以氧化石墨烯为原料，利用抗坏血酸为还原剂，制得rGO的稳定分散液；与 PEI混合并回流加热，得到黑色分散液；用超纯水洗涤，离心，在室内空气中干燥；

（3）合成AuNPs/PEI-rGO复合材料

将PEI-rGO和@AuNPs混合过夜，将得到的混合物离心，沉淀物最终分散在蒸馏水中。

2.一种用权利要求1所述AuNPs/PEI-rGO复合材料修饰芯片检测GPC3的方法，包含以下步骤：

步骤1：LAPS 芯片敏感单元的构建

（1）首先将硅片放置在由H₂O₂和浓H₂SO₄组成的溶液中浸泡，然后将硅片依次置于乙醇、丙酮和纯水中，于超声清洗机中超声清洗，最后静置后用纯水清洗干净；

（2）在干净的芯片工作面滴加NaOH溶液，清洗干净，其次使得LAPS芯片表面被APTES硅烷化，表面以-NH₂基团终止，得到氨基硅烷化LAPS芯片，用纯水清洗三次，得到APTES芯片；

（3）在APTES芯片表面继续滴加AuNPs/PEI-rGO溶液，在恒温孵育箱中孵育，清洗干净，提高导电性的同时可以增加GPC3-Apt的负载量，得到AuNPs/PEI-rGO/APTES芯片；

（4）在上述芯片AuNPs/PEI-rGO/APTES的基础上滴加GPC3-Apt溶液，在恒温孵育箱中孵育后用缓冲液清洗晾干备用，得到GPC3-APt/AuNPs/PEI-rGO/APTES LAPS芯片敏感单元；

步骤2：GPC3的工作曲线绘制

（1）在LAPS 芯片敏感单元滴加GPC3标准液形成 LAPS 的测试基片，浸入到PBS 缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，I-V曲线产生相应的偏移，记录LAPS系统的偏移电压值；

（2）根据LAPS系统的偏移电压值与GPC3浓度的关系，绘制工作曲线，并计算出该方法的最低检测限；

步骤4：待测样品中GPC3的检测

（1）用待测样品制备的LAPS芯片敏感单元浸入到PBS缓冲液里面，I-V曲线产生相应的偏移，记录LAPS系统的偏移电压值；

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1中所述H₂O₂和浓H₂SO₄体积比3:7。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1中所述用NaOH溶液浓度为1 mol/L。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1中所述AuNPs/PEI-rGO复合材料浓度为0.5 mg/mL。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1中所述GPC3-Apt浓度为10.0µmol/L。

7.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中所述PBS 缓冲液的pH值为5.7。

8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3中所述的偏置电压扫描范围-2V~2V。